Caspase-activiteit meten met behulp van een fluorometrische test of flowcytometrie

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft twee methoden om caspase-activiteit te meten via een fluorogeen substraat met behulp van flowcytometrie of een spectrofluorometer.

Samenvatting

De activering van cysteïneproteasen, bekend als caspasen, blijft een belangrijk proces in meerdere vormen van celdood. Caspasen zijn kritische initiators en beulen van apoptose, de meest bestudeerde vorm van geprogrammeerde celdood. Apoptose treedt op tijdens ontwikkelingsprocessen en is een noodzakelijke gebeurtenis in weefselhomeostase. Pyroptose is een andere vorm van celdood die caspasen gebruikt en is een cruciaal proces bij het activeren van het immuunsysteem door de activering van het inflammasoom, wat resulteert in de afgifte van leden van de interleukine-1 (IL-1) familie. Om de caspase-activiteit te beoordelen, kunnen doelsubstraten worden beoordeeld. Gevoeligheid kan echter een probleem zijn bij het onderzoeken van afzonderlijke cellen of activiteit op laag niveau. We laten zien hoe een fluorogeen substraat kan worden gebruikt met een populatiegebaseerde test of eencellige test door flowcytometrie. Met de juiste controles kunnen verschillende aminozuursequenties worden gebruikt om te identificeren welke caspasen actief zijn. Met behulp van deze testen is het gelijktijdige verlies van de remmers van apoptose-eiwitten bij tumornecrosefactor (TNF) stimulatie geïdentificeerd, die voornamelijk apoptose induceert in macrofagen in plaats van andere vormen van celdood.

Inleiding

Caspasen zijn betrokken bij verschillende vormen van geprogrammeerde celdood. Apoptose is de meest bestudeerde vorm van geprogrammeerde celdood en is geassocieerd met caspase-activiteit¹. Alle caspasen bezitten een grote en kleine katalytische subeenheid. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 en caspase-11 bezitten een caspase activatie- en rekruteringsdomein (CARD), en caspase-8 en caspase-10 bevatten death effector domains (DED)2,3,4,5 (Tabel 1). Apoptose kan worden geïnitieerd door twee belangrijke paden: de extrinsieke route en de intrinsieke route. De extrinsieke apoptotische route wordt geactiveerd door doodsreceptoren, die deel uitmaken van de tumornecrosefactor superfamilie (TNFSF). Doodsreceptoren bezitten DED-domeinen, waardoor caspase-8-activiteit^{wordt vergemakkelijkt 6}. De intrinsieke apoptotische route omvat de activering van caspase-9 na de vorming van het apoptosoom, waarbij cytochroom c en Apaf-1^{7 moeten vrijkomen}. De activering van initiator caspase, caspase-8 of caspase-9, leidt tot de splitsing en daaropvolgende activering van de beul caspasen, die caspase-3, caspase-6 en caspase-7 zijn. Identificeren dat de beul caspasen actief zijn, geeft aan dat de cellen apoptose ondergaan, en deze activering wordt beschouwd als een belangrijke factor bij het definiëren van de modus van celdood.

Caspase-activering is ook een kritiek moment voor het reguleren van ontstekingen en de inductie van alternatieve vormen van geprogrammeerde celdood. Caspase-1-activering leidt bijvoorbeeld tot de rijping van pro-inflammatoire cytokines van de interleukine-1-familie⁸. De afgifte en activering van cytokines uit deze familie, met name IL-1β en IL-18, zijn het gevolg van gasdermine D-splitsing en porievorming bij het plasmamembraan ^9,10. Onvoldoende membraanherstel van gasdermine D-poriën kan leiden tot een soort celdood die bekend staat als pyroptose¹¹. Bovendien resulteert caspase-8-activiteit in de remming van een caspase-onafhankelijke celdood die bekend staat als necroptosis¹². Receptor-interagerende serine/threonine-eiwitkinase 1 (RIPK1) is een van de kritische factoren bij necroptose en bij het veroorzaken van ontstekingen gereguleerd door NF-kB. Modellen hebben aangetoond dat RIPK1 wordt gesplitst door caspase-8, wat resulteert in het beperken van NF-kB-signalering, apoptose en necroptose^13,14. Daarom kan het identificeren van de activiteit van verschillende caspasen helpen bij het begrijpen van de resulterende ontsteking en celdoodmodaliteit.

