Methodenartikel

Intravitale beeldvorming van fluorescerende eiwitexpressie bij muizen met een gesloten schedel traumatisch hersenletsel en schedelvenster met behulp van een microscoop met twee fotonen

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64701

⸱

21 april 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie demonstreert de toediening van een repetitief traumatisch hersenletsel aan muizen en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende intravitale beeldvorming van een tot expressie gebracht neuron EGFP met behulp van twee-fotonmicroscopie.

Samenvatting

Het doel van dit protocol is om te demonstreren hoe de expressie en lokalisatie van een eiwit van belang in specifieke celtypen van de hersenen van een dier longitudinaal kan worden gevisualiseerd, bij blootstelling aan exogene stimuli. Hier wordt de toediening van een traumatisch hersenletsel (TBI) met gesloten schedel en gelijktijdige implantatie van een schedelvenster voor daaropvolgende longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen getoond. Muizen worden intracraniaal geïnjecteerd met een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een neuronale specifieke promotor. Na 2 tot 4 weken worden de muizen onderworpen aan een repetitieve TBI met behulp van een gewichtsdruppelapparaat boven de AAV-injectielocatie. Binnen dezelfde chirurgische sessie worden de muizen geïmplanteerd met een metalen hoofdpost en vervolgens een glazen schedelvenster over de TBI-impactplaats. De expressie en cellulaire lokalisatie van EGFP wordt onderzocht met behulp van een microscoop met twee fotonen in hetzelfde hersengebied dat in de loop van maanden aan trauma is blootgesteld.

Inleiding

Traumatisch hersenletsel (TBI), dat het gevolg kan zijn van sportblessures, botsingen met voertuigen en militaire gevechten, is een wereldwijd gezondheidsprobleem. TBI kan leiden tot fysiologische, cognitieve en gedragsstoornissen en levenslange invaliditeit of mortaliteit 1,2. De ernst van TBI kan worden geclassificeerd als mild, matig en ernstig, waarbij de overgrote meerderheid milde TBI is (75%-90%)3. Het wordt steeds meer erkend dat TBI, met name herhaalde voorvallen van TBI, neuronale degeneratie kan bevorderen en als risicofactoren kan dienen voor verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer (AD), amyotrofische laterale sclerose (ALS), frontotemporale dementie (FTD) en chronische traumatische encefalopathie (CTE)4,5,6. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan TBI-geïnduceerde neurodegeneratie blijven echter onduidelijk en vormen dus een actief studiegebied. Om inzicht te krijgen in hoe neuronen reageren op en herstellen van TBI, wordt hierin een methode beschreven voor het monitoren van fluorescerend gelabelde eiwitten die van belang zijn, met name in neuronen, door middel van longitudinale intravitale beeldvorming bij muizen na TBI.

Daartoe laat deze studie zien hoe een chirurgische ingreep voor de toediening van gesloten schedel-TBI die vergelijkbaar is met wat eerder is gerapporteerd7,8 kan worden gecombineerd met een chirurgische ingreep voor implantatie van een schedelvenster voor stroomafwaartse intravitale beeldvorming, zoals beschreven door Goldey et al9. Het is met name niet haalbaar om eerst een schedelraam te implanteren en vervolgens een TBI in dezelfde regio uit te voeren, omdat de impact van de gewichtsval die de TBI induceert het venster waarschijnlijk zal beschadigen en onherstelbare schade aan de muis zal toebrengen. Daarom is dit protocol ontworpen om de TBI toe te dienen en vervolgens het schedelvenster direct boven de impactplaats te implanteren, allemaal binnen dezelfde chirurgische sessie. Een voordeel van het combineren van zowel de TBI als de schedelvensterimplantatie in één operatiesessie is een vermindering van het aantal keren dat een muis wordt geopereerd. Verder stelt het iemand in staat om de onmiddellijke respons (d.w.z. op de tijdschaal van uren) op TBI te volgen, in tegenstelling tot het implanteren van het venster bij een latere chirurgische sessie (d.w.z. de eerste beeldvorming die begint op een tijdschaal van dagen na TBI). Het craniale venster en het intravitale beeldvormingsplatform bieden ook voordelen ten opzichte van het monitoren van neuronale eiwitten met conventionele methoden, zoals immunokleuring van vaste weefsels. Er zijn bijvoorbeeld minder muizen nodig voor intravitale beeldvorming, omdat dezelfde muis op meerdere tijdstippen kan worden bestudeerd, in tegenstelling tot afzonderlijke cohorten muizen die nodig zijn voor discrete tijdstippen. Verder kunnen dezelfde neuronen in de loop van de tijd worden gevolgd, waardoor men specifieke biologische of pathologische gebeurtenissen binnen dezelfde cel kan volgen.

