Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In Vivo Genafgifte in muisepitheelcellen via intraductale injectie van zmammas

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64718

⸱

10 februari 2023

 , 
1Lester & Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft intraductale injectie van virale vectoren via de speen om genen van belang af te leveren in de borstepitheelcellen.

Samenvatting

Muizenborstklieren bestaan uit ductale bomen, die worden omzoomd door epitheelcellen en één opening hebben aan de punt van elke tepel. De epitheelcellen spelen een belangrijke rol in de borstklierfunctie en zijn de oorsprong van de meeste borsttumoren. Het introduceren van interessante genen in epitheelcellen van muizen is een cruciale stap bij het evalueren van de genfunctie in epitheelcellen en het genereren van tumormodellen voor muizen. Dit doel kan worden bereikt door de intraductale injectie van een virale vector die de genen van belang in de ductale boom van de muisborst draagt. Het geïnjecteerde virus infecteert vervolgens borstepitheelcellen en brengt de genen van belang binnen. De virale vector kan lentiviraal, retroviraal, adenoviraal of adenovirus-geassocieerd viraal (AAV) zijn. Deze studie toont aan hoe een interessant gen wordt afgeleverd in borstepitheelcellen via intraductale injectie van een virale vector door de borst van de muis. Een lentivirus dat GFP draagt, wordt gebruikt om stabiele expressie van een afgeleverd gen aan te tonen, en een retrovirus dat Erbb2 (HER2/Neu) draagt, wordt gebruikt om oncogen-geïnduceerde atypische hyperplastische laesies en borsttumoren aan te tonen.

Inleiding

Epitheelcellen van borstklieren spelen een belangrijke rol in de functie van deze klieren en zijn de belangrijkste cel van oorsprong van borstkanker. Studies van borstklierbiologie en tumorigenese vereisen vaak de levering van gen (en) van belang in deze cellen. Elke borstklier van de muis bestaat uit een ductale boom omzoomd door epitheelcellen met een enkele opening aan de punt van de tepel. Deze structuur maakt de borstepitheelcellen gemakkelijk toegankelijk voor virale vectoren, die via intraductale injectie1 in het lumen van een ductale boom kunnen worden afgeleverd.

De techniek van intraductale injectie bij de borst werd oorspronkelijk gebruikt voor veel grotere dieren zoals geiten, konijnen en ratten1. Voor een veel kleiner dier zoals muizen heeft intraductale injectie veel delicate hulpmiddelen en meer praktijken van de operators nodig. Er zijn twee benaderingen voor intraductale injectie bij muizen. Een daarvan is up-the-tea-speeninjectie1. Een andere is de directe injectie van het primaire kanaal van # 3 of # 4 borstklier na chirurgische blootstelling1. Omdat de eerste niet-invasief en sneller is zodra de operator goed is getraind, wordt deze techniek vaker gebruikt en zal in dit artikel in detail worden beschreven.

In vergelijking met de veelgebruikte traditionele transgene muismodellen, waarbij het gen van belang wordt geïntroduceerd in het stadium van bevruchte eieren via micro-injectie 2,3,4, heeft genafgifte via de intraductale virusinjectiemethode veel voordelen, waaronder: (1) het vermijdt het tijdrovende proces van het maken van een transgene muislijn voor elk gen van belang; (2) het voorkomt mogelijke aantasting van de normale ontwikkeling van de borstklieren als gevolg van het gen van belang; (3) het introduceert het gen van belang op elk gewenst moment na de geboorte; (4) het kan gemakkelijk meer dan één interessant gen co-introduceren; (5) het bootst het natuurlijke tumorogene proces beter na omdat de geïnfecteerde en dus oncogendragende cellen worden omringd door normale cellen; en (6) in combinatie met de TVA-technologie (tumorvirus A, een eiwit op het oppervlak van vogelcellen en de receptor voor retrovirus RCAS-vector)5, kan het gen van belang in een specifieke celpopulatie worden geïntroduceerd om de celoorsprong van tumorigenese te bestuderen en om cellijntraceringstests uit te voeren in de borstklieren 6,7,8, 9.

Alle vectoren afgeleid van retrovirus10, lentivirus11,12, adenovirus13 en adenovirus-geassocieerd virus (AAV)14 mogen worden gebruikt voor intraductale toediening van genetisch materiaal. Retrovirus- en lentivirusvectoren integreren permanent in het gastheergenoom; Zo introduceren ze genen van belang stabiel in borstepitheelcellen. Terwijl lentivirus kan integreren in het genoom van elke cel die het tegenkomt15, heeft de efficiënte genomische integratie van retrovirus de proliferatie van de doelcellennodig 16. De adenovirale en AAV-vectoren integreren niet in het genoom van geïnfecteerde cellen en brengen daarom slechts tijdelijk het gen van belang tot expressie17,18. Deze functie kan een voordeel zijn wanneer het gen van belang slechts voor een korte tijd tot expressie hoeft te worden gebracht, zoals Cre, voor het verwijderen van een gefloxeerd tumorsuppressorgen.