Onafhankelijk van de functie van caspasen bij het reguleren van celdoodmodaliteiten, kan caspase-activiteit ook andere cytokinefamilies reguleren, zoals interferon (IFN), als reactie op infectie^15,16. Bovendien zijn caspasen betrokken bij niet-celdoodfuncties, waaronder beslissingen over het lot van cellen, weefselherstel en -regeneratie, tumorigenese door DNA-reparatie en neuronale synapsfunctie. De activiteit van caspasen in deze niet-dodelijke rollen wordt verondersteld te worden beperkt door de cellulaire lokalisatie en hoeveelheid caspasen. Daarom kan het kwantificeren van het niveau van caspase-activiteit heel goed bepalen of een cel celdood ondergaat of dat de caspase een rol speelt in een niet-celdoodfunctie ^4,17,18.

Caspase-activiteit kan op meerdere manieren worden beoordeeld. Western blotting voor gespleten caspasen en hun substraten is gebruikt als een indicator van activiteit, maar deze testen zijn op zijn best kwalitatief. Om te bepalen of caspase-activiteit geassocieerd is met celdood, is een kwantitatieve meting ideaal. Omdat caspasen substraten splitsen op een herkenningsplaats die bestaat uit vier aminozuren, zijn colorimetrische, luminescentie- of fluorometrische methoden ontwikkeld. Caspasen lijken echter plasticiteit in hun substraatherkenning te hebben ^19,20. De herkenningsvolgorde is niet geassocieerd met de eiwitdomeinen (tabel 1). De tetrapeptidesequentie DEVD kan echter worden gebruikt om caspase-3 en caspase-7 activiteit^20,21 te detecteren.

Smac mimetica zijn verbindingen die zich richten op de remmers van apoptose-eiwitten (IAP's). Het gebruik van Smac-mimetica in een subset van kankercellen zorgt ervoor dat de cellen gevoelig worden voor TNF-geïnduceerde celdood²². In primaire macrofagen veroorzaken Smac-mimetica celdood zonder de exogene toevoeging van TNF ^23,24. Het verlies van cIAP1 door Smac mimetisch geïnduceerde afbraak resulteert in de productie van TNF. Als caspase-activiteit wordt gedetecteerd, betekent dit dat de cellen niet zijn gestorven door necroptose, maar op een apoptotische manier. In deze methode wordt de detectie van gespleten DEVD-substraat gebruikt om caspase-3/caspase-7-activiteit te identificeren. Verdere experimenten om apoptotische celdood te bevestigen zijn eerder gepubliceerd²⁴.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd met goedkeuring en volgens de richtlijnen van de dierethische commissie van de Universiteit van Zürich (#ZH149/19). Mannelijke C57Bl/6J-muizen van 8-16 weken, gefokt en gehuisvest in specifieke pathogeenvrije (SPF) omstandigheden, werden gebruikt voor de huidige studie. De intacte botten kunnen op ijs worden bewaard in steriel Hank's gebufferde zoutoplossing (HBSS) met 2% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS). Beenmerg werd verzameld uit het dijbeen en het scheenbeen van de muis²⁵ op de dag van differentiatie. Beide methoden voor het beoordelen van caspase-activiteit kunnen worden gebruikt voor andere celtypen, waaronder zowel primaire als getransformeerde.

1. Differentiëren van van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's)

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een weefselkweek laminaire stromingskap en gebruik steriele aseptische technieken.