Als proof of concept wordt hier de neuronspecifieke expressie van versterkt groen fluorescerend eiwit (EGFP) onder de synapsinepromotor gedemonstreerd10. Deze benadering kan worden uitgebreid tot 1) verschillende hersenceltypen door gebruik te maken van andere celtypespecifieke promotors, zoals myeline-basisproteïne (MBP)-promotor voor oligodendrocyten en glia-fibrillair zuur eiwit (GFAP)-promotor voor astrocyten11, 2) verschillende doeleiwitten van belang door hun genen te fuseren met het EGFP-gen, en 3) meerdere eiwitten tot co-expressie te brengen die zijn gefuseerd met verschillende fluoroforen. Hier wordt EGFP verpakt en tot expressie gebracht via adeno-geassocieerd virus (AAV) toediening via een intracraniële injectie. Een TBI met gesloten schedel wordt toegediend met behulp van een apparaat voor gewichtsval, gevolgd door implantatie van een schedelvenster. Visualisatie van neuronale EGFP wordt bereikt door het craniale venster, met behulp van twee-fotonmicroscopie om EGFP-fluorescentie in vivo te detecteren. Met de twee-fotonlaser is het mogelijk om dieper in het corticale weefsel door te dringen met minimale fotoschade, waardoor herhaalde longitudinale beeldvorming van dezelfde corticale regio's binnen een individuele muis gedurende dagen en tot maanden mogelijk is12,13,14,15. Kortom, deze benadering van het combineren van een TBI-operatie met intravitale beeldvorming heeft tot doel het begrip van de moleculaire gebeurtenissen die bijdragen aan TBI-geïnduceerde ziektepathologie te vergroten16,17.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle diergerelateerde protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren, gepubliceerd door de commissie van de National Research Council (VS). De protocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Chan Medical School (UMMS) van de Universiteit van Massachusetts (vergunningsnummer 202100057). In het kort, zoals te zien is in het schema van de studie (figuur 1), krijgt het dier een virusinjectie, een TBI, een vensterimplantatie en vervolgens intravitale beeldvorming in een tijdsvolgorde.

OPMERKING: Commerciële termen zijn verwijderd. Raadpleeg de materiaaltabel voor de specifieke apparatuur die wordt gebruikt.

1. Intracraniële injectie van AAV met behulp van een stereotaxisch apparaat

  1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
    1. Gebruik een virale titer van 1 x 1013 virale genomen per milliliter (vg/ml). Syn1 verwijst naar Synapsin1, een neuronale specifieke promotor die beperkte virale expressie in neuronen mogelijk maakt. Het virus kan in eigen beheer worden voorbereid of worden uitbesteed.
  2. Voorbereiding op stereotactische injectiechirurgie voor toediening van AAV
    1. Autoclaaf gewone schaar, een chirurgische schuifmaat, chirurgische veerschaar, chirurgische pincet, muggenpincet, gaas, een applicator met wattenstaafje en een glazen microliterspuit.
    2. Ontsmet het operatiegebied met 75% ethanol. Breid het steriele chirurgische wegwerplaken uit om het operatiegebied op het stereotaxische platform te bedekken.
      OPMERKING: Om de lichaamstemperatuur van het dier tijdens de injectieoperatie op peil te houden, gebruikt u een feedbackgestuurd verwarmingsapparaat.
    3. Weeg en registreer het lichaamsgewicht van de muis.
    4. Open de klep van de zuurstoftank en stel de zuurstofstroom in op 1.5 l/min. Open het anesthesieapparaat en stel de waarde van het isofluraanniveau in op drie.
      NOTITIE: Het draaggas kan in deze stap kamerlucht of 100% zuurstof zijn.
    5. Plaats de muis in de inductiekamer en laat deze 5 minuten blijven om volledige anesthesie te bereiken.
    6. Zodra de muis volledig is verdoofd (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), haalt u de muis uit de inductiekamer en plaatst u de muiskop in het stereotaxische frame.
    7. Plaats de neuskegel van de anesthesieslang over de snuit van de muis.
    8. Handhaaf de anesthesie met 1,5% isofluraan, met draaggas met een stroomsnelheid van 1 l/min tot het einde van de operatie. Controleer regelmatig de ademhalingsfrequentie en knijp tijdens de operatie ten minste elke 15 minuten in de staart of teen om de juiste anesthesie te beoordelen. Pas de isofluraanconcentratie naar wens aan om de gewenste diepte van de anesthesie te behouden.
    9. Vul een injectiespuit van een microliter (10 μL) met de virusoplossing. Bevestig vervolgens de spuit op de bijpassende micro-injectorpomp van het stereotaxische apparaat.
  3. Injectie operatie
    1. Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) toe met behulp van een insulinespuit voor eenmalig gebruik en breng oogzalf aan op de ogen van de muis.
    2. Verwijder het haar van de hoofdhuid bovenop het hoofd door te knippen met een gewone schaar 1.
    3. Reinig de hoofdhuid met gaas en wattenstaafjes. Desinfecteer de huid eerst met 75% ethanol en daarna met betadine. Herhaal dit drie keer (d.w.z. ethanol gevolgd door betadine), waarbij u de laatste toepassing van betadine op de huid laat zitten.
    4. Controleer de anesthesiediepte opnieuw om er zeker van te zijn dat de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex). Maak een incisie van ~ 1 cm met een gewone schaar 2 langs de middellijn om de rechter pariëtale schedel bloot te leggen en verwijder het periosteum met een applicator met wattenstaafje.
    5. Markeer twee punten op de schedel met een markeerstift op deze coördinaten: punt A: 2,5 mm posterieur van de Bregma en 1 mm lateraal van de middellijn over de rechterhersenhelft; punt B: 2,5 mm posterieur van de Bregma en 2 mm lateraal van de middellijn over de rechterhersenhelft.
    6. Boor voorzichtig twee gaten door de schedel op de gemarkeerde coördinaten met behulp van een elektrische tandartsboor met een fijne EF4-hardmetalen boor.
      OPMERKING: Pas op dat u het hersenweefsel niet beschadigt.
    7. Pas het stereotaxische frame aan om de punt van de microliter-spuitnaald uit te lijnen met het schedelgat dat zich 1 mm lateraal van de middellijn bevindt.
    8. Laat de naald van de spuit zakken om het hersenoppervlak aan te raken en stel die locatie vervolgens in als het nulpunt (voor de z-as). Laat de punt van de naald in de hersenschors zakken tot een diepte van 0,5 mm en laat langzaam 1 μL van de virusoplossing trekken met een snelheid van 200 nL/min.
    9. Wacht 5 minuten nadat de virusoplossing volledig in het hersenweefsel is geïnjecteerd voordat u de naald terugtrekt om terugstroming van de oplossing te voorkomen.
    10. Trek de naald van de spuit langzaam terug. Herhaal de injectie op de andere plaats. Hecht de incisie met een steriele, niet-resorbeerbare chirurgische hechting (6-0 gauge).
    11. Dien cefazoline [500 mg/kg (333 mg/ml, meestal ~45 μL), intramusculair] en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) toe na de operatie terwijl het dier nog onder narcose is.
    12. Haal de muis uit het stereotaxische frame en stop met de anesthesie. Plaats de muis in een schone kooi boven een verwarmingsdeken en houd het dier in de gaten totdat het ambulant is (ongeveer 15 min). Breng vervolgens over naar de thuiskooi.
    13. Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) opnieuw toe na respectievelijk 8 uur, 16 uur en 24 uur na de eerste injectie met buprenorfine.
      OPMERKING: 2-4 weken na de virusinjectie krijgt de muis TBI en schedelvensterimplantatie op dezelfde plaats als de AAV-injectie.

