Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Methoden voor het bestuderen van baarmoederbijdragen aan zwangerschapsinstelling in een ovariectomiemodel

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64763

⸱

7 april 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Zwangerschapsvorming is een dynamisch proces met complexe embryo- en baarmoederkruisverwijzing. De precieze bijdragen van de maternale baarmoederomgeving aan deze processen blijven een actief onderzoeksgebied. Hier worden gedetailleerde protocollen verstrekt om te helpen bij het ontwerpen van in vivo diermodellen om deze onderzoeksvragen aan te pakken.

Samenvatting

Om zwangerschap vast te stellen, moet een levensvatbare blastocyst met succes interageren met een receptief baarmoederslijmvlies (endometrium) om implantatie en placentavorming te vergemakkelijken en een voortdurende zwangerschap mogelijk te maken. De beperkingen van zwangerschapssucces veroorzaakt door embryonale defecten zijn bekend en zijn de afgelopen decennia grotendeels overwonnen met de opkomst van in-vitrofertilisatie (IVF) en geassisteerde voortplantingstechnologieën. Tot nu toe heeft het veld echter de beperkingen die worden veroorzaakt door een onvoldoende ontvankelijk endometrium niet overwonnen, wat resulteert in stagnerende IVF-slagingspercentages. Ovariële en endometriumfuncties zijn nauw met elkaar verweven, omdat hormonen die door de eierstok worden geproduceerd verantwoordelijk zijn voor de menstruatiecycliciteit van het endometrium. Als zodanig kan het bij het gebruik van knaagdiermodellen van zwangerschap moeilijk zijn om vast te stellen of een waargenomen resultaat te wijten is aan een ovariële of baarmoedertekort. Om dit te ondervangen, werd een ovariectomie muismodel ontwikkeld met embryotransfer of kunstmatige decidualisatie om de studie van baarmoederspecifieke bijdragen aan de zwangerschap mogelijk te maken. Dit artikel geeft instructies over het uitvoeren van ovariëctomie en biedt inzicht in verschillende technieken voor het leveren van exogene hormonen ter ondersteuning van succesvolle kunstmatige decidualisatie of zwangerschap na embryotransfer van gezonde donoren. Deze technieken omvatten subcutane injectie, pellets met langzame afgifte en osmotische minipompen. De belangrijkste voor- en nadelen van elke methode worden besproken, zodat onderzoekers de beste onderzoeksopzet voor hun specifieke onderzoeksvraag kunnen kiezen.

Inleiding

Met het toenemende gebruik van geassisteerde reproductieve technologieën in de afgelopen decennia, zijn veel barrières voor conceptie overwonnen, waardoor veel paren een gezin kunnen stichten ondanks vruchtbaarheidsproblemen1. Oöcyten- of spermatekorten kunnen vaak worden omzeild met behulp van in-vitrofertilisatie of intracytoplasmatische sperma-injectie ; Problemen met betrekking tot de baarmoeder en endometriumreceptiviteit blijven echter een ongrijpbare "zwarte doos" van voortplantingspotentieel2.

Zwangerschap wordt vastgesteld wanneer een embryo van hoge kwaliteit met succes interageert met een receptief endometrium (baarmoederslijmvlies). De kans op een succesvolle zwangerschap in een bepaalde menstruatiecyclus is laag, rond de 30%3,4. Van degenen die succesvol zijn, gaat slechts 50% -60% verder dan 20 weken zwangerschap, waarbij implantatiefalen verantwoordelijk is voor 75% van de zwangerschappen die 20 weken niet bereiken3. Ondanks deze cijfers die dateren uit de late jaren 1990, moet het veld nog steeds de beperkingen overwinnen die worden veroorzaakt door een onvoldoende ontvankelijk endometrium. Dit heeft geresulteerd in stagnerende - en soms dalende - IVF-slagingspercentages in de afgelopen jaren 5,6.

Vrouwen met onverklaarbare onvruchtbaarheid hebben vaak een verplaatst venster van ontvankelijkheid of zijn om onbekende redenen niet in staat om ontvankelijkheid te bereiken. Onlangs is de endometriumreceptiviteitsarray ontwikkeld, die de expressie van honderden genen beoordeelt met als doel de timing van embryotransfer aan te passen aan het venster van ontvankelijkheid van een individu 7,8,9. Het veld mist echter nog steeds een goed begrip van de pathogenese van zwangerschapscomplicaties die zich manifesteren nadat het implantatieproces is voltooid.

