Methodenartikel

Detectie en kwantificering van calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) in menselijk plasma met behulp van een gemodificeerde enzymgebonden immunosorbent assay

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64775

⸱

16 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Otolaryngology-Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Virginia Commonwealth University School of Medicine, 3Department of Oncology, The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, University of Michigan Medical School, 5Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, The Ohio State University College of Medicine, 6ICTR Clinical Research Core Laboratory, Johns Hopkins University School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Gepubliceerde gegevens met betrekking tot calcitonine gen-gerelateerde peptide (CGRP) concentraties in menselijk plasma zijn inconsistent. Deze inconsistenties kunnen te wijten zijn aan het ontbreken van een gestandaardiseerde, gevalideerde methodologie om dit neuropeptide te kwantificeren. Hier beschrijven we een gevalideerd enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protocol om CGRP in menselijk plasma te zuiveren en te kwantificeren.

Samenvatting

Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) is een vasoactief neuropeptide dat een vermeende rol speelt in de pathofysiologie van migraine en kan een kandidaat zijn voor de status van biomarker. CGRP komt vrij uit neuronale vezels bij activering en induceert steriele neurogene ontsteking en arteriële vaatverwijding in de vasculatuur die trigeminus efferente innervatie ontvangt. De aanwezigheid van CGRP in de perifere vasculatuur heeft geleid tot onderzoek om dit neuropeptide in menselijk plasma te detecteren en te kwantificeren met behulp van proteomische assays, zoals de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). De halfwaardetijd van 6,9 min en de variabiliteit in technische details van testprotocollen, die vaak niet volledig worden beschreven, hebben echter inconsistente CGRP ELISA-gegevens in de literatuur opgeleverd. Hier wordt een aangepast ELISA-protocol voor de zuivering en kwantificering van CGRP in menselijk plasma gepresenteerd. De procedurele stappen omvatten monsterverzameling en -bereiding, extractie met behulp van een polair sorptiemiddel als zuiveringsmiddel, aanvullende stappen om niet-specifieke binding te blokkeren en kwantificering via ELISA. Verder is het protocol gevalideerd met spike en herstel en lineariteit van verdunningsexperimenten. Dit gevalideerde protocol kan theoretisch worden gebruikt om CGRP-concentraties in het plasma van personen te kwantificeren, niet alleen met migraine, maar ook met andere ziekten waarbij CGRP een rol kan spelen.

Inleiding

Calcitonine gen-gerelateerd peptide (CGRP) is een 37-aminozuur neuropeptide dat aanwezig is in neuronale vezels met perivasculaire lokalisatie en niet-neuronale weefsels. De twee vormen van CGRP, α- en β-CGRP, delen meer dan 90% homologie en delen fysiologische functies; αCGRP wordt echter aangetroffen in het centrale en perifere zenuwstelsel, terwijl βCGRP wordt aangetroffen in het enterische zenuwstelsel 1,2. Bij activering van nociceptoren en calciumafhankelijke exocytose komt CGRP vrij uit neuronen, waardoor steriele neurogene ontsteking met arteriële vasodilatatie en plasma-eiwitextravasatie wordt geïnduceerd 3,4,5,6,7. Vanaf hier verschijnt CGRP in de postcapillaire vaten en kan het een biomarker zijn voor ziekten die afferente nociceptieve activering veroorzaken, zoals migraine 8,9,10,11. Van belang is dat CGRP ook betrokken is bij COVID-19 door zijn rol in angiogenese en immuunmodulatie, en kan een ongunstige ziekte-evolutie voorspellen12,13. Een protocol voor de nauwkeurige kwantificering van CGRP in menselijk plasma zou dus een brede waarde kunnen hebben.

