Hier beschrijven we een methode voor de real-time detectie van apoplastische reactieve zuurstofsoorten (ROS) productie in rijstweefsels in pathogeen-geassocieerde moleculaire patroon-getriggerde immuunrespons. Deze methode is eenvoudig, gestandaardiseerd en genereert zeer reproduceerbare resultaten onder gecontroleerde omstandigheden.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Real-time detectie van reactieve zuurstofsoortenproductie in immuunrespons in rijst met een chemiluminescentietest
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) spelen een vitale rol in een verscheidenheid aan biologische processen, waaronder het detecteren van abiotische en biotische spanningen. Bij pathogene infectie of uitdaging met pathogeen-geassocieerde chemicaliën (pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen [PAMPs]), wordt een reeks immuunresponsen, waaronder een ROS-burst, snel geïnduceerd in planten, die PAMP-getriggerde immuniteit (PTI) wordt genoemd. Een ROS-burst is een kenmerkende PTI-respons, die wordt gekatalyseerd door een groep plasmamembraan-gelokaliseerde NADPH-oxidasen - de RBOH-familie-eiwitten. De overgrote meerderheid van ROS bestaat uit waterstofperoxide (H 2 O2), dat gemakkelijk en gestaag kan worden gedetecteerd met een op luminol gebaseerde chemiluminescentiemethode. Chemiluminescentie is een fotonenproducerende reactie waarbij luminol, of zijn derivaat (zoals L-012), een redoxreactie met ROS ondergaat onder invloed van een katalysator. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde op L-012 gebaseerde chemiluminescentiemethode om apoplast ROS-productie in realtime te detecteren bij PAMP-elicitatie in rijstweefsels. De methode is eenvoudig, stabiel, gestandaardiseerd en zeer reproduceerbaar onder stevig gecontroleerde omstandigheden.
Inleiding
Reactieve zuurstofsoorten (ROS) omvatten een reeks chemisch actieve zuurstofderivaten, waaronder superoxide-anionradicalen (O2-) en zijn derivaten, hydroxylradicalen (OH-), waterstofperoxide en producten van singletzuurstof of oxidatie-reductiereacties, die voortdurend worden geproduceerd in plastiden en chloroplasten, mitochondriën, peroxisomen en andere subcellulaire locaties1 . ROS spelen een belangrijke rol in veel biologische processen en zijn essentieel voor alle planten 2,3,4. Het brede spectrum van ROS-functies varieert van de regulatie van groei en ontwikkeling tot de perceptie van abiotische en biotische spanningen 5,6,7,8.
In het immuunsysteem van de plant nemen plantencelplasmamembraan-gelokaliseerde receptoren - zogenaamde patroonherkenningsreceptoren (PRR's) - pathogeen-afgeleide chemicaliën-pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMP's) waar. Deze herkenning veroorzaakt een reeks snelle immuunresponsen, waaronder calciuminstroom, ROS-burst en MAPK-cascade; daarom wordt deze laag van immuniteit PAMP-getriggerde immuniteit (PTI) genoemd. ROS-burst is een kenmerkende PTI-respons, waarvan de bepaling op grote schaal wordt toegepast op PTI-gerelateerde studies 9,10. ROS-productie veroorzaakt door PAMP's wordt toegeschreven aan plasmamembraan-residente NADPH-oxidase, of respiratoire burst-oxidasehomologe (RBOH) familie-eiwitten, die elektronen overbrengen van cytosolische NADPH of NADH naar extracellulaire zuurstof om superoxide (O 2-) te produceren dat spontaan wordt omgezet in waterstofperoxide (H 2 O 2) door superoxidedismutase 8 . PAMP-getriggerde ROS-burst is vrij snel, verschijnt slechts een paar minuten na PAMP-behandeling en piekt op ~ 10-12 min. De overgrote meerderheid van de ROS-moleculen bestaat uit waterstofperoxide (H 2 O2), dat gemakkelijk en gestaag kan worden gedetecteerd met een chemiluminescentietest.
Bij chemiluminescentie reageert het chemiluminescentiereagens met actieve zuurstof, onder invloed van een katalysator, om de aangeslagen toestandstussenproducten te produceren. Vervolgens keren de elektronen in het product terug naar de grondtoestand door niet-stralingsovergang en zenden fotonen uit. Veel voorkomende chemiluminescentiereagentia zijn luminol en L-012, waarbij luminol de toepassing domineert11,12,13. Meer onderzoekers kiezen echter voor L-012 om ros-productie te detecteren, omdat L-012 een veel hogere lichtemissie-efficiëntie heeft onder neutrale of bijna neutrale pH-omstandigheden in vergelijking met luminol.
Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde chemiluminescentiemethode, gebaseerd op L-012, voor de real-time detectie van ROS-productie na de elicitatie van PAMPs in rijst (Oryza sativa) weefselbladschijven en schede. De hier aangeboden methode is eenvoudig, stabiel en gestandaardiseerd en is zeer aanpasbaar om aan verschillende experimentele behoeften te voldoen. De gegevens die met deze methode worden verkregen, zijn in hoge mate reproduceerbaar onder stevig gecontroleerde omstandigheden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
OPMERKING: Het protocol is van toepassing op verschillende plantenweefsels. Rijstschede en bladschijven werden in dit protocol gebruikt voor ROS-detectie bij PAMP-elicitatie. Aangezien verschillen voornamelijk ontstaan als gevolg van de bemonsteringsmethode, worden hieronder alleen de gemeenschappelijke procedures beschreven, waarbij waar nodig specifieke stappen worden vermeld.
1. Plantencultuur
- Steriliseer de ontpelde rijstzaden met 70% ethanol gedurende 1 minuut, vervolgens met 40% natriumhypochloriet (NaClO) gedurende 1 uur. Spoel de zaden vervolgens 5x af met steriel water om achtergebleven chloor te verwijderen.
- Breng de zaden aseptisch op 1/2 MS medium (2,37 g/L Murashige en Skoog (MS) medium, 30 g/L sucrose, 2,1 g/L phytagel, pH 5,7, autoclaaf).
- Bij de rijstmantelmethode kunt u de zaden direct in het steriele glazen vat met MS-medium plaatsen.
- Plaats in de bladschijfmethode de zaden gedurende 5-7 dagen op MS-platen en verplant ze naar de groeimatrix of de grond (figuur 1A).
- Kweek de zaailingen in een groeiruimte met een 12 h licht/12 h donkere fotoperiode.
2. Weefselvoorbereiding en voorbehandeling
- Rijstschede
- Snijd de schede van 10 dagen oude rijstzaailingen in segmenten van 3 mm met een scherp scheermesje of chirurgisch mesje voor voorbehandeling 1 dag voor de ROS-test (figuur 1B).
- Plaats vijf mantelsegmenten in een individuele put van een 96-well microtiterplaat met 100 μL ddH 2 O gedurende10-12 uur, in het donker bij 25 °C, waardoor wondletselgerelateerde ionenlekkage en afweerreacties kunnen afnemen (figuur 2).
OPMERKING: Het verticaal houden van de sneden om een consistent snijoppervlak te garanderen dat wordt blootgesteld aan de elicitatieoplossing is een belangrijke stap om zeer reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Beweeg de segmenten voorzichtig. Maak geen extra snijwonden of wonden op de segmenten, die een bron van gegevensvariatie kunnen zijn. In principe moet elke test ten minste vijf replicaties bevatten, omdat de variatie van de ROS-waarde groot is. Hoe meer replica's worden ingesteld, hoe betrouwbaarder de gegevens zijn.
- Bladschijf
- Snijd de bladschijven (4 mm in diameter) van 4-6 weken oude rijstplanten met behulp van een biopsiepons met een zuiger. Snijd altijd bladschijven uit het middelste derde deel van het tweede blad (genummerd vanaf de bovenkant) van de hoofdhelmstok om de gegevensvariatie te verminderen (figuur 1C).
- Plaats één bladschijf in een individuele put van een 96-well microtiterplaat met 100 μL ddH 2 O gedurende 10-12 uur voor voorbehandeling, waardoor wondgerelateerde reacties kunnen afnemen omdat deze de inductie van ROS door PAMPs kunnen verstoren (figuur 2).
OPMERKING: Bedien de bladschijven voorzichtig. Maak geen extra snijwonden of wonden op de schijven in het experiment, wat kan leiden tot gegevensvariatie. De inductie van ROS vindt meestal plaats vanuit de cellen van de snijkant, omdat de oppervlakken van rijstweefsels (bladeren of omhulsels) bedekt zijn met hydrofobe lagen. Alleen de cellen van de snijranden staan in contact met de elicitatieoplossing (zie de discussiesectie). - Houd alle bladschijven drijvend, met het abaxiale oppervlak naar boven gericht, in de putjes van een microtiterplaat voor watervoorbehandeling om bladzijde-geassocieerde variatie te voorkomen.