Het vrouwelijke voortplantingssysteem is zeer dynamisch en staat onder strakke hormonale controle. De hypothalamus-hypofyse-gonadale (HPG) as regelt de afgifte van luteïniserend hormoon en follikelstimulerend hormoon, die aspecten van de ovariële cyclus reguleren, waaronder follikelrijping en oestrogeen- en progesteronactiviteit. Op zijn beurt wordt de baarmoedermenstruele cyclus gereguleerd door oestrogenen en progesteron10,11. Het bestuderen van baarmoederbiologische mechanismen wordt dus bemoeilijkt door ovariële invloed. Bij het bestuderen van hoe kankertherapieën de baarmoeder kunnen beïnvloeden, kan het bijvoorbeeld moeilijk zijn om te onderscheiden of een waargenomen baarmoederfenotype (zoals zwangerschapsverlies of menstruatieacycliciteit) het gevolg is van een directe belediging van de baarmoeder of een gevolgeffect van schade aan de eierstokken.

Om de vruchtbaarheid volledig te begrijpen, moeten de baarmoederbijdragen aan de zwangerschap worden gekarakteriseerd. Belangrijk is dat dit begrip verder moet reiken dan de baarmoederfunctie onder ovariële controle. Dit kan niet bij mensen worden bestudeerd; Daarom worden vaak diermodellen gebruikt. Als zodanig wordt ovariëctomie (OVX) vaak gebruikt om onderzoekers in staat te stellen knaagdieroestruscycli te reguleren (analoog aan de menstruatiecyclus) door exogene hormonen te leveren. Bovendien maakt OVX het mogelijk om baarmoederresponsen te bestuderen onafhankelijk van ovariële invloed12. Als hormonen echter niet onmiddellijk na OVX worden geleverd, zal een menopauzefenotype optreden, dat zorgvuldig door de onderzoekers moet worden overwogen.

OVX wordt vaak gebruikt in knaagdiermodellen 13,14,15,16,17 en is relatief eenvoudig uit te voeren na adequate training. Methoden variëren afhankelijk van of de eierstok alleen of de eierstok en eileider worden verwijderd, evenals afhankelijk van de leeftijd van het dier (volwassen, fietsende dieren hebben grotere eierstokken met een zichtbaar corpus luteum op hun oppervlak, wat betekent dat hun eierstokken gemakkelijker te visualiseren zijn). Evenzo bestaan er veel methoden voor hormoonsuppletie, waaronder subcutane injecties14, pellets met langzame afgifte15, osmotische minipompen18 en ovariële transplantatie.

In dit artikel worden gedetailleerde instructies gegeven over het uitvoeren van ovariëctomie en het bereiden van drie soorten hormoonsuppletie, waaronder subcutane injecties, pellets met langzame afgifte en osmotische minipompen. Er worden twee gedetailleerde protocollen verstrekt voor experimentele eindpunten die baat hebben bij OVX, gevolgd door exogene hormoonsuppletie (embryotransfer en kunstmatige decidualisatie). Dit artikel bespreekt de sterke en zwakke punten van elke aanpak met als doel onderzoekers te begeleiden bij het uitvoeren van studies om de effecten op de baarmoeder te isoleren, met name op het gebied van zwangerschap en vruchtbaarheid.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dieren werden gehuisvest in temperatuurgecontroleerde, hoogbarrièrefaciliteiten (Monash University Animal Research Laboratory) met gratis toegang tot voedsel en water en een licht-donkercyclus van 12 uur. Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedkeuring van de ethische commissie van het Monash Animal Research Platform (# 21908, 17971) en uitgevoerd in overeenstemming met de praktijkcode van de National Health and Medical Research Council voor de verzorging en het gebruik van dieren.

1. Chirurgische voorbereiding

  1. Autoclaaf alle chirurgische instrumenten, gaas en papieren handdoeken die nodig zijn voor de procedures op een harde/droge goederencyclus bij 121 °C met een houdtijd van 30 minuten en een droogtijd van 30 minuten.
  2. Leg een steriele bankkussen neer voor de chirurgische werkruimte en bereid pijnstillers voor.
    1. Verdun carprofen in steriele zoutoplossing tot 1 mg/ml en verdun bupivacaïne in steriele zoutoplossing tot een 0,5% (g/v) oplossing.
    2. Voeg 3,5 ml meloxicam toe aan een drinkfles van 400 ml.
  3. Verwarm de warmtekussens voor de herstelkooien voor en stel warmtelampen in om indirect licht op de herstellende dieren te schijnen.
  4. Zorg ervoor dat alle juiste PBM's worden gedragen, inclusief een haarnetje, gezichtsmasker, japon en handschoenen.
  5. Oefen een goede steriele techniek, waaronder het regelmatig besproeien van de handschoenen met ethanol en ze laten verdampen voordat u het dier of chirurgische hulpmiddelen hanteert om ethanolbesmetting te voorkomen.