1. Bereid een spuit van 1 ml met een naald van 21 g.
2. Voeg 5 ml HBSS + 2% FBS toe aan een buis van 15 ml.
3. Gebruik een steriele tang, neem een weggesneden dijbeen en steek de naald in de opening van het dijbeen. Houd het dijbeen in de HBSS + 2% FBS, spoel het beenmerg uit totdat het bot wit is. Spoel het scheenbeen op dezelfde manier. Blijf de oplossing spoelen om een eencellige suspensie te verkrijgen.
4. Centrifugeer de eencellige suspensie bij 200 x g gedurende 4 minuten bij kamertemperatuur (RT).
5. Verwijder het supernatant met behulp van een vacuümaspirator. Tik op de buis om de pellet voorzichtig te resuspeneren. Voeg 1 ml rode cellysisbuffer toe (zie materiaaltabel) en meng voorzichtig met een pipet P1.000. Incubeer bij RT gedurende 1 min.
6. Voeg 10 ml HBSS + 2% FBS toe en centrifugeer bij 200 x g gedurende 4 minuten bij RT.
7. Verwijder het supernatant en resuspenseer in 10 ml beenmerg-afgeleid macrofaag (BMDM) kweekmedium.
   OPMERKING: BMDM-kweekmedium bestaat uit DMEM met een laag glucosegehalte met de toevoeging van 10% FBS, 20 ng/ml M-CSF, penicilline (50 U/ml) en streptomycine (50 μg/ml) (zie materiaaltabel). Als alternatief kan 20% L929 geconditioneerd medium worden vervangen door de M-CSF.
8. Voeg 15 ml BMDM-kweekmedium toe aan twee petrischaaltjes van 15 cm. Voeg 5 ml van de eencellige oplossing toe aan elke plaat.
   OPMERKING: Gebruik geen met weefselkweek behandelde platen. Met weefselkweek behandelde platen beperken de differentiatie.
9. Zet de gerechten op 37 °C, 5% CO₂, gedurende 6 dagen.
   OPMERKING: De BMDM's kunnen na 5-7 dagen worden geoogst. Langere incubatietijden voor differentiatie leiden tot verhoogde anti-apoptotische eiwitexpressie²⁶.

2. Oogsten, zaaien en behandelen van cellen

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een weefselkweek laminaire stromingskap en gebruik steriele aseptische technieken. Volledig gedifferentieerde macrofagen hechten zich aan de plaat, waardoor een gemakkelijke scheiding mogelijk is, terwijl zwevende cellen kunnen worden weggegooid. Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) kan worden gebruikt met of zonder Ca²⁺ en Mg²⁺.

1. Verwijder na 6 dagen incubatie de zwevende cellen en het medium van de plaat met behulp van een aspirator.
2. Voeg 5 ml PBS toe aan elke plaat van 15 cm. Verwijder de PBS van de plaat met behulp van een aspirator.
3. Voeg 2 ml trypsine (zie materiaaltabel) toe aan elke plaat. Incubeer de plaat totdat zacht tikken op de plaat de cellen losmaakt. Neem 5 ml BMDM-kweekmedium en oogst de cellen van het bord.
   1. Breng over naar de tweede plaat van 15 cm en oogst de cellen van de plaat. Verwijder de celsuspensie van de plaat in een buis van 50 ml. Neem nog eens 5 ml BMDM-kweekmedium en was beide platen om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn verzameld. Plaats de celsuspensie in dezelfde buis van 50 ml.
4. Neem 10 μL van de celsuspensie en tel met behulp van een hemacytometer met behulp van een 1:1 verdunning met trypan blue.
   OPMERKING: Automatische celtellers kunnen ook worden gebruikt wanneer ze zijn gekalibreerd voor de grootte van de macrofagen.
5. Zaai de macrofagen met een dichtheid van 1 x 10⁶ cellen/ml. BMDM's gezaaid op 2 x 10⁶ cellen / put in een 6-well plaat leveren ongeveer 2 mg / ml totaal eiwit. Laat de cellen zich voor de behandeling minimaal 6 uur aan de plaat hechten.
   OPMERKING: Voor andere celtypen moet de optimale concentratie worden bepaald.
6. Behandel de macrofagen met Smac mimetisch (verbinding A, zie materiaaltabel)²² bij 250 nM en 500 nM gedurende 16 uur.
   OPMERKING: Neem een positieve controle op om apoptose en caspase-3-splitsing te induceren om ervoor te zorgen dat de test werkt. Veel voorkomende apoptose-inductoren zijn staurosporine en etoposide. Voor veel cellijnen om apoptose te ondergaan, is 0,1-10 μM voor 16 uur stimulatie voldoende.