De meeste aandacht is misschien wel besteed aan de rol van CGRP bij migraine. Op basis van preklinische en klinische studies is CGRP naar voren gebracht als een mogelijke biomarker voor migraine en als een doelwit voor behandeling 3,4,5,6,7,8,9,10. Sommige studies hebben een verhoging van CGRP gevonden in cohorten met episodische migraine ten opzichte van controledeelnemers10,14,15. Het succes van CGRP-remmers in klinische onderzoeken voor de behandeling van migrainehoofdpijn lijkt verhoogde CGRP te impliceren als een oorzakelijke factor voor migrainehoofdpijn. Niet alle onderzoekers hebben deze resultaten echter bevestigd16,17,18,19. Bovendien moet de rol van CGRP bij niet-hoofdpijnsymptomen van migraine nog worden opgehelderd; het huidige werk werd gemotiveerd door een verlangen om de rol van CGRP bij vestibulaire symptomen van migraine te begrijpen.

Inconsistente CGRP-immunoassaygegevens in de literatuur kunnen verschillende oorzaken hebben. Ten eerste is de halfwaardetijd van CGRP in de perifere vasculatuur 6,9 min 20, vanwege de activiteit van serineproteasen 21, insulineafbrekende enzymen en andere metalloproteasen 22, neutrale endopeptidasen 23 en endotheline-converterend enzym-1 24. Ten tweede worden de variabele technische details van de immunoassays die worden gebruikt om CGRP te kwantificeren niet volledig beschreven in dergelijke studies. Ten slotte compliceert het gebrek aan standaardisatie van de immunoassay-methodologie het beeld nog meer.

Dit artikel beschrijft een gemodificeerd enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) protocol dat de zuivering en nauwkeurige kwantificering van α- en βCGRP in menselijk plasma mogelijk maakt. De antilichamen van de kit zijn niet kruisreactief met amyline, calcitonine of stof P. Dit protocol heeft de nodige validatie-experimenten ondergaan, zoals spike en herstel en lineariteit van verdunning, waarvan de gegevens hier worden gepresenteerd. Zo'n CGRP ELISA-protocol dat validatie heeft ondergaan, is nog niet eerder volledig beschreven in de literatuur. Dit protocol kan worden gebruikt om CGRP in menselijk plasma te kwantificeren in de context van migraine, evenals cardiologische2,25, dermatologische 26, verloskundige 27, reumatologische28,29, musculoskeletale 30,31, endocriene 32,33 en virale ziekten 12,13 waarbij CGRP betrokken is geweest.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is ontwikkeld met behulp van menselijke plasmamonsters van personen met toestemming met goedkeuring van de Johns Hopkins Institutional Review Board (NA_00092491).

1. Monsterverzameling en -bereiding

  1. Verzamel 5 ml volbloed uit de antecubitale ader via standaard venapunctiemethoden34 in een 6 ml vacutainer ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) verzamelbuis.
  2. Voeg na verzameling 0,5 ml aprotinine (10.000 KIU / ml) concurrerende serineproteaseremmer toe aan de buis om de lysis van het doelpeptide te blokkeren. Keer de buis 10 keer om om de aprotinine voldoende te laten mengen met het bloed. Bewaar daarna de buizen op ijs tot de volgende stap.
  3. Centrifugeer de buis bij 604 x g gedurende 4 minuten bij 4 °C binnen 60 minuten na bloedafname.
  4. Verwijder de plasmafractie met een pipet en breng over op 2 ml steriele cryovialen met ronde bodem.
  5. Bewaar de cryovialen onmiddellijk bij -80 °C gedurende maximaal 2 weken.