2. Ovariëctomie uitvoeren

  1. Gebruik een gasanesthesieapparaat met isofluraan om de inductiebox gedurende 3-5 minuten voor te vullen bij 5% isofluraan met een debiet ingesteld op 4 l/min.
  2. Plaats de muis in de inductiedoos en verplaats deze, eenmaal bewusteloos, naar de neuskegel en verlaag het debiet tot 0,4 l/min, waarbij de isofluraanverdamper is ingesteld op ~2,5%.
    OPMERKING: Het percentage isofluraan dat voor de rest van de procedure wordt gebruikt, varieert op basis van muizenstam, leeftijd en blootstelling aan behandelingen (bijv. chemotherapie) en moet worden aangepast op basis van een nauwkeurige beoordeling van de ademhalingspatronen van elk individueel dier. Ademhalingspatronen moeten blijven als regelmatige buikademhalingen. Snelle, thoracale ademhalingen kunnen erop wijzen dat een diep chirurgisch vlak niet is bereikt of gehandhaafd; Pas in dit geval het percentage van de isofluraan verdamper indien nodig aan.
  3. Breng het oogglijmiddel royaal aan door in de tube te knijpen en het oog zachtjes te deppen.
  4. Scheer een klein (2 cm x 2 cm) gebied op en onder de ingeving van de wervelkolom.
  5. Dien 5 mg/kg carprofen toe uit een verdunde oplossing van 1 mg/ml subcutaan bij het nekvel.
  6. Test de diepte van de anesthesie met de teenknijpreflex door in de achterste teen van de muis te knijpen. Als er geen teenknijpreactie is, bevindt het dier zich in het diepe chirurgische vlak en kan de procedure doorgaan.
  7. Breng betadine aan op het chirurgische gebied en bedek met een chirurgisch gordijn (een gaas met een uitgesneden venster van 2 cm x 2 cm).
  8. Trek met behulp van een tang met rattentanden de huid bij de voorspanning van de rug naar boven en maak een longitudinale incisie van ~ 5 mm.
    OPMERKING: Een huidincisie op deze hoogte op de rug van het dier is het beste voor chirurgische clipplaatsing om de kans te verkleinen dat het dier de clips verwijdert en clipreparaties vereist.
  9. Gebruik een stompe tang om de huid stomp te ontleden weg van de onderliggende spierlaag, naar beneden en naar één kant naar de nier.
  10. Identificeer de nier, eierstok en ovariële vetpad visueel door de spierwand.
    OPMERKING: De nier zal een donkerrode kleur hebben, het vetkussen zal helder wit lijken en indien zichtbaar, zal de eierstok eruit zien als een kleine roze stip in het vetkussen.
  11. Gebruik een tang om de spierlaag vast te pakken en op te tillen. Maak een incisie van ~0,5-1 cm met een scherpe chirurgische schaar. Blijf de spierwand vasthouden met een tang en verander van een schaar naar een stompe tang om het ovariële vetkussen door de incisie te trekken.
  12. Gebruik een gebogen naaldhouder, klem onder de eierstok en eileider aan het distale uiteinde van de baarmoederhoorn.
    OPMERKING: Als alternatief kan alleen de eierstok worden verwijderd, waardoor de eileider intact blijft. Er is echter een ontleedmicroscoop nodig om het onderscheid tussen de eierstok en de eileider nauwkeurig te visualiseren.
  13. Verwijder de eierstok met een schaar of een scalpel. Blijf 30 s klemmen om overmatig bloeden te voorkomen.
  14. Verwijder de klem en dep deze indien nodig met steriel gaas.
  15. Om de spierwandincisie te sluiten, gebruikt u een tang om de bovenkant van de incisie op te tillen, zodat de incisie op natuurlijke wijze samentrekt.
  16. Gebruik zijden hechtingen (maat 3-0) om de spierwandincisie te sluiten met de knoop van een chirurg.
  17. Breng twee tot drie druppels bupivacaïne topisch aan met een spuit van 1 ml zonder naald eraan en herhaal stap 2.9-2.17 aan de andere kant.
  18. Om de huidincisie te sluiten, gebruikt u gaas om het gebied droog te deppen van overtollig bupivacaïne en drukt u de twee zijden van de huid tegen elkaar.
  19. Breng één tot twee chirurgische clips van 7 mm aan, zodat er ruimte is voor zwelling als onderdeel van het genezingsproces.
  20. Beweeg de muis naar een herstelkooi en houd deze gedurende 15 minuten nauwlettend in de gaten.
    OPMERKING: De dieren moeten snel wakker worden; Zorg ervoor dat u de ademhaling nauwlettend in de gaten houdt voor normale thoracale ademhalingspatronen.