3. Cellysaten bereiden uit behandelde cellen

OPMERKING: Deze stap moet op ijs worden uitgevoerd en de reagentia en materialen moeten vooraf worden gekoeld.

1. Breng de platen met de behandelde cellen over op het ijs. Verzamel het medium uit de celcultuur in een buis van 1,5 ml, centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, zuig het medium aan en zet de buis in de ijskast. Dit maakt het mogelijk om de cellen te verzamelen die zich van de plaat hebben losgemaakt.
2. Voeg 1 ml koude PBS toe aan de celkweekplaat voor het wassen van de cellen en aspirateer alle PBS. Voeg 100 μL trypsine toe aan de cellen (als je met een 6-wells gerecht werkt). Laat de trypsine de cellen van de plaat tillen en verzamel ze in de buis van 1,5 ml. Gebruik 1 ml koude PBS om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn verzameld.
   OPMERKING: Als u met suspensiecellen werkt, breng het medium en de cellen dan voorzichtig over naar een buis van 1,5 ml.
3. Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder het supernatant en resuspenseer in 100 μL DISC-lysisbuffer (150 mM natriumchloride, 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 10% glycerol, 20 mM Tris, pH 7,5, zie Materiaaltabel).
4. Incubeer de monsters op ijs gedurende 20 minuten.
5. Centrifugeer de lysaten bij ~12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de onoplosbare fractie te pelleteren.
6. Breng 25 μL van het lysaat over in een witte 96-wellsplaat met platte bodem voor de caspase-3/caspase-7 activiteitstest (stap 5).
   LET OP: Verstoor de pellet niet. Dit is de onoplosbare fractie van het cellysaat.
7. Breng 10 μL van het resterende lysaat over in een transparante 96-wellsplaat met platte bodem voor de bicinchonininezuur (BCA) assay (stap 4). Dit zal worden gebruikt voor de normalisatie van de monsters.
8. Bewaar beide platen op ijs voor verdere verwerking.
   OPMERKING: In dit stadium kunnen de platen worden verzegeld met een zelfklevende hoes en gedurende ongeveer 4 weken bij −20 °C worden bewaard.

4. Eiwitkwantificering met behulp van de BMA-test

OPMERKING: Andere reagentia of assays kunnen worden gebruikt om de hoeveelheid eiwit in elk monster te kwantificeren. In de populatiegebaseerde test kunnen de monsters worden vergeleken door de hoeveelheid eiwit die in de test wordt gebruikt te normaliseren.

1. Bereid standaard eiwitconcentraties tussen 0 μg/ml en 2.000 μg/ml (0 μg/ml, 25 μg/ml, 125 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml, 750 μg/ml, 100 μg/ml, 1.500 μg/ml, 2.000 μg/ml) met runderserumalbumine (BSA). Bereid lege plekken alleen voor met een lysisbuffer.
2. Voeg 10 μL van elke standaard toe aan de platbodemplaat met 96 putten die de in stap 3.7 vermelde monsters bevat.
3. Meng BCA-reagens 1 met BCA-reagens 2 in een verhouding van 50:1 (zie materiaaltabel). Voeg 200 μL gemengd BCA-reagens toe aan elk monster en standaard.
4. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 min.
5. Meet de absorptie bij 562 nm op een fluorometrisch instrument en kwantificeer de eiwitconcentratie met de standaardcurve.