2. Toediening van een repetitieve TBI-inductie

LET OP: De TBI-parameters zijn aangepast ten opzichte van eerdere rapporten7,8, waarin de TBI-impact eenmaal is geleverd. Het protocol past hier dezelfde parameter toe, behalve dat het totale impactgetal wordt verhoogd tot 10.

  1. TBI-apparatuur
    1. Gebruik een op maat gemaakt draagbaar apparaat voor de toediening van een TBI met gesloten schedel (Figuur 2A) aan de rechterkop van de muis, zoals aangegeven in Figuur 2B.
  2. Voorbereiding voor de operatie
    1. Apparatuur voor autoclaafchirurgie, waaronder een gewone schaar, een chirurgische schuifmaat, een chirurgische veerschaar, een chirurgische pincet, een muggenpincet, hoofdpaalstukken, gaas en applicators met wattenstaafjes.
    2. Weeg en registreer het lichaamsgewicht van de muis 2 uur voor de operatie. Om hersenoedeem tijdens de implantatie van het schedelvenster tot een minimum te beperken, injecteert u dexamethasonnatriumfosfaat in een dosis van 4,8 mg/kg [2 mg/ml, meestal ~70 μl (moet op twee plaatsen worden geïnjecteerd)] in de quadricepsspier met behulp van een insulinespuit. Na de injectie met dexamethason, maar voordat u met een TBI-operatie begint, bereidt u de glazen vensters voor zoals aangegeven in stap 3.1 voor later gebruik.
    3. Desinfecteer de chirurgische fase en TBI-apparatuur met 75% ethanol en breid het steriele chirurgische wegwerplaken uit om de operatiefase op het stereotaxische platform te bedekken. Schakel het verwarmingsapparaat en de temperatuurbewaking in en stel de doeltemperatuur in op 37 °C.
    4. Open de klep van de zuurstoftank en stel de zuurstofstroom in op 1.5 l/min. Open het anesthesieapparaat en stel de waarde van het isofluraanniveau in op drie.
      OPMERKING: 100% zuivere zuurstof kan het dier helpen de TBI-effecten te overleven.
    5. Plaats de muis in de inductiekamer en laat deze 5 minuten blijven om volledige anesthesie te bereiken.
    6. Zodra de muis volledig is verdoofd (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), haalt u de muis uit de inductiekamer en plaatst u de muiskop in het stereotaxische frame.
    7. Plaats de neuskegel van de anesthesieslang over de snuit van de muis.
    8. Handhaaf de anesthesie met 1,5% isofluraan gemengd met 100% zuivere zuurstof met een stroomsnelheid van 1 l/min tot het einde van de operatie. Controleer regelmatig de ademhalingsfrequentie en knijp tijdens de operatie ten minste elke 15 minuten in de staart of teen om de juiste anesthesie te beoordelen. Pas de isofluraanconcentratie indien nodig aan om de gewenste diepte van de anesthesie te behouden.
  3. TBI-operatie
    1. Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) toe met behulp van insulinespuiten voor eenmalig gebruik en breng oogzalf aan op de ogen van de muis.
    2. Verwijder het haar van de bovenkant van het hoofd door te knippen met een schaar 1 en vervolgens gedurende 1 minuut ontharingsmiddel aan te brengen.
      LET OP: Breng het ontharingsmiddel niet langer dan 3 minuten op de hoofdhuid aan, omdat het irriterend is voor de huid. Zorg ervoor dat er geen ontharingsmiddel op de ogen van de muis komt.
    3. Reinig de hoofdhuid door gaasjes en applicators met wattenstaafjes aan te brengen. Desinfecteer vervolgens de huid, eerst met 75% ethanol en daarna met betadine. Herhaal dit drie keer (d.w.z. ethanol gevolgd door betadine), waarbij u de laatste toepassing van betadine op de huid laat zitten.
    4. Controleer de anesthesiediepte opnieuw om er zeker van te zijn dat de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex). Tent de huid met een chirurgische pincet 3 en maak een incisie van 12-15 mm lang in de middellijn, ongeveer 3 mm achter de ogen.
    5. Snijd de huid over de linker- en rechterhersenhelft van de schedel met behulp van een veerschaar 2.
    6. Zodra de schedel zichtbaar is, verwijdert u het periosteum door zachtjes te wrijven met een steriele applicator met wattenstaafje en te spoelen met steriele zoutoplossing.
    7. Inspecteer visueel de toestand van de schedel om er zeker van te zijn dat deze intact is, met uitzondering van de twee kleine gaatjes, die zijn gemaakt voor de vorige virusinjectie-operatie.
    8. Droog het schedelgebied en markeer de TBI-inslagplaats op de volgende coördinaten: 2,5 mm posterieur van de Bregma en 2 mm lateraal van de sagittale hechting aan de rechterkant (Figuur 2B).
    9. Haal de muis snel uit het stereotaxische frame en plaats de kop op het bufferkussen onder het TBI-apparaat.
    10. Lijn de punt van het botslichaam uit met de gemarkeerde inslagplaats.
    11. Til de metalen kolom op door het vastgebonden nylon touw tot 15 cm boven de muizenkop te trekken en laat deze vervolgens los, zodat het gewicht vrij op de transducerstaaf kan vallen, die in contact staat met de schedeltop op de TBI-plaats. Raak de muiskop niet aan bij het toedienen van de TBI-impact.
    12. Beweeg de muis op de verwarmingsdeken en plaats deze op zijn rug terwijl u de ademhalingsstatus bewaakt.
    13. Zodra de muis zich van een rugligging naar een buikligging heeft gewikkeld, plaatst u de muis in de isofluraaninductiekamer gedurende ~5 minuten met 3% isofluraan gemengd met 100% zuivere zuurstof met een stroomsnelheid van 1.5 l/min.
    14. Zodra de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), herhaalt u stap 2.3.9-2.3.14 om in totaal 10 schokken te bereiken.
      OPMERKING: In onze studie (gegevens nog niet gepubliceerd) zijn tien TBI-effecten gevonden die een robuust fenotype met een lage muizensterfte induceren. De parameters kunnen worden aangepast om een andere ernst van hersenletsel te bereiken door het aantal schokken en/of de hoogte van waaruit het gewicht wordt losgelaten te verhogen of te verlagen. Alle parameters zijn onder voorbehoud van goedkeuring door de lokale IACUC.
    15. Controleer de schedel onder een chirurgische microscoop en verwijder de muis uit het onderzoek als er een schedelbreuk is opgetreden.
    16. Volg voor een schijnoperatie dezelfde procedures als hierboven beschreven, inclusief plaatsing van het dier onder de impactor, maar zonder de TBI-effecten toe te dienen.
    17. Nadat de muis zichzelf na de 10e TBI-impact van rugligging naar buikligging heeft verplaatst, plaatst u de muis gedurende ~5 minuten in de isofluraaninductiekamer. Volg de stappen 2.2.6-2.2.8 om de muiskop op het stereotaxische frame te plaatsen voor de hieronder beschreven schedelraamimplantatie.