Figuur 1: De groeitoestand en stadia van rijstzaailingen voor schedebemonstering en delen van de rijstschede en rijstbladeren die in de test zijn gebruikt. (A) Rijstzaailingen die gedurende 10 dagen onder steriele omstandigheden op 1/2 MS-medium zijn geteeld, kunnen worden bemonsterd voor ros-bepaling. Gesteriliseerde rijstzaden werden gekweekt op 1/2 MS medium en gekweekt in een 12 uur lichte / 12 uur donkere fotoperiode in een heldere glazen injectieflacon, 8,5 cm in diameter en 15 cm in hoogte. B) Schematisch schema van de bemonsteringsdelen van bladmantels. Bladmantels werden gesneden uit 10 dagen oude rijstzaailingen. De posities van bladscheden waren boven de wortels en onder het eerste blad. (C) Schematisch schema van de bemonsteringspositie van bladschijven. De bladschijven kunnen worden gesneden uit het middelste derde deel van het tweede blad (tel vanaf de bovenkant) van de hoofdhelmstok van gezonde rijstplanten in elk groeistadium. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; MS = Murashige en Skoog. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Schematisch schema van de plaatopstelling voor het meten van ROS-productie met verschillende lijnen van Oryza sativa. Voorbehandeling en test van rijstweefsels met behulp van een 96-well plaat. Lijn 1, Lijn 2 en Lijn 3 (tot acht lijnen op één plaat) kunnen elk interessant materiaal zijn, verschillende cultivars, mutanten of transgene lijnen. De weefsels werden gestimuleerd met elicitatie-oplossingen met PAMP (PAMP, wit) of zonder PAMP (ddH2O, grijs) om de ROS-respons te meten. Opgemerkt moet worden dat hoe meer monsters moeten worden getest, hoe langer het tijdsinterval tussen de metingen. Afkortingen: ROS = reactieve zuurstofsoorten; PAMP = pathogeen-geassocieerd moleculair patroon; ddH2O = dubbel gedestilleerd water. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
3. De elicitatieoplossing voorbereiden
- Los L-012 poeder op in 20 mM (6,23 mg/ml) waterige oplossing met ddH2O om de stamoplossing te maken. Verdun vervolgens de stamoplossing met 50 mM Tris HCl-buffer (pH 7,5) om de werkoplossing te maken bij de uiteindelijke concentratie van 500 μM L-012. Houd de stamoplossing bevroren en verdun tot de werkoplossing voor gebruik.
- Bereid de elicitatieoplossing die PAMP, L-012 en mierikswortelperoxidase (HRP; 10 mg/ml in ddH2O) bevat. Meng voor een elicitatieoplossing van 10 ml 9,4 ml 50 mM Tris HCl (pH 7,5) oplossing, 400 μl L-012-oplossing, 100 μl HRP en 100 μl flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Voeg voor de negatieve controle 100 μL ddH2O toe in plaats van PAMP.
OPMERKING: Bewaar de bereide elicitatie-oplossingen bij kamertemperatuur om koude stress voor rijstweefsels te voorkomen. Andere PAMP's kunnen ook worden gebruikt voor de behandeling indien nodig, zoals chitine (20 ng / ml in de uiteindelijke concentratie). Aangezien L-012 lichtgevoelig is, bedek alle buizen met L-012-oplossing met aluminiumfolie.
4. De software starten en het protocol instellen met de microplaatlezer waarnaar wordt verwezen (zie Materiaaltabel)
OPMERKING: Het duurt enige tijd om de parameters van de microplaatlezersoftware in te stellen. Het wordt aanbevolen om de machine en het protocol gereed te maken (één klik om door te gaan) voordat u de elicitatie-oplossing toevoegt.
- Start de software. Klik op de knop Experimenten om een nieuw protocol te maken of een bestaand protocol te gebruiken.
- Klik op Procedure in het pop-upvenster om de plaat in te stellen. Selecteer de putten van de plaat die u wilt controleren.
- Klik op Start Kinetic om de totale looptijd en het leesinterval in te stellen. Stel de looptijd in op 35 minuten of langer, afhankelijk van de experimentele vereisten. Als u zo vaak mogelijk metingen wilt verkrijgen, selecteert u Minimuminterval. Kies voor de integratietijd 1 s of langer, afhankelijk van de signaalintensiteit.
OPMERKING: Het leesinterval is afhankelijk van het aantal monsters en de duur van de signaalintegratie. - Klik op Valideren | OK om de instellingen te bevestigen.
- Klik op De nieuwe plaat detecteren in de pop-up en wacht tot de software het dialoogvenster van de laadplaat vraagt. Plaats de te testen plaat op de drager.
- Stop hier om te wachten tot het elicitatiesysteem is vastgesteld (in de volgende sectie). Zodra het elicitatiesysteem klaar is, klikt u op Uitvoeren om het lezen te starten.
5. Het opzetten van het elicitatiesysteem en het meten van real-time ROS-productie
- Verwijder de ddH2O voorzichtig uit de putjes met de voorbehandelde weefsels en vermijd weefselbeschadiging of uitdroging.