2. Extractie van de plasmamonsters

  1. Plaats een extractiepatroon in een conische centrifugebuis van 15 ml met de buitenste ribbels van de patroon ondersteund door de buitenste ribbels van de buis.
  2. Activeer de patroon door eerst 5 ml 100% methanol en vervolgens 10 ml ultrapuur water door de patroon te laten lopen.
    1. Terwijl vloeistof door de cartridge wordt geleid via door zwaartekracht aangedreven stroming, zal deze zich verzamelen in de buis.
    2. Gooi overtollige vloeistof weg terwijl deze zich ophoopt om ervoor te zorgen dat de vloeistof de patroon niet overspoelt.
    3. Zorg ervoor dat de patroon niet droogt tijdens het experiment.
  3. Verdun 250 μL plasma met 750 μL 4% azijnzuur.
  4. Laat de 1 ml plasma en azijnzuuroplossing langzaam door de patroon lopen.
    OPMERKING: Deze stap duurt ongeveer 30 s via door zwaartekracht aangedreven stroom voor elke gepasseerde milliliter.
  5. Was de patroon met 10 ml 4% azijnzuur. Zoals eerder gedaan, gooi de overtollige vloeistof weg terwijl deze zich ophoopt om ervoor te zorgen dat de vloeistof de patroon niet overspoelt.
  6. Nadat de laatste druppel azijnzuur uit de patroon is vrijgegeven, verwijdert u de patroon uit de buis en plaatst u deze in een nieuwe conische centrifugebuis van 15 ml.
  7. Bereid een 10:1 oplossing van 100% methanol en 4% azijnzuur door 2,7 ml 4% azijnzuur en 0,3 ml 100% methanol te mengen. Gebruik dit om de CGRP te elueren door deze oplossing 1 ml per keer door de patroon te laten gaan. Pauzeer gedurende 25 minuten tussen elke milliliter oplossing die wordt doorgegeven. Gooi het eluent NIET weg.
  8. De buis bevat 3 ml van de geëlueerde vloeistof 25 minuten nadat de laatste milliliter van de methanol- en azijnzuuroplossing is gepasseerd. Plaats elke 1 ml van het eluent in een microcentrifugebuis van 1,7 ml.
    OPMERKING: Dit zou drie microcentrifugebuizen van elke patroon moeten opleveren.
  9. Plaats elke buis gedurende 1 s in een minicentrifuge om ervoor te zorgen dat al het eluent zich op de bodem van elke buis bevindt.
  10. Droog alle monsters door vacuümcentrifugatie bij 4 °C (ingesteld op concentratorfunctie, voor waterige oplossingen, bij 1.400 tpm; de g-kracht varieert afhankelijk van de positie van de buizen en varieert daarom van 130-250 x g).
    OPMERKING: De tijd die de vacuümcentrifuge nodig heeft om de monsters te drogen, is afhankelijk van het type microcentrifugebuis dat wordt gebruikt.
  11. Reconstitueert onmiddellijk voordat u overgaat tot de testprocedure (stap 4.1) het eerder gedroogde monster met enzymimmunoassaybuffer (EIA) (zie tabel met materialen) ontdooid tot kamertemperatuur (RT) of 20 °C.
    OPMERKING: Het volume EIA-buffer dat wordt gebruikt om het gedroogde monster te reconstitueren, moet gelijk zijn aan het oorspronkelijke monstervolume of 250 μL.

3. Voorbereiding van de ELISA-plaat - blokkering om niet-specifieke binding te beperken

  1. Voeg 250 μL tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)/visgelatine blokkerende buffer toe aan elk putje op het bord.
  2. Leg een afdekvel over de plaat en incubeer gedurende 2 uur bij RT.
  3. Verwijder het afdekblad en maak de plaat leeg door inversie of aspiratie met behulp van een meerkanaalspipet. Dep de plaat vervolgens op een papieren handdoek om elk spoor van vloeistof weg te gooien.
  4. Droog de plaat door de plaat 10 minuten in een laminaire flowkap te laten staan.
  5. Nadat de plaat zichtbaar droog is, plaatst u deze in een met grip afgesloten foliezakje met een silicagel droogmiddelzakje en bewaart u het zakje gedurende 24 uur bij -20 °C.
    OPMERKING: De platen moeten binnen 4 weken na incubatie van de plaat worden gebruikt.

4. Voorafgaand aan de testprocedure

  1. Bereid reagentia voor (EIA-buffer, CGRP-standaard, CGRP-kwaliteitscontrole, CGRP-tracer, wasbuffer) volgens de instructies van de kit. Bereid Ellman's reagens pas voor nadat de incubatietijd van 16-20 uur is afgelopen.
  2. Ontdooi alle monsters en reagentia tot RT voordat u de rest van het protocol uitvoert.