3. Implantatiechirurgie van het schedelvenster

OPMERKING: De onderstaande stappen voor het implanteren van schedelvensters zijn overgenomen van Goldey et al.9 en hun specificaties van de hoofdpost en de beeldvormingsput zijn hier toegepast.

  1. Voorbereiding van het raam
    OPMERKING: Voltooi de venstervoorbereiding in stap 2.2.2 voordat u met de TBI-operatie begint. Het raam is gemaakt van twee ronde glazen dekglaasjes (één met een diameter van 3 mm en één met een diameter van 5 mm, zoals aangegeven in figuur 2C) die met elkaar zijn verbonden door middel van transparante optische lijm, zoals hieronder beschreven.
    1. Ontsmet de glazen dekglaasjes door ze gedurende 15 minuten onder te dompelen in 75% ethanol. Haal de glazen dekglaasjes uit de ethanol en laat ze ~10 minuten drogen op een steriel oppervlak (d.w.z. het deksel van een steriele plaat met 24 putjes).
    2. Vul een insulinespuit met transparante optische lijm en vermijd luchtbelvorming. Breng onder microscoop 1 (Tabel met materialen) bij een vergroting van 0,67x een kleine druppel (~1 μL) optische lijm aan in het midden van het dekglaasje van 5 mm. Plaats vervolgens onmiddellijk het dekglaasje van 3 mm erop en centreer het met het dekglaasje van 5 mm.
    3. Oefen voorzichtig druk uit met een fijne pincet om de lijm gelijkmatig te verdelen. Gooi de glazen ruit weg als er zich een luchtbel of muur vormt rond het 3 mm dekglaasje.
    4. Om de lijm uit te harden, plaatst u de dekglaasjes gedurende 150 s in een UV-doos met een vermogen van 20 x 100 μJ/cm2. Controleer of de twee dekglaasjes goed vastzitten door met een pincet 4 voorzichtig tegen de zijkant van de 3 mm-slip te duwen. Als het dekglaasje beweegt, plaats het dan nog eens 60 seconden terug in de UV-box. Bewaar de glazen ruit in een steriele plaat met 24 putjes voor later gebruik.
  2. Ruw het schedeloppervlak.
    OPMERKING: Voer vanaf hier alle stappen in sectie 3 uit onder een chirurgische microscoop. Begin met 10x en pas aan de gewenste vergroting aan.
    1. Boor voorzichtig en langzaam in het oppervlak van de schedel met een FG4-hardmetalen bit met een lage rotorsnelheid (d.w.z. het uitgangsnummer ingesteld op ~1-2) om het resterende periosteum te verwijderen en een ruw schedeloppervlak te creëren, zodat het tandcement stevig met de schedel bindt. Als alternatief kan hier ook een scalpel worden gebruikt in plaats van een boormachine.
    2. Gebruik zoutoplossing om botstof van het schedeloppervlak te spoelen en te verwijderen.
  3. Scheid de spieren.
    OPMERKING: Spierscheiding dient om het oppervlak van het blootgestelde schedelbot te vergroten dat zal dienen als contactpunt voor het tandcement, waardoor de structurele integriteit van het implantaat wordt gegarandeerd. Deze spierscheidingsstap legt meestal ~3 mm van de temporale schedelplaat bloot.
    1. Op ongeveer 5 mm achter het oog, waar de hechting die de pariëtale en temporale schedel verbindt, zich bevindt, brengt u voorzichtig de gesloten fijne uiteinden (#5/45 pincet) in om de laterale spieren van de schedel te scheiden, en beweegt u de gesloten uiteinden voorzichtig in de achterste richting tot aan de lambdoïde hechting.
    2. Scheid de laterale spieren aan de kant waar implantatie van het schedelvenster zal plaatsvinden.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de spieren niet te dicht bij het oog scheidt, om te voorkomen dat u de oogslagader verwondt; anders kunnen ernstige en aanhoudende bloedingen optreden. Scheid de spieren niet van het achterhoofdsbeen, omdat de muis deze spieren nodig heeft om zijn hoofd op te heffen.
    3. Spoel het vuil van de operatieplaats weg met zoutoplossing en droog het gebied af met gaas. Gelschuim kan op de operatieplaats worden aangebracht om het bloeden te stoppen.
  4. Implanteer de hoofdpost.
    1. Gebruik een op maat gemaakte titanium koppaal (Figuur 2D), beschreven in een eerdere publicatie9, om de muizenkop stevig vast te zetten tijdens het uitvoeren van de craniotomie-operatie en voor daaropvolgende beeldvorming met twee fotonen.