- Gebruik een meerkanaalspipet om 200 μL van de elicitatieoplossing toe te voegen aan de putjes die de weefsels bevatten.
- Schud zachtjes om te mengen. Klik op Uitvoeren om de detectie te starten.
OPMERKING: Met PAMP-behandeling reageren plantenweefsels en produceren ze zeer snel ROS. Daarom wordt voorgesteld om de negatieve controle zonder PAMP eerst te behandelen om de operatietijd te verkorten, wanneer er meerdere behandelingen zijn. Werk zo snel mogelijk om de elicitatievertraging tussen behandelingen te verminderen. Hoe korter de tijd tussen de toevoeging van de elicitatieoplossing en het begin van de detectie, hoe beter de vastlegging van belangrijke experimentele gegevens zal zijn.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier nemen we rijstmateriaal als voorbeeld om de ROS te bepalen die wordt geproduceerd met flg22-behandeling. De generatie van ROS na elicitatie is van voorbijgaande aard. In rijst werd de toename van de ROS-productie voor het eerst gedetecteerd in 1-2 minuten, piekte op 10-12 min en keerde terug naar de basislijn in ~ 30-35 min (figuur 3). In vergelijking met de controletest, waarbij PAMP afwezig was in de elicitatieoplossing die resulteerde in geen duidelijke ROS-inductie, werd een specifi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het doel van deze studie was om een zeer efficiënte methode vast te stellen om de vroege ROS-productie te kwantificeren als reactie op PAMP in rijstweefsels. Deze methode biedt een gestandaardiseerde procedure voor de real-time bepaling van apoplast ROS geproduceerd uit behandelde rijstweefsels. Deze methode is eenvoudig in gebruik, laag in kosten, duidelijk van samenstelling en onafhankelijk van commerciële kits. Met behulp van deze methode kunnen onderzoekers de real-time productie van apoplast ROS bestuderen wanneer p...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van Shanghai Natural Science Foundation (Grant Number: 21ZR1429300/BS1500016), Shanghai Jiao Tong University (Agri-X program, Grant Number:AF1500088/002), Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Grant Number: ZXWH2150201/001) aan Jiangbo Fan, en door het Medical-Engineering Collaboration Project van Shanghai Jiao Tong Univesity (subsidienummer: 21X010301734) aan Can Li.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absoluut | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-fenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dion, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate lezer | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase uit mierikswortel (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Steekproef | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referenties
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19 (2017).
- Gilroy, S., et al. ROS, calcium, and electric signals: key mediators of rapid systemic signaling in plants. Plant Physiology. 171 (3), 1606-1615 (2016).
- Mittler, R., Vanderauwera, S., Gollery, M., Van Breusegem, F. Reactive oxygen gene network of plants. Trends in Plant Science. 9 (10), 490-498 (2004).
- Marino, D., Dunand, C., Puppo, A., Pauly, N. A burst of plant NADPH oxidases. Trends in Plant Science. 17 (1), 9-15 (2012).
- Mittler, R., Zandalinas, S. I., Fichman, Y., Van Breusegem, F. Reactive oxygen species signalling in plant stress responses. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (10), 663-679 (2022).
- Suzuki, N., Koussevitzky, S., Mittler, R., Miller, G. ROS and redox signalling in the response of plants to abiotic stress. Plant, Cell & Environment. 35 (2), 259-270 (2012).
- Suzuki, N., et al. Respiratory burst oxidases: the engines of ROS signaling. Current Opinion in Plant Biology. 14 (6), 691-699 (2011).
- Kadota, Y., Shirasu, K., Zipfel, C. Regulation of the NADPH oxidase RBOHD during plant immunity. Plant and Cell Physiology. 56 (8), 1472-1480 (2015).
- Segonzac, C., Zipfel, C. Activation of plant pattern-recognition receptors by bacteria. Current Opinion in Microbiology. 14 (1), 54-61 (2011).
- Roda, A., et al. Progress in chemical luminescence-based biosensors: A critical review. Biosensors and Bioelectronics. 76, 164-179 (2016).
- Hong, D., Joung, H. -A., Lee, D. Y., Kim, S., Kim, M. -G. Attomolar detection of cytokines using a chemiluminescence immunoassay based on an antibody-arrayed CMOS image sensor. Sensors and Actuators B: Chemical. 221, 1248-1255 (2015).
- Nishinaka, Y., et al. et al. new sensitive chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 193 (2), 554-559 (1993).
- Grundy, J., Stoker, C., Carre, I. A. Circadian regulation of abiotic stress tolerance in plants. Frontiers in Plant Science. 6, 648(2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