3. Hormoonpreparaat: Subcutane injectie

  1. Maak een 1 mg/ml stamoplossing van oestradiol.
    1. Weeg 0,001 g (1 mg) oestradiolpoeder af in een steriele buis van 1,5 ml.
    2. Voeg 1 ml 100% ethanol toe aan de buis en vortex gedurende een paar seconden.
      OPMERKING: De ethanol blijft helder met zichtbare vlekken van oestradiolpoeder.
    3. Wikkel de buis met folie om verdamping van ethanol te voorkomen.
    4. Wikkel de buis in aluminiumfolie en plaats deze een nacht op een wip om het oestradiolpoeder volledig op te lossen.
    5. Verdun deze 1 mg/ml bouillon in sesamolie tot de gewenste eindconcentratie.
      OPMERKING: Doses van 100 ng gedurende 3 dagen zijn vereist voor priming voorafgaand aan kunstmatige decidualisatie, en extra lage doses van 25 ng zijn vereist wanneer progesteron wordt gegeven. Dit is om de feedbacklus te bestrijden die de expressie van progesteronreceptoren regelt. Voor embryotransfer zijn twee doses van 100 ng op dag 1 en dag 3 voorafgaand aan embryotransfer op dag 4 vereist. Op het moment van embryotransfer is ook een lage dosis van 25 ng vereist.
    6. Zuig de vereiste hoeveelheid oestradiol in olie op in een spuit van 1 ml en bevestig vervolgens een naaldpunt van 26 G.
    7. Injecteer de juiste dosis subcutaan (bij het nekvel of de flank; 100 ng/100 μl of 25 ng/100 μl voor priming voorafgaand aan embryotransfer of kunstmatige decidualisatie of op het moment van embryotransfer) met de vereiste frequentie.
      OPMERKING: Olie is erg stroperig, dus zorg ervoor dat u langzaam injecteert en een paar seconden pauzeert voordat u de naald verwijdert. Dit minimaliseert de hoeveelheid olie die uit de injectieplaats lekt.
  2. Maak een 200 mg / ml stockoplossing van progesteron.
    1. Weeg 0,4 g (400 mg) progesteronpoeder af in een steriele buis van 5 ml.
    2. Voeg 2 ml 100% ethanol toe aan de buis en vortex gedurende een paar seconden.
      OPMERKING: De ethanol wordt wit van kleur.
    3. Herhaal stap 3.1.3-3.1.4.
    4. Verdun de 200 mg/ml bouillon in sesamolie tot de gewenste eindconcentratie.
      OPMERKING: Doses van 2 mg per dag zijn nodig voor het ondersteunen van embryotransfer.
    5. Injecteer de juiste dosis (bijv. 2 mg/100 μl per dag ter ondersteuning van de zwangerschap) subcutaan zoals in stap 3.1.6-3.1.7.