    2. Gebruik een markeerstift en een chirurgische schuifmaat om de omtrek van de craniotomie op de schone en droge schedel aan de rechterkant te traceren. Het middelpunt van de getraceerde cirkel ligt 2,5 mm achter de Bregma en 1,5 mm van de sagittale hechting op de rechterhersenhelft. De diameter van de getraceerde cirkel is ongeveer 3,2-3,5 mm, iets groter dan het glazen dekglaasje van 3 mm. Zorg ervoor dat de craniotomiecirkel de virusinjectieplaatsen kan bedekken (de twee gaten die tijdens het injecteren van het virus zijn gemaakt, kunnen als referentie worden gebruikt) en de TBI-plaats.
    3. Maak de oorbalk los en draai het hoofd zodat het craniotomievlak perfect horizontaal is en draai de oorbalk vervolgens weer vast.
    4. Gebruik het houten stokje van een applicator met wattenstaafje om twee kleine druppels secondelijm aan te brengen aan de voor- en achterkant van de headpost.
    5. Plaats de titanium hoofdpost over het midden van de craniotomie en pas deze snel aan om binnen hetzelfde vlak te rusten als waar het schedelvenster zal worden geïmplanteerd. Oefen lichte druk uit totdat de secondelijm is opgedroogd; Dit duurt meestal ~30 s.
    6. Bereid tandheelkundig cement voor in een voorgekoelde keramische mengschaal (minstens 10 minuten in een vriezer van -20 °C): combineer 300 mg cementpoeder, zes druppels snelle basisvloeistof en een druppel katalysator en roer het mengsel tot het goed gemengd is (~15 keer).
      NOTITIE: Het cement moet pasteus zijn. Als het te dun is, roer er dan wat meer cementpoeder door. Als het te dik is, roer er dan druppel voor druppel de snelle basisvloeistof door tot een pasteuze consistentie is bereikt.
    7. Breng snel een ruime hoeveelheid tandheelkundig cementmengsel aan op de buitenomtrek van de getraceerde omtrek en bedek elk blootliggend botoppervlak. Bedek echter niet de plaats van de craniotomie. Wacht ~15 minuten om het tandcement te drogen en uit te harden voordat u verder gaat.
    8. Maak de oorstang los en bevestig de hoofdpen aan het metalen frame om ervoor te zorgen dat de kop stabiel staat voor nauwkeurig boren langs de gemarkeerde craniotomieomtrek. Als er cement op de craniotomieplaats zit, gebruik dan de FG4-carbide om te boren en te verwijderen.
  5. Craniotomie
    1. Gebruik een chirurgische schuifmaat om de diameter van de gemarkeerde cirkel te controleren, zoals gedefinieerd in stap 3.4.2. Pas indien nodig aan, zodat het schedelvenster precies in de craniotomie past.
    2. Gebruik een elektrische tandartsboor om de schedel langs de buitenkant van de gemarkeerde cirkel te etsen en te verdunnen, eerst met behulp van een FG4-hardmetalen bit (snelheid ingesteld op een output ~9-10). Dit creëert een "spoor" waarbinnen de schedel kan worden uitgedund.
      LET OP: Om hitteletsel tot een minimum te beperken en een gladde baan te krijgen, moet u de boor blijven bewegen. Boor niet langer dan 2 s op dezelfde plaats.
    3. Stop regelmatig met boren en irrigeer het hele gebied met steriele zoutoplossing, om de opwarming van de boor te verminderen en het botstof weg te spoelen.
    4. Ga door met het uitdunnen van de schedel met een hardmetalen bit FG1/4, zoals beschreven in stap 3.5.2, totdat de schedel flinterdun en transparant is.
      NOTITIE: Het gebruik van twee handen om de boor vast te houden, kan het gemakkelijker maken om de boor te besturen en te voorkomen dat de boor in de hersenen wordt gestoken.
    5. Voltooi het uitdunnen van de schedel met een EF4-hardmetalen bit. Wanneer er een scheur ontstaat tussen de botflap en het omringende schedelbot, komt er soms cerebrale spinale vloeistof (CSF) vrij, wat aangeeft dat de schedel volledig is doorboord.
    6. Ga door met het uitdunnen en boren door de rest van de schedel langs het spoor. Vermijd het boren door het punt waar een duidelijk vaatstelsel onder de schedel doorkruist om bloedingen te voorkomen.
    7. Steek een fijne pincetpunt (pincet 1) ~0,5 mm door de gebarsten plaats en til de botflap voorzichtig omhoog zonder de onderliggende hersenen in te deuken.
    8. Nadat de botflap is verwijderd, irrigeert u het craniotomiegebied met zoutoplossing. Het hersenoppervlak kan 1-2 mm hoger zijn dan de craniotomierand.
    9. Bedek vanaf deze stap altijd de blootgestelde hersenen met zoutoplossing om het hersenweefsel te beschermen.