Lentivirus, adenovirus en AAV infecteren alle muizencellen die ze tegenkomen. Maar omdat luminaal epitheel grotendeels is geïsoleerd van de onderliggende basale laag, die verder wordt gescheiden van het stroma door het keldermembraan, beperkt intraductale injectie de infectie grotendeels tot luminale epitheelcellen, de primaire cel van oorsprong van borstkanker. Binnen deze luminale epitheellaag zijn er ook verschillende celsubtypen, waaronder stamcellen, voorlopercellen en verschillende groepen gedifferentieerde cellen. Om specifieke celsubgroepen binnen de luminale celpopulatie te infecteren, kan de TVA-technologie worden gebruikt, waarmee van aviaire leukosevirussenafgeleide RCAS-vectoren 5,10 of pseudogetypeerde lentivirale vectoren 11 selectief de cellen infecteren die TVA tot expressie brengen bij muizen die een tva-transgen dragen onder controle van een celtypespecifieke promotor, zoals een promotor die alleen actief is in stamcellen 6 of bepaalde voorlopercellen 6, 7 of alveolaire cellen8 of Wnt-route actieve cellen9.

Dit protocol presenteert de techniek van het introduceren van genen van belang in borstepitheelcellen door intraductale injectie van een virale vector. De detectie van expressie van de geïntroduceerde genen en de resulterende hyperplastische laesies en tumoren worden vervolgens aangetoond.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met muizen werden uitgevoerd in overeenstemming met het door de Institutional Animal Care and Use Committee goedgekeurde dierprotocol. Voor de huidige studie werden 9-12 weken oude FVB / N- of MMTV-tva vrouwelijke muizen gebruikt. De muizen werden commercieel of zelf verkregen (zie Materiaaltabel). De Lenti-EGFP (FUCGW) en RCAS-Erbb2 (Neu) virussen werden gebruikt. Virusvoorbereiding en titerbepaling werden uitgevoerd naar aanleiding van de eerder gepubliceerde rapporten10,12.

1. Bereiding van de spuit

  1. Snijd de metalen naafnaalden van 33 G (zie materiaaltabel) tot ongeveer 1 cm lang. Bewaar de naalden en de spuit van 50 μL in 70% alcohol na het autoclaveren.
  2. Haal spuiten en naalden uit de alcohol. Duw de resterende alcohol uit de spuit en naald. Demonteer de spuit voor het drogen aan de lucht op een autoclaaf absorberend bankkussen.
  3. Monteer de spuit na het drogen.

2. Virusvoorbereiding

  1. Haal zo nodig een of meerdere virale stambuisjes uit de -80 °C vriezer en ontdooi het virus op ijs.
    OPMERKING: Afhankelijk van het aantal cellen dat moet worden geïnfecteerd, moet het virus op dit moment mogelijk worden verdund tot de beoogde titers met behulp van 1x PBS.
  2. Voeg broomfenolblauw toe door de pipetpunt tot een diepte van 1 cm in het broomfenolblauwe poeder te dompelen (zie materiaaltabel). Breng vervolgens de bijgevoegde sporenhoeveelheid broomfenolblauw in de virussuspensie.
    OPMERKING: Voor de huidige studie is de virale voorraad meestal 200 μL per buis, dus de uiteindelijke kleurstofconcentratie is ongeveer 0,2% (0,2 μg / 100 μL). Broomfenolblauw moet gedurende 45 seconden worden gesteriliseerd met microgolfstraling met een hoog vermogen van 1250 W (zie materiaaltabel). Zorg ervoor dat u de hele procedure in een steriele omgeving uitvoert.
  3. Meng het broomfenolblauw met de virusoplossing door 10 keer op en neer te pipetteren.
  4. Leg het virus op ijs en breng de ijsemmer naar het vivarium.

3. Voorbereiding van dieren

  1. Verdoof een vrouwelijke muis door intraperitoneale injectie van 2 μL/g anestheticum (37,6 mg/ml ketamine, 1,92 mg/ml xylazine en 0,38 mg/ml acepromazine, zie Tabel met materialen). Controleer de diepte van de anesthesie met een teenknijper. Breng zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
    OPMERKING: De muis moet niet reageren op teenknijpen onder goede anesthesie. Isofluraan kan ook worden gebruikt om de muizen te verdoven.
  2. Leg de muis in rugligging op een warm kussen en bevestig alle vier de ledematen aan de bank met plakband.
  3. Identificeer één tepel (of meer) die moet worden geïnjecteerd (nummer 4 heeft de voorkeur voor het huidige onderzoek). Belicht het door het omliggende haar te trimmen met een schaar.
  4. Breng in drie rondes 70% alcohol en jodoforswabs aan op het tepelgebied om de tepel schoon te maken en bloot te leggen.

4. Intraductale injectie van virus

OPMERKING: Een vergrootlamp kan worden gebruikt om de tepelopening te visualiseren.