5. Populatiegebaseerde test voor caspase-3/caspase-7-activiteit

OPMERKING: Laat de cellysaten in de plaat niet langer dan 3 uur op ijs zitten. Als caspase-activiteit aanwezig is, neemt dit in de loop van de tijd toe, ondanks dat het monster op ijs ligt. Als de monsters bevroren waren, ontdooi ze dan op ijs en ga onmiddellijk verder zodra de lysaten zijn ontdooid.

1. Start het fluorometrische instrument (zie Materiaaltabel) en verwarm de machine tot 37 °C. Bereid het script voor zoals vermeld:
   1. Voer elke minuut gedurende 40 minuten individuele metingen uit om de kinetiek van de reactie te bepalen.
   2. Stel de excitatie in op 360 nm en de emissie op 465 nm. Tien flitsen per put zijn voldoende.
2. Bereid de positieve controle van recombinant caspase-3 voor (zie materiaaltabel). Meng 1 U van het recombinante caspase-3 enzym in 50 μL lysisbuffer (buis 1). Voeg 25 μL lysisbuffer toe aan nog eens drie buisjes. Breng 25 μL over van buis 1 naar buis 2. Meng door te pipetteren.
   1. Herhaal dit voor buis 3 en buis 4. Buis 5 bevat slechts 50 μL lysisbuffer. Voeg 25 μL van elke standaard toe aan de witte 96-wellsplaat met platte bodem voor de caspase-3-activiteitstest, vermeld in stap 3.6.
3. Bereid een hoofdreactiemix voor caspase-activiteitstest op ijs. Meng voor één reactie 50 μL 2x caspase cleavage buffer (0,2M HEPES pH 7,5; 20% sucrose of PEG; 0,2% CHAPS), 5 μL van 1 mM DEVD-AMC (caspase-3 tetrapeptide substraat), 2 μL van 500 mM DTT en 18 μL gedeïoniseerd water (zie Materiaaltabel).
4. Voeg 75 μL van het reactiemengsel toe aan elk monster en standaard om een totaal reactievolume van 100 μL te verkrijgen.
5. Meet onmiddellijk de fluorescentie met behulp van het fluorometrische instrument dat in stap 5.1 is ingesteld.
6. Trek voor elke fluorescerende meting de fluorescentiewaarde voor de blanco (alleen lysisbuffer) af van de fluorescentie van het monster. Normaliseer de aflezing door de eiwitconcentratie van het monster te delen (berekend in stap 4.5)²⁷:
   
7. Bereken de snelheid van caspase-activiteit door de helling van de genormaliseerde fluorescentie op de y-as en de tijd op de x-as te bepalen.