    10. Bloedingen kunnen optreden bij het optillen van de botflap op de oorspronkelijke AAV-injectieplaatsen als gevolg van de weefseladhesie en vasculatuurgroei na de injectieoperatie. Als dit gebeurt, druk dan zachtjes op de plek met een droge applicator met wattenstaafje gedurende ~2 minuten (of langer als dat nodig is). Gelschuim kan worden gebruikt om het bloeden te stoppen. Gebruik geen chemicaliën of een verwarmingstang om het bloeden te stoppen, omdat dit letsel kan veroorzaken.
    11. Gebruik de pincet 1 om de zichtbare spinachtige materie voorzichtig te verwijderen.
  6. Implantaat glazen venster
    1. Gebruik de chirurgische pincet 2 om het steriele glazen venster op te pakken, met het glazen dekglaasje van 3 mm naar beneden gericht. Plaats en pas het glazen venster aan boven de craniotomieplaats om ervoor te zorgen dat het venster goed aansluit op de craniotomierand. Bovenop zit het glazen dekglaasje van 5 mm.
    2. Bereid tandheelkundig cement als volgt voor: combineer 100 mg cementpoeder, twee druppels snelle basisvloeistof en een druppel katalysator. Roer het mengsel tot alles goed gemengd is (~15 keer). Wacht ~6 min tot het cement pasteus en dik wordt. Als het cement te dun is, kan het in stap 3.6.4 in de ruimte onder het raam sijpelen en het raam verduisteren.
    3. Terwijl u wacht tot het cement pasteus en dik wordt, oefent u voldoende druk uit op het raam via een stereotaxische manipulator, om te controleren of de schedel veilig en stevig contact kan maken met het glazen raam. Zorg ervoor dat de tandcementvloeistof in stap 3.6.4 de ruimte onder het glas niet bereikt en zo het raam aan het zicht onttrekt.
    4. Gebruik een verstelbare precisie-applicatorborstel om een kleine hoeveelheid cement langs de raamrand toe te voegen om het glazen raam met de schedel af te dichten. Wacht ~10 minuten om het cement volledig te laten drogen en laat dan voorzichtig de manipulator boven het raam los en verwijder deze. Vanaf deze stap duurt het ~4 uur om de 10 TBI-inslagen te voltooien en de hoofdstijl en het schedelvenster te implanteren.
    5. Snijd het tandcement bij met behulp van de tandartsboor met een FG4-hardmetalen bit als er overtollig cement op het raam zit.
      NOTITIE: Overmatig cement rond het raam kan voorkomen dat de objectieflenzen met twee fotonen het raamoppervlak naderen.
  7. Implanteren van de beeldvormingsput
    OPMERKING: Een beeldvormingsput (Figuur 2D) is een rubberen ring met een buitendiameter van ~1,6 cm, die overeenkomt met het bovenoppervlak van de hoofdpost en water boven het schedelvenster vasthoudt voor beeldvorming met twee fotonen.
    1. Nadat de raamimplantatie is voltooid, boort u het tandheelkundig cementpuin op het bovenoppervlak van de hoofdpaal weg en reinigt u het gebied met nat chirurgisch gaas. Laat het gebied ~3 minuten drogen.
    2. Gebruik een applicator met wattenstaafje om een kleine hoeveelheid secondelijm te dopen en plak deze op het bovenoppervlak van de hoofdpost. Plaats de rubberen ring snel op de headpost. Oefen gedurende ~2 minuten gemiddelde druk uit op de rubberen ring om nauw contact met de headpost te garanderen. Gebruik spaarzaam secondelijm, anders kan het zich aan het glazen venster hechten en de beeldvorming van twee fotonen verdoezelen.
  8. Pijnstillende en antibioticatoediening
    1. Onmiddellijk na het implanteren van de beeldvormingsput, maar voordat u stopt met isofluraan, dient u cefazoline [500 mg/kg (333 mg/ml, meestal ~45 μL), intramusculair] en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) toe met behulp van insulinespuiten voor eenmalig gebruik.
    2. Stop na toediening van het geneesmiddel de anesthesie, laat de muis los van het stereotaxische frame en breng de muis terug naar zijn thuiskooi, die zich boven een verwarmingsdeken bevindt.
    3. Houd de muis gedurende ~15 minuten nauwlettend in de gaten totdat deze ambulant is.
      OPMERKING: Huisvest de muizen individueel, omdat ze de rubberen beeldvorming van andere muizen goed kunnen bijten. Zorg voor voedsel en watergel in de buurt van de muis in de kooi voor toegang ad libitum.
    4. Dien buprenorfine (1 mg/kg, subcutaan) en meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) opnieuw toe om de 8 uur na de vorige dosis tot 48 uur na de implantatieoperatie van het schedelvenster.