5. Testprocedure

  1. Spoel elk putje in de verstopte plaat vijf keer af met een wasbuffer (300 μL/put). Pauzeer voor elke spoeling 30 s na het plaatsen van de wasbuffer in de putjes en gooi de vloeistof of het aspiraat eruit met behulp van een meerkanaalspipet.
  2. Verwijder na de laatste spoeling alle buffer uit de putten door inversie (het omkeren van de plaat om de vloeistof in putten te verdrijven) of aspiratie met behulp van een meerkanaalspipet. Dep de laatste druppels op keukenpapier en tik op de omgekeerde plaat totdat alle vloeistof zichtbaar uit de putjes is verwijderd.
  3. Zet ten minste twee putten zonder reagentia of buffer opzij om bekend te staan als "Blanke" putten. Zet vervolgens ten minste twee andere putten opzij voor niet-specifieke binding (NSB).
  4. Doseer 100 μL EIA-buffer in elke NSB-put.
  5. Doseer 100 μL van de CGRP-normen in tweevoud in geschikte putten.
  6. Doseer 100 μL monsters (gereconstitueerd in EIA-buffer) en kwaliteitscontrole in tweevoud in geschikte putten.
  7. Doseer 100 μL CGRP-tracer (anti-CGRP-antilichaam gehecht aan acetylcholinesterase) aan elke put met NSB-, CGRP-normen, monsters en kwaliteitscontrole. Geef geen tracer af aan de "Blank" putten.
  8. Bedek de plaat met een doorzichtig afdekvel en sluit elke put zodanig af dat de monsters en reagentia in elke put niet significant verdampen. Incubeer de plaat gedurende 16-20 uur bij 4 °C.
  9. Nadat de incubatie is voltooid, reconstitueert u het reagens van de Ellman volgens de instructies van de kit.
  10. Keer de plaat om om alle vloeistof te verwijderen. Spoel elk putje (zoals hierboven beschreven) drie keer af met 300 μL wasbuffer.
  11. Verwijder na de derde spoeling de vloeistof van de platen, plaats de plaat op een schudplaat en schud gedurende 2 minuten bij 120 tpm.
  12. Was het bord nog eens drie keer. Verwijder na de laatste spoeling alle buffer uit de putten door inversie of aspiratie met behulp van een meerkanaalspipet. Dep de laatste druppels vloeistof op een papieren handdoek en tik op de omgekeerde plaat totdat alle vloeistof zichtbaar uit de putjes is verwijderd.
    OPMERKING: De drie extra wasbeurten die in deze stap worden beschreven, zijn mogelijk niet nodig als u een ELISA-microplaatwasser gebruikt.
  13. Doseer 200 μL Ellman's reagens in elke put (exclusief de "Blank" putjes).
  14. Bedek de plaat met een nieuw afdekvel en wikkel het in aluminiumfolie om blootstelling aan licht te voorkomen. Incubeer in het donker bij RT gedurende 1 uur.
  15. Zorg ervoor dat er geen vloeistof aan de achterkant van de plaat zit die de aflezing van de spectrofotometer kan verstoren door de achterkant af te vegen met een droge papieren handdoek.
  16. Lees de plaat voor absorptie bij 405 nm (gele kleur).