  1. Transect de distale punt van een tepel met behulp van een steriele microdissectie veerschaar, totdat een kleine centrale ductale opening kan worden gezien onder een vergrootglas lamp (zie Tabel van materialen).
  2. Laad 10 μL virus/broomfenolblauw mengsel in de spuit.
    OPMERKING: Lenti-EGFP (FUCGW) en RCAS-Erbb2 (Neu) worden gebruikt in deze demonstratie.
  3. Steek de naald voorzichtig in de tepelopening met behulp van de vergrootglaslamp. De oriëntatie van de naald wordt iets aangepast van mediaal naar lateraal om uit te lijnen met het hoofdkanaal.
  4. Injecteer de volledige 10 μL van het virus in de kanaalboom.
    OPMERKING: De kanalen onder de huid moeten blauw worden als de injectie succesvol is. Elke weerstand of het verschijnen van een gelokaliseerde kleurverandering duidt op het falen van de injectie.
  5. Zet de muis op een diawarmer ingesteld op 45 °C totdat de muis volledig wakker wordt (~30-60 min).

5. Detectie van geïnfecteerde cellen door een fluorescerende stereomicroscoop

  1. Drie tot vijf dagen na injectie van het virus dat GFP of andere fluorescerende genen draagt, euthanaseert u de muis door deze te overdoseren met 4 uL / g anestheticum (37,6 mg / ml ketamine, 1,92 mg / ml xylazine en 0,38 mg / ml acepromazine).
  2. Open de thoracale holte. Knip de huid langs de ventrale middellijn en langs de bovenste en onderste ledematen met een schaar. Til de huid op en stel de borstklieren bloot.
  3. Verwijder de geïnjecteerde borstklier van de huid met een tang en een schaar. Verwijder ook een niet-geïnjecteerde klier als controle.
  4. Plaats de borstklieren op glasplaten en spreid de klieren uit naar hun oorspronkelijke vorm.
  5. Observeer en beeld de klieren onder een fluorescerende stereomicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Representatieve gegevens worden hier gepresenteerd om succesvolle intraductale injectie, succesvolle virale infectie en de impact van de geleverde genen op borsttumorigenese aan te tonen. De hoeveelheid geïnjecteerd virus moet worden afgestemd op het doel van elk experiment. Om te illustreren hoe uitgebreid de borstkanaalboom kan worden geïnfecteerd, moet een grote hoeveelheid virusdragende genen worden gebruikt die in beeld kunnen worden gebracht, zoals GFP. Aan de andere kant, om de natuurlijke spontane tumorigenese na...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel demonstreert de virale intraductale injectietechniek voor het introduceren van genen in muizen borstepitheelcellen voor het modelleren van sporadische borstkanker. Meestal worden muizen van minstens 5 weken of ouder geïnjecteerd, zodat het oncogene proces begint nadat de borstklier is ontwikkeld. Bovendien is de tepelopening van muizen jonger dan 5 weken oud vaak te klein voor injectie. Aan de andere kant zijn de tepels van zeer oude muizen soms gedegenereerd en kan transsectie geen ductale opening onthullen....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Beide auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Dr. Gary Chamness voor zijn nuttige commentaar op dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door het Department of Defense (DOD) CDMRP BC191649 (YL) en BC191646 (YL) en de National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). De auteurs willen graag de Breast Center Pathology Core Facility bedanken die wordt ondersteund door SPORE P50CA186784, en de Cytometry and Cell Sorting Core ondersteund door CPRIT-RP180672, NIH CA125123 en RR024574 met de hulp van Joel M. Sederstrom.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-HA-antilichaamCovanceMMS-101PVerdunning: 1 : 1000
Kunstmatige tranenCovetrusNDC 11695-0832-1
BroomfenolblauwSigmaB5525microgolfstraling gedurende 45 seconden op hoog vermogen van 1250W microgolfoven
FACSCantoIIBD BiosciencesV96100899
Fluorescente stereomicroscoopLeicaMZ16 FA
FUCGW lenti-virusZelfgemaaktN/AZie referentie # 12
FVB/NThe Jackson LaboratoryJAX:001800
Hamilton-naaldHamilton91033geautoclaveerd
Hamilton-spuitHamilton201000geautoclaveerd
LED-vergrotingslampIntertek3165273
Micro-dissectieveermesRobozRS-5621geautoclaveerd
MMTV-tvaZelfgemaaktZie referentie # 10
RCAS-Neu (HA)ZelfgemaaktN/AZie referentie # 10
Rodent Comboanesthetic IIIVeterinaire apotheekVeterinaire recept37,6 mg/mL ketamine, 1,92 mg/mL xylazine en 0,38 mg/mL acepromazine

Referenties

  1. Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).
  2. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  3. Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
  4. Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
  5. Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
  6. Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
  7. Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
  8. Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
  9. Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720(2013).
  10. Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
  11. Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
  12. Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
  13. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  14. Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115(2015).
  15. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  16. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  17. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
  20. Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
  21. Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996(2013).
  22. Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
  23. Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
  24. Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
  25. Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  26. Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).
  27. Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
  28. Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
  29. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).
  30. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Injectie van virale vectorenlentivirale gentransferretrovirale gentransfermammumtumormodelfluorescentiemicroscopieflowcytometrieenkelcellesuspensie
In Vivo Genafgifte in muisepitheelcellen via intraductale injectie van zmammas
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.