4. Intravitale beeldvorming met twee fotonen

  1. Gebruik microscoop 2 (Materiaaltabel), uitgerust met een afstembare coherente multifotonenlaser en een objectief met een vergroting van 20x (NA 1.0; onderdompeling in water), voor intravitale beeldvorming18. Het filter dat wordt gebruikt voor het EGFP-signaal is "BP 500-550".
  2. Bereid de craniale venstermuis voor op intravitale beeldvorming.
    1. Voer vanaf de dag van de operatie (aangeduid als dag 0) beeldvorming met twee fotonen uit op ontworpen tijdstippen na TBI. Plaats de craniale venstermuis in de anesthesie-inductiekamer en dien gedurende 5 minuten 3% isofluraan gemengd met draaggas toe met een stroomsnelheid van 1.5 l/min.
      NOTITIE: Het draaggas kan kamerlucht of 100% zuurstof zijn.
    2. Zodra de muis volledig verdoofd is (d.w.z. langzame maar gestage ademhalingsfrequenties met ongeveer één cyclus per 2 s, in combinatie met de afwezigheid van een staartknijpreflex), haalt u de muis uit de inductiekamer en klemt u de hoofdpaal snel vast aan een beugel. Laat de romp van de muis op een ronde plastic plaat (19 cm diameter) liggen die is voorzien van de beugel.
      OPMERKING: Er werd een handwarm kussentje onder de romp van de muis geplaatst om warmteondersteuning te bieden tijdens intravitale beeldvorming.
    3. Breng oogzalf aan op de ogen van de muis en plaats de neuskegel van de anesthesieslang over de snuit van de muis. Handhaaf de anesthesie door 1,5% isofluraan te gebruiken met draaggas met een debiet van 1 l/min.
    4. Controleer regelmatig de ademhalingsfrequentie en knijp tijdens de beeldvorming ten minste elke 15 minuten in de staart of teen om de juiste anesthesie te beoordelen. Pas de isofluraanconcentratie indien nodig aan om de gewenste diepte van de anesthesie te behouden.
    5. Lijn de muiskop uit om ervoor te zorgen dat het schedelvenster zich direct onder de objectieflens met twee fotonen bevindt. Voeg wat water toe aan de beeldvormingsput boven het schedelvenster. Laat het objectief zakken zodat het in het water wordt ondergedompeld.
  3. Intravitale beeldvorming van intracraniële venstermuizen
    1. Zet de kwiklamp van de scoop aan. Bekijk eerst de hersenen met epifluorescentie door het oog.
      OPMERKING: Het vaatstelsel ziet er zwart uit. Selecteer een gebied waar het venster vrij is. Schakel de epifluorescentie uit, stel de lasergolflengte in op 860 nm voor het EGFP-signaal en pas de laserinstelling aan voor een optimaal (d.w.z. helder maar niet verzadigd) signaal.
    2. Stel de scanmodus in op Frame en de lijnstap op 1. Stel het gemiddelde getal in op 16, de bitdiepte op 8-bits, de modus op Line en de methode op Mean.
    3. Gebruik het vasculatuurpatroon als een "referentiekaart" om hetzelfde hersengebied in beeld te brengen voor latere longitudinale beeldvorming. Stel het oppervlakkige niveau voor (laag I, minder dan 100 μm van het meningeale oppervlak) voor drie vlakken waar de corticale vasculatuur domineert door middel van een z-stack-modus, met een interplane-interval van 10 μm, zoals aangegeven in figuur 3A.
    4. Beeld zes vlakken op diep niveau (laag IV en V, ~400 μm dieper dan het oppervlakkige niveau), door een z-stack-modus zoals aangegeven in figuur 3A, met een interplane-interval van 10 μm en een scansnelheid van 8.
    5. Na het beëindigen van de beeldvorming (~20 min per muis), stopt u met de anesthesie, laat u de muis los van de frames en plaatst u hem terug in zijn thuiskooi die zich boven een verwarmingsdeken bevindt. Houd de muis achtereenvolgens in de gaten totdat deze ambulant is, wat meestal ~7 minuten duurt.
    6. Longitudinaal beeld van de muis op dag 0, 1 week en 4 maanden na de TBI-operatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als proof of concept voor dit protocol werden virale deeltjes die AAV-Syn1-EGFP tot expressie brengen, geïnjecteerd in de hersenschors van mannelijke TDP-43 Q331K/Q331K-muizen (C57BL/6J-achtergrond)19 op de leeftijd van 3 maanden. Opgemerkt wordt dat wildtype C57BL/6J-dieren ook kunnen worden gebruikt, maar deze studie werd uitgevoerd bij TDP-43 Q331K/Q331K-muizen omdat het laboratorium zich richt op onderzoek naar neurodegeneratieve ziekten. 4 weken na de AAV-injectie werd e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In deze studie werden AAV-injectie, TBI-toediening en een hoofdpost met schedelvensterimplantatie gecombineerd voor longitudinale beeldvormingsanalyse van EGFP-gelabelde neuronen in de hersenschors van muizen (lagen IV en V) om de effecten van TBI op corticale neuronen te observeren. Deze studie merkt op dat de TBI-locatie die hier is gekozen, boven de hippocampus, een relatief vlak en breed oppervlak biedt voor implantatie van het schedelvenster. Omgekeerd is de schedel relatief smal aan de voorkant van deze plaats, en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Er worden geen belangenconflicten gemeld.