6. Data-analyse

  1. Bereken de gemiddelde absorptie voor elke "Blank", NSB, standaard, kwaliteitscontrole en de monsters.
  2. Trek de gemiddelde absorptiewaarden van de NSB af van de standaard-, kwaliteitscontrole- en monsterabsorptiewaarden.
  3. Plot absorptie op de y-as en concentratie op de x-as. Construeer een standaardcurve met behulp van een logistisch regressiemodel met vier parameters.
  4. Zodra de curve is geconstrueerd, gebruikt u de vergelijking van de curve om de geïnterpoleerde concentraties te bepalen voor kwaliteitscontrole en monsters, die op de x-as kunnen worden gelezen.
    OPMERKING: De standaardcurve wordt alleen gevalideerd als de berekende geïnterpoleerde concentratie voor de kwaliteitscontrole binnen 25% van de verwachte concentratie ligt (meestal 125 pg/ml, maar zie het etiket van de injectieflacon voor kwaliteitscontrole).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Er zijn verschillende belangrijke stappen in het protocol die moeten worden benadrukt. Ten eerste moet aprotinine, een serineproteaseremmer, onmiddellijk na het verzamelen aan volbloedmonsters worden toegevoegd om verdere enzymatische afbraak van CGRP te voorkomen. Van serineproteasen is aangetoond dat ze een rol spelen in het CGRP-metabolisme en een eerdere studie heeft ook aprotinine gebruikt bij het kwantificeren van CGRP bij mensen21,35. Als proteaseremmers n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel beschrijft een gevalideerd protocol dat de detectie en kwantificering van CGRP in menselijk plasma mogelijk maakt. Dit protocol werd gesynthetiseerd nadat commerciële CGRP ELISA-kits dit molecuul niet nauwkeurig bleken te kwantificeren. Na het vaststellen van een monstervoorbereidingsprotocol en een geldige standaardcurve, toonden spike- en herstel- en lineariteitsexperimenten aan dat het percentage terugvorderingen veel lager was dan verwacht. Vergelijkbare resultaten werden gevonden met behulp van een ander...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen verdere onthullingen toe te voegen.

Dankbetuigingen

We willen Robert N. Cole, Lauren R. DeVine en Marcos Iglesias bedanken voor hun nuttige discussies over dit protocol. Dit werd gedeeltelijk ondersteund door financiering van de American Otological Society (Fellowship Grant, PSK), de American Hearing Research Foundation (90066548 / 90072266, JPC) en het National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH) en NIH Roadmap for Medical Research (UL1 TR003098, NSF). De inhoud van de publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de Johns Hopkins ICTR, NCATS of NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.7 mL Safeseal microcentrifuge tubeSorenson Bioscience, Inc.11510
99% methanolThermoFisher ScientificL13255.0F
15 mL conical centrifuge tubeFalcon14-959-49B
2 mL round bottom sterile cryovialsCRYO.S122263
4% acetic acidThermoFisher Scientific035572.K2
6.0 mL Vacutainer EDTA collection tubeBD367863
Allegra 64R benchtop centrifugeBeckman Coulter, Inc.367586
AprotininVWR76344-814
CGRP (human) ELISA kitBertin BioreagentA05481
CGRP stockBertin Bioreagent
EIA BufferBertin BioreagentA07000
Ellman's ReagentBertin BioreagentA09000_49+1
Multichannel pipettesThermoFisher Scientific4661180N
Oasis HLB 3 cc Vac CartridgesWatersWAT094226
Orbital ShakerBellco7744-01010
Precision micropipettesThermoFisher ScientificF144055MG
SpectraMax M Series Multi-Mode Microplate readerMolecular DevicesPart Number M2
TBS/Fish GelatinBioworld, from Fischer Scientific50-199-167
Ultrapure water ELISA GradeBertin BioreagentA07001
Vacufuge plus - Centrifuge ConcentratorEppendorf22820109
Wash BufferBertin BioreagentA17000