4. Hormoonpreparaat: Pellets met langzame afgifte

  1. Leg een folie over het oppervlak van een laminaire stroming of klasse II bioveiligheidskap.
  2. Plaats alle apparatuur (handschoenen, petrischalen, spuiten van 1 ml, fijne tang) in de kap en schakel de UV gedurende 20 minuten in.
    OPMERKING: Schakel de UV niet in met de kit in de kap, omdat deze zal worden ingesteld.
  3. Was de silastische slang in 100% ethanol en laat deze aan de lucht drogen in de kap. Eenmaal droog, markeer ~ 1 cm lengtes langs de slang en snijd met een scalpel.
  4. Verwijder de zuiger uit een spuit en knijp er ~200 μL kit in. Vervang de zuiger en druk een kleine hoeveelheid kit uit de spuit.
  5. Breng een kleine hoeveelheid kit aan op het ene uiteinde van de slang en strijk het glad met een gehandschoende vinger.
  6. Laat een nacht drogen of gedurende 20-30 minuten in UV-licht in de kap.
  7. Giet een geschikte hoeveelheid progesteron in een gesteriliseerde petrischaal. Schep met een tang pellets in het progesteronpoeder om de pellet te vullen.
    1. Tik op het afgesloten uiteinde van de pellet op het oppervlak van de kap om het progesteron te condenseren. Als alternatief, gebruik het uiteinde van de gesteriliseerde tang om het progesteron naar beneden te proppen. Zorg voor voldoende ruimte voor meer kit.
  8. Sluit het open uiteinde af met kit, zoals beschreven in stap 3.4-3.5.
  9. Wikkel de petrischaal met de progesteronkorrels in folie om deze te beschermen tegen licht.
  10. Activeer de pellets gedurende minimaal 72 uur vóór subcutane inbrenging door te incuberen in 1% met houtskool gestripte FCS (cs-FCS: PBS) bij 37 °C.
    OPMERKING: Pellets kunnen vooraf in bulk worden gemaakt met een enkel verzegeld uiteinde. Er moet echter elke keer vers progesteron worden gebruikt om ze te vullen. Zorg ervoor dat de vooraf gemaakte pellets UV-gesteriliseerd zijn voordat ze met progesteron worden gevuld. De pellets zullen ~ 500 μg / dag afscheiden gedurende 6-10 dagen, wat voldoende ondersteuning is voor kunstmatige decidualisatie en embryotransferprocedures, hoewel een extra lage dosis oestrogeeninjectie nodig kan zijn om de progesteronreceptoractiviteit langer dan 4-5 dagen te behouden. Na 10 dagen kan een vervangende progesteronkorrel nodig zijn.

5. Hormoonvoorbereiding: Osmotische minipompjes

  1. Bereid progesteron in de gewenste concentratie in een waterige oplossing en selecteer het juiste mini-osmotische pompmodel (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Voor sectie 7 (experimentele procedure: embryotransfer) is de levering van 2 mg/dag gedurende 12 dagen vereist. Los daarom 28 mg progesteron op in ~ 100 μL steriel water per dier (volg de instructies van de fabrikant voor het specifieke volume). Seriële verdunningen kunnen nodig zijn. Voor sectie 8 (experimentele procedure: kunstmatige decidualisatie) is de levering van 500 μg per dag gedurende 3 dagen vereist. Los daarom 1.500 μg progesteron op in ~100 μL steriel water per dier. Bereid extra oplossing voor om rekening te houden met het volume dat verloren gaat tijdens de vulprocedure.
  2. Plaats de apparatuur (handschoenen, pluisarme doekjes, petrischalen, steriele zoutoplossing, spuiten van 1 ml, kleine weegboten, folie en weegschalen tot 0,01 g nauwkeurig) in een bioveiligheidskap van klasse II en schakel vervolgens de UV gedurende 20 minuten in.
  3. Zuig de hormoonoplossing op in een spuit van 1 ml en bevestig vervolgens een steriele vulbuis, waarbij u er zorgvuldig voor zorgt dat er geen luchtbellen zijn.
  4. Weeg de pomp en de stroommoderator in een steriele weegboot.
  5. Steek de vulbuis door de opening aan de bovenkant van de pomp totdat deze niet meer verder kan.
  6. Houd de pomp rechtop en druk langzaam op de zuiger van de spuit om de buis te vullen.
    OPMERKING: Snel vullen moet worden vermeden, omdat dit luchtbellen in de pomp kan brengen.
  7. Wanneer de oplossing overloopt van de bovenkant van de pomp, verwijdert u voorzichtig de vulbuis en veegt u de overtollige oplossing af met een steriel laagpluis doekje.
  8. Steek de stroommoderator door de opening aan de bovenkant van de pomp totdat deze niet meer verder kan. Eenmaal volledig binnen, drukt u de pomp en de stroommoderator stevig tegen elkaar aan.
  9. Weeg de gevulde pomp af met de stroommoderator op zijn plaats.
    OPMERKING: Het verschil in gewicht verkregen uit stap 5.3 en stap 5.8 geeft het nettogewicht van de geladen oplossing weer (d.w.z. een toename van 0,1 g = 100 μL toegevoegde oplossing).
  10. Plaats de gevulde pomp in een steriele petrischaal gevuld met steriele zoutoplossing.
  11. Zodra alle pompen zijn gevuld, wikkelt u de petrischaal in folie en plaatst u deze in een incubator van 37 °C om ten minste 4-6 uur (of totdat deze klaar is voor gebruik) te primen.