6. Eencellige test (flowcytometrieanalyse) voor caspase-3/caspase-7-activiteit

1. Zaai de cellen zoals beschreven in rubriek 2.
2. Oogst de cellen in een polystyreenbuis van 5 ml. Als u met aanhangende cellen werkt, verzamelt u het medium in de buis van 5 ml. Voeg 1 ml koude PBS toe aan de celkweekplaat en verzamel de PBS in de buis van 5 ml. Voeg trypsine toe aan de cellen (100 μL bij het werken met 6-well gerechten). Laat de trypsine de cellen van de plaat tillen en verzamel in de buis van 5 ml. Gebruik 1 ml koude PBS om ervoor te zorgen dat alle cellen zijn verzameld.
   OPMERKING: Als u met suspensiecellen werkt, breng het medium en de cellen dan voorzichtig over naar een buis van 5 ml.
3. Centrifugeer de monsters bij 300 x g gedurende 5 min, 4 °C. Verwijder het supernatant met behulp van een vacuümaspirator.
4. Bereid de kleuringsmix voor. De optimale kleuringsconcentratie is 1 x 10^6-2 x 10⁶ cellen in 50 μL. Verdun het fluorogene substraat volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel, flowcytometrie). Neem 1 μL van het stamsubstraat en verdun in 150 μL PBS. Voeg 50 el per monster toe.
5. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten beschermd tegen licht, met menging om de 15 minuten.
6. Gebruik bij de flowcytometer die in deze studie wordt gebruikt de rode laser bij 640 nm en detecteer met 675/25 nm. Voer eerst de niet-gekleurde controlesteekproef uit en verkrijg minimaal 10.000 gebeurtenissen van de gewenste populatie. Sluit het puin uit met behulp van een poort (P1) op een FSC-A en SSC-A dot plot.
   1. Gebruik een histogram met de gebeurtenissen in de P1-poort en detectie voor het caspase-substraat (y-as) om de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) te bepalen.
      OPMERKING: Het caspase-substraat dat in deze methode wordt beschreven, vereist een excitatie bij 590 nm en zendt uit bij 628 nm.

Resultaten

Primaire muismacrofagen werden gedurende 6 dagen gedifferentieerd. Na 6 dagen werden de cellen geoogst, geteld en gezaaid. De volgende behandelingen werden gebruikt: geen behandeling en Smac mimetisch (compound A)²² bij 250 nM en 500 nM gedurende 16 h (figuur 1). Het experiment werd in tweevoud uitgevoerd om caspase-3/caspase-7-activering te kunnen beoordelen door middel van een populatiegebaseerde test of eencellige analyse met behulp van flowcytometrie.

De eiwitconcentratie van de cellysaten werd gekwantificeerd met behulp van de BCA-test (aanvullende tabel 1). Dit is nodig om ervoor te zorgen dat de hoeveelheid eiwit die wordt gebruikt in de caspase-3/caspase-7-activiteitstest hetzelfde is tussen de monsters. In deze populatiegebaseerde test kunnen de gegevens op twee manieren worden gepresenteerd. De eerste is om de kinetiek te tonen door de aangepaste fluorescentie (y-as) versus tijd (x-as) uit te zetten (figuur 2A). Als alternatief kan de helling worden berekend om de monsters direct te vergelijken (figuur 2B). De toename van de helling bij 500 nM Smac mimetische behandeling was niet significant op basis van een gewone eenrichtings-ANOVA met meerdere vergelijkingen (Dunnett's meervoudige vergelijkingstest²⁸).

Voor de analyse van caspase-3/caspase-7 activiteit met behulp van flowcytometrie werden de cellen en het supernatant geoogst. Niet-gekleurde cellen of fluorescentie minus één werden gebruikt als een negatieve controle, evenals de onbehandelde cellen. Een histogram van de cellen verzameld door flowcytometrie toonde een verschuiving in fluorescentie voor de cellen behandeld met Smac mimetica in vergelijking met de onbehandelde cellen (figuur 2C). De gegevens kunnen worden weergegeven als mediane fluorescentie-intensiteit (figuur 2D) of als een vouwverandering over de onbehandelde cellen (figuur 2E).