Dankbetuigingen

We danken Dr. Miguel Sena-Esteves van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het schenken van het AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP-virus, en Debra Cameron van de Chan Medical School van de Universiteit van Massachusetts voor het tekenen van de schedelschets van de muizen. We danken ook de huidige en voormalige leden van de Bosco-, Schafer- en Henninger-labs voor hun suggesties en steun. Dit werk werd gefinancierd door het ministerie van Defensie (W81XWH202071/PRARP) aan DAB, DS en NH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adjustable Precision Applicator BrushesParkellS379
BD insulin syringeBDNDC/HRI#08290-3284-385/16" x 31G
BetadinePurdueNDC67618-151-17inclusief 7,5% povidone jodium
BuprenorfinePAR PharmaceuticalNDC 42023-179-05
CefazolineHIKMA PharmaceuticalNDC 0143-9924-90
Keramische mengkomParkellSKU: S387Voor de bereiding van tandheelkundig cement
WattenstaafjesZOROcatalogusnr.: G9531702
KatalysatorParkellS371volledige naam: "C" Universal TBB Katalysator
Tandheelkundig cementpoederParkellS396Radiopaque L-Poeder voor C&B Metabond
TandboorForedomH.MH-130
TandboorregelaarForedomHP4-310
DexamethasonPhoenixNDC 57319-519-05
EF4 carbide bitMicrocopyLotnr. C150113Hoofd Dia/Lgth/mm 1,0/4,2
EthonalFisher Scientific04355223EA75%
FG1/4 carbide bitMicrocopyLotnr. C150413Hoofd Dia/Lgth/mm 0,5/0,4
FG4 carbide bitMicrocopyLotnr. C150309Hoofd Dia/Lgth/mm 1,4/1,1
HeadpostN/AN/AOp maat gemaakt
VerwarmingsapparaatCWETC-1000 Muisuitgerust met het stereotactische instrument en kan worden gebruikt tijdens het uitvoeren van chirurgie
VerwarmingsdekenCVS apotheekE12107extra verwarmingsapparaat en kan worden gebruikt na de chirurgie
IsofluraanPivetalNDC 46066-755-03
Isofluraan inductiekamerVetequip89012-688inductiekamer voor kort
Isofluraan verdampingsmachineVetequip911103
Isofluraan verdampingsmachine houderVetequip901801
Leica chirurgische microscoopLeicaLEICA 10450243
OogzalfPicetalNDC 46066-753-55
MarkerstiftDelascoSMP-BK
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10
Micro-injectiepomp en zijn controllerWorld Precision Instrumentsmicro4 en UMP3
MicroliterspuitHamiltonHamilton 800141701 RN, 10 μL maat voor spuit en 32 maat voor naald, 2 inch, puntstijl 3
MuggentangCAROLINAArtikelnr. :625314Roestvrij staal, gebogen, 5 inch
OntharingsmiddelMcKesson CorporationN/ANair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion
Microscoop 1NikonSMZ745Nikon microscoop voor de bereiding van schedelvensters
Microscoop 2ZeissLSM 7 MPtwee-foton microscoop
MultifotonlaserCoherentChameleon Ultra II, Model: MRU X1, VERDI 18Wlaser voor twee-foton microscopie
Niet-resorbeerbare chirurgische hechtingHarvard Apparatuscatalogusnr. 59-68606-0, met ronde naald
Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA 81
No-Snag Needle HolderCAROLINAArtikelnr. : 567912
Quick base vloeistofParkellS398"B" Quick Base Voor C&B Metabond
Reguliere schaar 1Eurostateurostat es5-300
Reguliere schaar 2World Precision InstrumentsNr. 501759-G
Ronde dekglazen 1Warner instrumentsCS-5R Cat# 64-0700voor 5 mm diameter
Ronde dekglazen 2Warner instrumentsCS-3R Cat# 64-0720voor 3 mm diameter
RubberringenOrings-OnlineArtikelnr. OO-014-70-50O-ringen
ZoutoplossingBioworldL19102411PR
Federaal schaar 1World Precision InstrumentsNr. 91500-09rechte punt
Federaal schaar 2World Precision InstrumentsNr. 91501-09gebogen punt
Stereotactisch platformKOPFModel 900LS
SuperlijmHenkelArtikelnr. : 1647358
Chirurgische calliperWorld Precision InstrumentsNr. 501200
Chirurgische pincet 1ELECTRON MICROSCOPY SCIENCESCatlog# 0508-5/45-POstijl 5/45, gebogen
Chirurgische pincet 2ELECTRON MICROSCOPY SCIENCEScatlog# 0103-5-POstijl 5, recht
Chirurgische pincet 3ELECTRON MICROSCOPY SCIENCEScatlog# 72912
Chirurgische pincet 4ELECTRON MICROSCOPY SCIENCESCatlog# 0508-5/45-POstijl 5/45, gebogen
Chirurgische gaasZOROcatalogusnr .: G0593801
Chirurgische lampLeicaLeica KL300 LED
UV boxSpectrolinkerXL-1000ook wel UV crosslinker genoemd
VaporguardVetequip931401
Vetbond Tissue Adhesive3M Animal CareArtikelnr.: 014006

Referenties

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646(2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060(2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742(2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601(2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Twee fotonmicroscopieEGFP expressieadeno geassocieerd virusneuronale promotorlongitudinale hersenbeeldvorminghersenchirurgie bij muizen

Gerelateerde artikelen