6. Chirurgische procedure: Inbrengen van subcutane hormoonkorrels en minipompen

  1. Bereid het gebied voor volgens sectie 1 (chirurgische voorbereiding).
  2. Verdoof de dieren volgens de stappen 2.1-2.3.
  3. Scheer een klein gebied bij het nekvel (~1 cm x 1 cm).
  4. Dien 5 mg/kg carprofen toe uit een verdunde oplossing van 1 mg/ml subcutaan in de beenflank.
  5. Test op de teenknijpreflex. Als er geen reflex is, bevindt het dier zich in het diepe chirurgische vlak en kan de procedure beginnen.
  6. Breng betadine aan op het chirurgische gebied en bedek het met een chirurgische drape (een gaas met een uitgesneden venster van 2 cm x 2 cm).
  7. Trek met behulp van een tang met rattentanden de huid bij het nekvel (halverwege tussen het echte nekvel en de ingeving van de rug) naar boven en maak een longitudinale incisie van ~ 5 mm.
  8. Met een stompe tang ontleed je de huid weg van de onderliggende spierlaag in neerwaartse richting.
    OPMERKING: Voor het inbrengen van een osmotische minipomp maakt u een zak langs één kant van het dier, zodat de pomp de beweging van het dier niet beperkt of tegen de incisieplaats drukt.
  9. Zodra er voldoende ruimte is gemaakt voor de hormoonpellet of minipomp, gebruikt u een steriele tang om de pellet of minipomp op te pakken en steekt u deze in de onderhuidse zak gemaakt met stompe dissectie.
  10. Om de huidincisie te sluiten, moet u ervoor zorgen dat de pellet of minipomp ver genoeg in de zak zit zodat chirurgische clips deze niet beschadigen.
  11. Topisch aanbrengen van bupivacaïne volgens stap 2.17.
  12. Sluit de wond met één chirurgische clip. Beweeg de muis naar een herstelkooi en houd deze gedurende 15 minuten nauwlettend in de gaten. Omdat dit een korte procedure is, moeten de dieren binnen enkele minuten ambulant zijn.

7. Experimentele procedure: Embryotransfer

  1. Voor ovariëctomie dieren, hormoon-prime 3 dagen voorafgaand aan embryotransfer door een subcutane injectie van 100 ng/100 μL estradiol (stap 3.1).
  2. Een dag voor de embryotransfer worden de dieren hormoonprimen met een subcutane injectie van 2 mg/100 μL medroxyprogesteronacetaat (stap 3.2).
  3. Bereid het gebied voor volgens sectie 1 (chirurgische voorbereiding).
  4. Verdoof de dieren volgens de stappen 2.1-2.3.
  5. Begin de procedure volgens de stappen 2.4-2.10.
  6. Maak onder een ontleedmicroscoop een intra-uterien injectiepunt met een naaldpunt van 26 G.
  7. Pipetteer vijf blastocysten in een M2-mediadruppel en breng deze vervolgens over in de baarmoederhoorn.
  8. Om de spierwandincisie te sluiten, tilt u de bovenkant van de incisie op met een tang, zodat de incisie op natuurlijke wijze samentrekt.
  9. Sluit met zijden hechtingen de plaats van de spierwand met de knoop van een chirurg. Breng druppels bupivacaïne topisch aan.
  10. Herhaal stap 7.5-7.8 aan de andere kant.
  11. Om de huidincisie te sluiten, gebruikt u gaas om het gebied droog te deppen van overtollig bupivacaïne en drukt u de twee zijden van de huid tegen elkaar.
  12. Breng één tot twee chirurgische clips aan, waardoor er ruimte is voor zwelling als onderdeel van het genezingsproces.
    OPMERKING: Als de dieren ovariëctomie ondergaan, zijn exogene hormonen vereist op het moment van embryotransfer. Injecteer progesteron (2 mg) subcutaan of breng een subcutane progesteronpellet of osmotische minipomp in. Om een teveel aan progesteron te bestrijden, is een subcutane injectie van een lage dosis (25 ng / 100 μL) oestrogeen vereist op het moment van embryotransfer.
  13. Draag de muis voorzichtig naar een herstelkooi en houd deze gedurende 15 minuten nauwlettend in de gaten.
    OPMERKING: De dieren moeten snel wakker worden; Zorg ervoor dat u de ademhaling nauwlettend in de gaten houdt voor normale thoracale ademhalingspatronen.