Figuur 1: Stroomschema van het onderzoek. (A) Dijbenen en tibia's werden weggesneden uit C57Bl/6-muizen. De botten werden gespoeld en gedifferentieerd in 20 ng / ml M-CSF gedurende 6 dagen. (B) Op dag 6 werden macrofagen geoogst en opnieuw ingezaaid voor behandeling. Eén set cellen werd geoogst voor lysaten en beoordeeld op fluorogene activiteit, terwijl de andere set werd geoogst, geïncubeerd met het fluorogene substraat en beoordeeld door flowcytometrie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Kinetische assay voor caspase-3/caspase-7 activiteit en substraatsplitsing door flowcytometrie. (A,B) Representatieve gegevens van de kinetische assay voor caspase-3/caspase-7 activiteit (C-E) en substraatsplitsing door flowcytometrie. De macrofagen werden behandeld met twee concentraties Smac mimetisch (Compound A; 250 nM en 500 nM) gedurende 16 h. (A) Detectie van het gespleten DEVD AFC-substraat in de loop van de tijd. De gegevens werden genormaliseerd naar de eiwitconcentratie in het monster. (B) De mate van splitsing (helling) van DEVD AFC voor elk monster werd genormaliseerd naar de onbehandelde helling en gepresenteerd als de vouwverandering over de onbehandelde cellen. (C) Flowcytometrische histogrammen van de cellen geïncubeerd met het caspase-3 substraat. (D,E) MFI-vergelijking en vouwverandering in de MFI in vergelijking met de onbehandelde steekproef. Elk gegevenspunt vertegenwoordigt een onafhankelijk monster; gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde worden weergegeven; *p < 0,05 met behulp van een one-way ANOVA en meerdere vergelijkingstests (Dunnett's meervoudige vergelijkingstest). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Caspase	Soort	Substraatvolgorde	Eiwitdomeinen
Caspase-1	Hs, Mm	(W/L) Ehd	CARD, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-2	Hs, Mm	Dexd	CARD, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-4	Hs	(W/L) Ehd	CARD, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-5	Hs	(W/L) Ehd	CARD, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-9	Hs, Mm	(I/V/L) E(H/T)D	CARD, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-11	Mm	(W/L) Ehd	CARD, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-12	Mm	Atad	CARD, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-8	Hs, Mm	(I/V/L) E(H/T)D	DED, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-10	Hs	(I/V/L) E(H/T)D	DED, groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-3	Hs, Mm	Dexd	groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-6	Hs, Mm	(I/V/L) E(H/T)D	groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-7	Hs, Mm	Dexd	groot domein, klein katalytisch domein
Caspase-14	hs, mm	(W/L) Ehd	groot domein, klein katalytisch domein
KAART	caspase activatie en rekrutering domein
DED	death effector domein
Hs	homo sapien |
Mm	mus musculus |

Tabel 1: Substraatspecificiteit en de eiwitdomeinen van de caspasen. De tabel is aangepast van McStay et ^al.20; Shalini et ^al.3; en van Opdenbosch en Lamkanfi⁴.

Aanvullende tabel 1: KINETISCHE ANALYSE VAN DEVD. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Bij deze methode wordt een fluorogeen substraat gebruikt in een populatiegebaseerde test of eencellige analyse om caspase-3/caspase-7-activiteit te meten. Beide methoden meten de caspase-activiteit op een kwantitatieve manier op basis van de splitsing van een substraat. Een voordeel is de mogelijkheid om deze methoden te gebruiken voor tal van monsters. Met deze methoden wordt caspase-3/caspase-7 activiteit gedetecteerd in primaire macrofagen behandeld met Smac mimetica.

Een cruciaal aspect van de populatiegebaseerde fluorometrische test is de tijd van lysis tot het lezen van de fluorescentie. De monsters moeten gedurende de hele procedure op ijs worden bewaard, met name voordat de test wordt "afgelezen". Dit voorkomt voortijdige splitsing en fluorescentie van het substraat. Met behulp van de populatiegebaseerde test kan minder optimalisatie nodig zijn. De hoeveelheid eiwit die in de test wordt gebruikt, wordt genormaliseerd, waardoor de monsters direct kunnen worden vergeleken. Een voorbehoud is dat in een laat stadium van apoptotische celdood de totale eiwithoeveelheid wordt verminderd; daarom is de detectie van caspase-activiteit mogelijk niet mogelijk. Verschillende kinetiek of verschillende behandelingsdoses worden aanbevolen om dit probleem te omzeilen. Bovendien kan andere software worden gebruikt om de snelheid van caspase-activiteit nauwkeurig te beoordelen naast de software die in deze methode wordt beschreven.

