Method Article

Microdissectie en Whole Mount Scanning Elektronenmicroscopie Visualisatie van muis choroïde plexus

DOI:

10.3791/64733

⸱

December 16th, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1VIB Center for Inflammation Research, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De choroïde plexus (CP), een onderbelicht weefsel in de neurowetenschappen, speelt een sleutelrol in de gezondheid en ziekte van het centrale zenuwstelsel. Dit protocol beschrijft een microdissectietechniek voor het isoleren van de CP en het gebruik van scanning elektronenmicroscopie om een algemeen beeld te krijgen van de cellulaire structuur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De choroïde plexus (CP), een sterk gevasculariseerde structuur die uitsteekt in de ventrikels van de hersenen, is een van de meest onderbelichte weefsels in de neurowetenschappen. Omdat het steeds duidelijker wordt dat deze kleine structuur een cruciale rol speelt in de gezondheid en ziekte van het centrale zenuwstelsel (CZS), is het van het grootste belang om de CP uit de hersenventrikels goed te ontleden op een manier die downstream-verwerking mogelijk maakt, variërend van functionele tot structurele analyse. Hier wordt isolatie van de laterale en vierde hersenventrikel muis CP beschreven zonder de noodzaak van gespecialiseerde gereedschappen of apparatuur. Deze isolatietechniek behoudt de levensvatbaarheid, functie en structuur van cellen binnen de CP. Vanwege de hoge vascularisatie kan de CP worden gevisualiseerd zwevend in de ventriculaire holtes van de hersenen met behulp van een binoculaire microscoop. Transcardiale perfusie die nodig is voor downstream-analyse kan de identificatie van het CP-weefsel echter bemoeilijken. Afhankelijk van de verdere verwerkingsstappen (bijv. RNA- en eiwitanalyse) kan dit worden opgelost door de CP te visualiseren via transcardiale perfusie met broomfenolblauw. Na isolatie kan de CP worden verwerkt met behulp van verschillende technieken, waaronder RNA, eiwit of eencellige analyse, om meer inzicht te krijgen in de functie van deze speciale hersenstructuur. Hier wordt scanning elektronenmicroscopie (SEM) op whole mount CP gebruikt om een totaalbeeld van de structuur te krijgen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Strakke barrières scheiden het centrale zenuwstelsel (CZS) van de periferie, inclusief de bloed-hersenbarrière (BBB) en de bloed-hersenvocht (CSF) barrière. Deze barrières beschermen het CZS tegen externe beledigingen en zorgen voor een evenwichtige en gecontroleerde micro-omgeving 1,2,3. Hoewel de BBB in de loop van de tijd uitgebreid is bestudeerd, heeft de bloed-CSF-barrière bij de choroïde plexus (CP) het afgelopen decennium alleen maar meer onderzoeksinteresse gekregen. Deze laatste barrière is te vinden in de vier ventrikels van de hersenen (figuur ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven beschreven in deze studie werden uitgevoerd volgens de nationale (Belgische wet 14/08/1986 en 22/12/2003, Belgisch Koninklijk Besluit 06/04/2010) en Europese wetgeving (EU-richtlijnen 2010/63/EU, 86/609/EEG). Alle experimenten op muizen en dierprotocollen werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit Gent (vergunningsnummers LA1400091 en EC 2017-026).

1. Voorbereiding

  1. Anesthetica: Bereid een terminale verdoving voor. Zo kan bijvoorbeeld een natriumpentobarbital (≥100 mg/kg) oplossing in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) worden bereid.
  2. Transcardiale perfusieoploss....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beschreven protocol vergemakkelijkt de efficiënte isolatie van de CP van de laterale (figuur 2A-C) en vierde (figuur 2D-F) ventrikels van de muizenhersenen. Na het isoleren van de hele hersenen, wordt een tang gebruikt om de hersenen sagittaal te hemisecteren en de CP's te identificeren die in de laterale ventrikels zweven. De CP van de vierde ventrikel kan worden geïsoleerd van de cerebella.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een methode beschreven om de plexus choroideus (CP) uit de laterale ventrikel en de vierde ventrikel van een muizenbrein te isoleren. Deze hele montagemethode van de CP vergemakkelijkt verdere analyse met behulp van een repertoire van technieken om een volledig beeld te krijgen van de CP-morfologie, cellulaire samenstelling, transcriptoom, proteoom en secretoom. Dergelijke analyses zijn cruciaal om een beter begrip te krijgen van deze opmerkelijke structuur die uit de ventrikels van de hersenen steekt. Deze ke.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de Belgische Stichting voor Alzheimeronderzoek (NRK; projectnummer: 20200032), het Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen (FWO Vlaanderen; projectnummers: 1268823N, 11D0520N, 1195021N) en het Fonds Baillet Latour. We danken de VIB BioImaging Core voor training, ondersteuning en toegang tot het instrumentenpark.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
26G x 1/2 needleHenke Sass Wolf4710004512
Aluminium specimen mountsEM Sciences75220
Cacodylate bufferEM Sciences11652
Carbon steel surgial bladesSwann-Morton0210size: 0.45 mm x 12 mm
Carbon adhesive tabs -12 mmEM Sciences77825-12
Critical point dryer Bal-Tec CPD030
Crossbeam 540ZeissSEM system
ForcepsFine Science Tools GmbH 91197-00
GlutaraldehydeEM Sciences16220
HeparinSigma-AldrichH-3125
Ismatec Reglo ICC Digital Peristaltic pump 2-channelMetrohm Belgium N.VCPA-7800160
Osmium Tetroxide EM Sciences19170
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148
Phosphate buffered saline (PBS)LonzaBE17-516F
Platinum Quorum Q150T ESPBS without Ca++ Mg++ or phenol red; sterile filtered
Sodium pentobarbitalKela NV514
Specimen Basket Stainless SteelEM Sciences70190-01
Stemi DV4 Stereo microscopeZeiss
Surgical scissorsFine Science Tools GmbH 91460-11

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vandenbroucke, R. E. A hidden epithelial barrier in the brain with a central role in regulating brain homeostasis. Implications for aging. Annals of the American Thoracic Society. 13, Suppl 5 407-410 (2016).
  2. Engelhardt, B., Sorokin, L. The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid barriers: function and dysfunction.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Choroid PlexusMicrodissection TechniqueMouse Brain VentriclesScanning Electron MicroscopyWhole Mount SEMTranscardial PerfusionBromophenol Blue StainingChoroid Plexus IsolationMorphological AnalysisEpithelial Cells

Related Articles