8. Experimentele procedure: kunstmatige decidualisatie

  1. Hormoon-prime de dieren met 100 ng / 100 μL oestradiol op dag 1, dag 2 en dag 3, volgens sectie 3 (hormoonpreparaat: subcutane injectie) 8 dagen voorafgaand aan kunstmatige decidualisatie.
  2. Hormoon-prime de dieren met 5 ng / 100 μL oestradiol op dag 7, dag 8 en dag 9, volgens sectie 3 (hormoonpreparaat: subcutane injectie) 2 dagen voorafgaand aan kunstmatige decidualisatie.
    OPMERKING: De laatste injectie moet minimaal 3 uur (en maximaal 4 uur) vóór de kunstmatige decidualisatieprocedure plaatsvinden.
  3. Hormoonprimedieren met een subcutane progesteronkorrel of mini-osmotische pomp (500 μg/dag), volgens sectie 4, sectie 5, en sectie 8, 2 dagen voorafgaand aan kunstmatige decidualisatie.
  4. Bereid het gebied voor volgens sectie 1 (chirurgische voorbereiding).
  5. Verdoof de dieren volgens de stappen 2.1-2.2.
  6. Test de diepte van de anesthesie met de teenknijpreflex. Als er geen teenknijpreactie is, bevindt het dier zich in het diepe chirurgische vlak en kan de procedure doorgaan.
  7. Plaats de muis in een buikligging, til de staart op en breng langzaam een speculum met een diameter van 6 mm in de vagina in.
  8. Terwijl u de neus van het dier in de verdovingsneuskegel houdt, plaatst u het onderlichaam van het dier tussen de eerste en tweede vinger van de niet-dominante hand. Gebruik de duim om de staart voorzichtig omhoog te duwen om de vaginale opening in het zicht te houden.
  9. Breng 20 μL sesamolie over in één baarmoederhoorn met behulp van een niet-chirurgische embryotransfertip (bevestigd aan een pipet van 20 μL).
    1. Houd de pipet op gelijke hoogte met de vaginale opening, steek de punt in de vagina en door de baarmoederhals in de baarmoederhoorn. Zodra de punt zich in de baarmoederhoorn bevindt, drukt u de punt voorzichtig tegen het endometriumoppervlak (als u de bovenstaande behandelingstechniek gebruikt, wordt deze beweging tegen de tweede vinger gevoeld) en verdrijft u de olie langzaam.
      OPMERKING: Houd de pipetzuiger ingedrukt, wacht 10 s om ervoor te zorgen dat alle olie zich heeft verspreid en verwijder langzaam de overdrachtspunt terwijl u de zuiger ingedrukt houdt.
  10. Verwijder het speculum uit de vagina.
  11. Draag de muis voorzichtig naar de herstelkooi en houd deze gedurende 15 minuten nauwlettend in de gaten.
    OPMERKING: De dieren moeten snel wakker worden. Houd hun ademhaling nauwlettend in de gaten voor normale thoracale ademhalingspatronen.
  12. Beperk de hantering van de dieren en houd ze in een rustige omgeving gedurende 96 uur na de procedure.
    OPMERKING: Harde geluiden of abrupte veranderingen in hun licht- en donkercyclus hebben invloed op het succes van de procedure. Op het moment van weefseldissectie kan de mate van decidualisatiesucces worden gemeten als een verhouding tussen baarmoedergewicht en lichaamsgewicht. De kunstmatige decidualisatieprocedure heeft een slagingspercentage van 80%. Sluit daarom dieren uit die niet decidualiseren en houd hier rekening mee bij het selecteren van steekproefgroottes voor de experimenten.

9. Chirurgische procedure: postoperatief herstel, monitoring en clipreparaties

  1. Laat de dieren een nacht half-op, half-uit warmtekussens herstellen voordat ze terugkeren naar hun thuiskooi.
  2. Controleer de dieren dagelijks gedurende 5 dagen na de operatie, waarbij u goed op de wondplaats let op tekenen van infectie.
  3. Voer indien nodig clipreparatie uit.
    1. Bereid het gebied voor volgens sectie 1 (chirurgische voorbereiding).
    2. Verdoof de dieren volgens de stappen 2.1-2.3.
    3. Verwijder de bestaande clip met een clipverwijderaar als de clip nog aanwezig is.
    4. Breng een nieuwe chirurgische clip aan, volgens de stappen 2.19-2.21.
  4. Verwijder de chirurgische clips 7 dagen na de operatie volgens de stappen 9.3.1-9.3.3 of wanneer het dier de volgende keer onder narcose is (zoals voor een embryotransfer, de kunstmatige decidualisatieprocedure of een subcutane injectie na een operatie).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een goed gekarakteriseerd model van kunstmatige decidualisatie wordt beschreven in dit protocoldocument (figuur 1A). Hier ondergingen jongvolwassen vrouwelijke muizen (8 weken oud) een chirurgische ovariëctomie zoals beschreven in rubriek 1 en rubriek 2. De muizen werden vervolgens gedurende 2 weken uitgerust om ervoor te zorgen dat de endogene ovariële hormonen verdwenen voordat ze werden ondersteund met exogene hormonen zoals beschreven in rubrieken 3-7 en rubriek 9. ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel biedt stapsgewijze instructies voor het uitvoeren van OVX en biedt exogene hormonen voor studies gericht op het begrijpen van de baarmoederbijdragen aan zwangerschap en vruchtbaarheid. Er worden twee gedetailleerde protocollen verstrekt over twee experimentele toepassingen van deze methoden, waaronder het uitvoeren van embryotransfer en het kunstmatig induceren van decidualisatie.