Voor de flowcytometrische test zijn voldoende gebeurtenissen of cellen nodig om de populaties met vertrouwen te sluiten. Bovendien kan meer optimalisatie in de op stroming gebaseerde test nodig zijn om de optimale verhouding tussen substraat en celgetal te bereiken. Met flowcytometrie leent deze methode zich echter voor het meten van aanvullende parameters, zoals celoppervlakmarkers voor celtype-identificatie.

Zowel de populatie als eencellige methoden kunnen worden gebruikt voor andere caspasen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat de herkenningsvolgorde minder wordt gediscrimineerd voor andere caspasen. Als zodanig moeten andere methoden voor caspase-activiteit worden gebruikt. Dit omvat de remming van caspase-activiteit, CRISPR of knock-down van specifieke caspasen en western blotting om de splitsing van bekende substraten te detecteren.

Een alternatieve methode voor het detecteren van caspase-activiteit is time-lapse imaging. Hetzelfde doorlatende caspase-substraat kan samen met andere markers van levensvatbaarheid, zoals annexine V, worden gebruikt om informatie te verstrekken over de kinetiek van celdood. Beeldvorming zou ook de caspase-activiteit en celoverleving scheiden, waardoor subletale hoeveelheden caspase-activiteit in een celpopulatie kunnen worden gedetecteerd. De niet-letale functies van caspase-3/caspase-7 zijn gekoppeld aan antivirale regulatie in aangeboren immuuncellen²⁹, met name de activering van type I IFN via mitochondriale DNA-afgifte^15,16. Deze testen om caspase-activiteit te meten zijn dus van cruciaal belang voor het identificeren van verschillende manieren van celdood en kunnen nuttig zijn bij het beoordelen van niet-celdoodfuncties.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microfuge tubes	Sarstedt	72.706.400
15 cm Petri plates	Sarstedt	82.1184.500
37 degree incubator shaker	IKA shaker KS 4000i	97014-816	distributed by VWR
6-well cell culture dish	Sarstedt	83.392
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile	Sigma	CLS3600
96 well flat plate	Sarstedt	82.1581
Ac-DEVD-AFC	Enzo Life Sciences	ALX-260-032-M005	Caspase-3 substrate
BD Fortessa	BD		any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work
b-glycerolphosphate	Sigma	G9422-10G
caspase-3 recombinant	Enzo Life Sciences	ALX-201-059-U025
CHAPS	Sigma	1.11662
DMEM, low glucose, pyruvate	Thermoscientific	31885023
DMSO	Sigma	D8418-250ML
EDTA	Sigma	03685-1KG
EGTA	Sigma	324626-25GM
Etoposide	MedChem Express	HY-13629
FBS	Thermoscientific	26140
Flow cytometry tubes	Falcon	352008
Flowjo	Flowjo		A license in required but any program that can analyze.fcs files will suffice
Glycerol	Sigma	G5516-500ML
HEPES	Sigma	H4034
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging	Immunochemistry Technologies	935
M-CSF	ebioscience	14-8983-80	now a subsidiary of Thermoscientific
M-Plex	Tecan		any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors
NaCl	Roth	3957.1
PBS pH 7.4	Thermoscientific	10010023
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X)	Thermoscientific	10378016
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225	protein concentration assay
protease inhibitors	Biomol	P9070.100
Smac mimetic, Compound A	Tetralogics		also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007
Sodium Fluoride	Sigma	S7920-100G
sodium orthovanadate	Sigma	S6508-10G
sodium pyrophosphate	Sigma	P8010-500G
Staurosporine	MedChem Express	HY-15141
sucrose	Sigma	1.07687
Tris Base	Sigma	T1503-1KG
Triton X100	Sigma	T8787-50ML
TrypLE	Thermoscientific	A1285901	In the protocol, it is listed as Trypsin