Referenties

  1. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. -J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  2. Brain, S. D., Grant, A. D. Vascular actions of calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin. Physiological Reviews. 84 (3), 903-934 (2004).
  3. Edvinsson, L., Ekman, R., Jansen, I., McCulloch, J., Uddman, R. Calcitonin gene-related peptide and cerebral blood vessels: distribution and vasomotor effects. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 7 (6), 720-728 (1987).
  4. Donnerer, J., Stein, C. Evidence for an increase in the release of CGRP from sensory nerves during inflammation. Annals of the New York Academy of Sciences. 657, 505-506 (1992).
  5. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Release of vasoactive peptides in the extracerebral circulation of humans and the cat during activation of the trigeminovascular system. Annals of Neurology. 23 (2), 193-196 (1988).
  6. Markowitz, S., Saito, K., Moskowitz, M. A. Neurogenically mediated leakage of plasma protein occurs from blood vessels in dura mater but not brain. The Journal of Neuroscience. 7 (12), 4129-4136 (1987).
  7. Saito, K., Markowitz, S., Moskowitz, M. A. Ergot alkaloids block neurogenic extravasation in dura mater: proposed action in vascular headaches. Annals of Neurology. 24 (6), 732-737 (1988).
  8. Lassen, L. H., et al. CGRP may play a causative role in migraine. Cephalalgia. 22 (1), 54-61 (2002).
  9. Cady, R. K., Vause, C. V., Ho, T. W., Bigal, M. E., Durham, P. L. Elevated saliva calcitonin gene-related peptide levels during acute migraine predict therapeutic response to rizatriptan. Headache. 49 (9), 1258-1266 (2009).
  10. Cernuda-Morollón, E., et al. Interictal increase of CGRP levels in peripheral blood as a biomarker for chronic migraine. Neurology. 81 (14), 1191-1196 (2013).
  11. Messlinger, K. The big CGRP flood-sources, sinks and signalling sites in the trigeminovascular system. The Journal of Headache and Pain. 19, 22(2018).
  12. Ochoa-Callejero, L., et al. Circulating levels of calcitonin gene-related peptide are lower in COVID-19 patients. Journal of the Endocrine Society. 5 (3), (2021).
  13. Rizzi, M., et al. CGRP plasma levels correlate with the clinical evolution and prognosis of hospitalized acute COVID-19 patients. Viruses. 14 (10), 2123(2022).
  14. Goadsby, P. J., Edvinsson, L., Ekman, R. Vasoactive peptide release in the extracerebral circulation of humans during migraine headache. Annals of Neurology. 28 (2), 183-187 (1990).
  15. Sarchielli, P., et al. Clinical-biochemical correlates of migraine attacks in rizatriptan responders and non-responders. Cephalalgia. 26 (3), 257-265 (2006).
  16. Greco, R., et al. Plasma levels of CGRP and expression of specific microRNAs in blood cells of episodic and chronic migraine subjects: towards the identification of a panel of peripheral biomarkers of migraine. The Journal of Headache and Pain. 21 (1), 122(2020).
  17. Tvedskov, J. F., et al. No increase of calcitonin gene-related peptide in jugular blood during migraine. Annals of Neurology. 58 (4), 561-568 (2005).
  18. Pellesi, L., et al. Plasma levels of CGRP during a 2-h infusion of VIP in healthy volunteers and patients with migraine: An exploratory study. Frontiers in Neurology. 13, 871176(2022).
  19. Kruuse, C., Iversen, H. K., Jansen-Olesen, I., Edvinsson, L., Olesen, J. Calcitonin gene-related peptide (CGRP) levels during glyceryl trinitrate (GTN)-induced headache in healthy volunteers. Cephalalgia. 30 (4), 467-474 (2010).
  20. Kraenzlin, M. E., Ch'ng, J. L., Mulderry, P. K., Ghatei, M. A., Bloom, S. R. Infusion of a novel peptide, calcitonin gene-related peptide (CGRP) in man. Pharmacokinetics and effects on gastric acid secretion and on gastrointestinal hormones. Regulatory Peptides. 10 (2-3), 189-197 (1985).
  21. Brain, S. D., Williams, T. J. Substance P regulates the vasodilator activity of calcitonin gene-related peptide. Nature. 335 (6185), 73-75 (1988).
  22. Kim, Y. -G., Lone, A. M., Nolte, W. M., Saghatelian, A. Peptidomics approach to elucidate the proteolytic regulation of bioactive peptides. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (22), 8523-8527 (2012).