Hoewel het uitvoeren van OVX in eerste instantie een uitdaging kan zijn - vooral voor onderzoekers die...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële of andere belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd mogelijk gemaakt door de Victorian State Government Operational Infrastructure Support en de Australian Government National Health and Medical Research Council (NHMRC) IRIISS. Dit werk werd ondersteund door de Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant aan A.L.W. (Winship-PAG18-0343) om toegang te krijgen tot het Monash Reproductive Services Platform. A.L.W. wordt ondersteund door DECRA-financiering DE21010037 van de Australian Research Council (ARC). J.N.H. en L.R.A. worden ondersteund door een Australian Government Research Training Program Scholarship. L.R.A. wordt ondersteund door een Monash Graduate Excellence Scholarship. K.J.H. wordt ondersteund door een ARC Future Fellowship FT190100265.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
ALZET 1002 mini osmotische pompenBioScientific1002Leveren 0,25 µL/h gedurende 14 dagen. Gebruik voor sectie 7 (Experimentele procedure - Embryo transfer).
ALZET 1003D mini osmotische pompenBioScientific1003DLeveren 1 µL/h gedurende 14 dagen. Gebruik voor sectie 8 (Experimentele procedure - Kunstmatige decidualisatie).
ALZET Reflex 7 mm clipsBioScientific0009971Er kunnen Reflex clips of Michel clips worden gebruikt voor wondsluiting, afhankelijk van voorkeur
ALZET Reflex clip applicatorBioScientific0009974Er kunnen Reflex clips of Michel clips worden gebruikt voor wondsluiting, afhankelijk van voorkeur
ALZET Reflex clip verwijderaarBioScientific0009976Er kunnen Reflex clips of Michel clips worden gebruikt voor wondsluiting, afhankelijk van voorkeur
Bupivicaine injectiePfizerNAVoorraad 0,5%. Gebruik op 0,05% in zoutoplossing
EstradiolSigmaE8875
MeloxicamIliumNAActieve bestanddeel 0,5 mg/mL. Gebruik 3,5 mL per 400 mL kooiwaterfles, of zoals voorgeschreven door de dierenarts van uw instelling.
Michel clipsDanielsNS-000242
Multifunctionele afdichtingsmiddelDow Corning732
Niet-chirurgisch embryo transfer (NSET) apparaatParaTechs60010Bevat een 6 mm speculum. Enkelvoudig gebruik.
ProgesteronSigmaP0130Oplosbaar in ethanol. Gebruik voor  sectie 3 (Hormoonvoorbereiding - subcutane injectie) en  sectie 4 (Hormoonvoorbereiding - slow-release pellets)
ProgesteronSigmaP7556Oplosbaar in water. Gebruik voor sectie 5 (Hormoonvoorbereiding - osmotische mini pompen)
Refresh oogzalfAllerganNA42,5% w/v vloeibare paraffine, 57,3% w/v zachte witte paraffine
Rimadyl CarprofenZoetisNAVoorraad 50 mg/mL. Gebruik op 1 mg/ml (voor een dosis van 5 mg/kg)
Rubberen slangDow Corning508-008Gewassen in 100% ethanol en gesneden in stukken van 1 cm. Binnendiameter 1,57 mm ± 0,23 mm; buitendiameter 3,18 mm ± 0,23 mm; wanddikte 0,81 mm.
SesamolieSigmaS3547
Sofsilk Zijde hechtdraad maat 3-0CovidienGS-832

Referenties

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248(2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809(2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378(2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Kunstmatige decidualisatieembryo transferexogene hormoontoedieningsubcutane injectieprogesteronpelletsendometriumreceptiviteituterushoorn
Methoden voor het bestuderen van baarmoederbijdragen aan zwangerschapsinstelling in een ovariectomiemodel
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.