  23. Katayama, M., et al. Catabolism of calcitonin gene-related peptide and substance P by neutral endopeptidase. Peptides. 12 (3), 563-567 (1991).
  24. Hartopo, A. B., et al. Endothelin-converting enzyme-1 gene ablation attenuates pulmonary fibrosis via CGRP-cAMP/EPAC1 pathway. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 48 (4), 465-476 (2013).
  25. Mair, J., et al. Plasma CGRP in acute myocardial infarction. Lancet. 335 (8682), 168(1990).
  26. Antúnez, C., et al. Calcitonin gene-related peptide modulates interleukin-13 in circulating cutaneous lymphocyte-associated antigen-positive T cells in patients with atopic dermatitis. The British Journal of Dermatology. 161 (3), 547-553 (2009).
  27. Gangula, P. R., et al. Pregnancy and steroid hormones enhance the vasodilation responses to CGRP in rats. The American Journal of Physiology. 276 (1), H284-H288 (1999).
  28. Hernanz, A., Medina, S., de Miguel, E., Martín-Mola, E. Effect of calcitonin gene-related peptide, neuropeptide Y, substance P, and vasoactive intestinal peptide on interleukin-1beta, interleukin-6 and tumor necrosis factor-alpha production by peripheral whole blood cells from rheumatoid arthritis and osteoarthritis patients. Regulatory Peptides. 115 (1), 19-24 (2003).
  29. Takeba, Y., Suzuki, N., Kaneko, A., Asai, T., Sakane, T. Evidence for neural regulation of inflammatory synovial cell functions by secreting calcitonin gene-related peptide and vasoactive intestinal peptide in patients with rheumatoid arthritis. Arthritis and Rheumatism. 42 (11), 2418-2429 (1999).
  30. Ahmed, M., Srinivasan, G. R., Theodorsson, E., Schultzberg, M., Kreicbergs, A. Effects of surgical denervation on substance P and calcitonin gene-related peptide in adjuvant arthritis. Peptides. 16 (4), 569-579 (1995).
  31. Neugebauer, V., Rümenapp, P., Schaible, H. G. Calcitonin gene-related peptide is involved in the spinal processing of mechanosensory input from the rat's knee joint and in the generation and maintenance of hyperexcitability of dorsal horn-neurons during development of acute inflammation. Neuroscience. 71 (4), 1095-1109 (1996).
  32. Wang, L. H., et al. Serum levels of calcitonin gene-related peptide and substance P are decreased in patients with diabetes mellitus and coronary artery disease. The Journal of International Medical Research. 40 (1), 134-140 (2012).
  33. Zelissen, P. M., Koppeschaar, H. P., Lips, C. J., Hackeng, W. H. Calcitonin gene-related peptide in human obesity. Peptides. 12 (4), 861-863 (1991).
  34. World Health Organization. WHO Guidelines on Drawing Blood: Best Practices in Phlebotomy. 3, Blood-sampling systems. World Health Organization. , Geneva. (2010).
  35. Raffaelli, B., et al. Plasma calcitonin gene-related peptide (CGRP) in migraine and endometriosis during the menstrual cycle. Annals of Clinical and Translational Neurology. 8 (6), 1251-1259 (2021).
  36. Andreasson, U., et al. A practical guide to immunoassay method validation. Frontiers in Neurology. 6, 179(2015).
  37. Messlinger, K., et al. CGRP measurements in human plasma-a methodological study. Cephalalgia: An International Journal of Headache. 41 (13), 1359-1373 (2021).
  38. Sakamoto, S., et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantitative/qualitative analysis of plant secondary metabolites. Journal of Natural Medicines. 72 (1), 32-42 (2018).
  39. Lee, J. -E., Kim, S. Y., Shin, S. -Y. Effect of repeated freezing and thawing on biomarker stability in plasma and serum samples. Osong Public Health and Research Perspectives. 6 (6), 357-362 (2015).
  40. Fan, P. -C., Kuo, P. -H., Lee, M. T., Chang, S. -H., Chiou, L. -C. Plasma calcitonin gene-related peptide: A potential biomarker for diagnosis and therapeutic responses in pediatric migraine. Frontiers in Neurology. 10, 10(2019).
  41. Raffaelli, B., et al. Change of CGRP plasma concentrations in migraine after discontinuation of CGRP-(receptor) monoclonal antibodies. Pharmaceutics. 15 (1), 293(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CGRP kwantificeringGemodificeerde ELISAZuivering van plasmaVastestofextractieMigrainebiomarkerBlokeringsbufferAspecifieke bindingEnzymimmuunoassay

Gerelateerde artikelen