Toepassing van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem en Lar Index van antimicrobiële resistentie

Summary

Hier introduceren we het principe, de structuur en de instructie van het intelligente high-throughput antimicrobiële gevoeligheidstest-/faagscreeningsysteem. De toepassing ervan wordt geïllustreerd aan de hand van Salmonella geïsoleerd uit pluimvee in Shandong, China, als voorbeeld. De Lar-index wordt berekend en de betekenis ervan bij het evalueren van antimicrobiële resistentie wordt uitgebreid besproken.

Abstract

Om de efficiëntie van antimicrobiële gevoeligheidstesten (AST) en faagscreening op resistente bacteriën te verbeteren en de detectiekosten te verlagen, werd een intelligent AST/faagscreeningsysteem met hoge doorvoer, inclusief een 96-dot matrix-inoculator, beeldacquisitieconverter en bijbehorende software, ontwikkeld volgens de AST-criteria en de breekpunten van resistentie (R) geformuleerd door het Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). AST en statistieken van minimale remmende concentratie (MIC)-verdelingen (van R/8 tot 8R) van 1.500 Salmonella-stammen geïsoleerd uit pluimvee in Shandong, China, tegen 10 antimicrobiële middelen werden uitgevoerd door het intelligente high-throughput AST/faagscreeningsysteem. De Lar-index, wat betekent "minder antibiose, minder resistentie en residu tot weinig antibiose", werd verkregen door het gewogen gemiddelde van elke MIC te berekenen en te delen door R. Deze benadering verbetert de nauwkeurigheid in vergelijking met het gebruik van de prevalentie van resistentie om de mate van antimicrobiële resistentie (AMR) van zeer resistente stammen te karakteriseren. Voor de stammen van Salmonella met een hoge AMR werden lytische fagen door dit systeem efficiënt gescreend uit de fagenbibliotheek en werd het lysisspectrum berekend en geanalyseerd. De resultaten toonden aan dat het intelligente AST/faagscreeningsysteem met hoge doorvoer bedienbaar, nauwkeurig, zeer efficiënt, goedkoop en gemakkelijk te onderhouden was. In combinatie met het veterinaire antimicrobiële resistentiemonitoringsysteem van Shandong was het systeem geschikt voor wetenschappelijk onderzoek en klinische detectie met betrekking tot AMR.

Introduction

Aangezien antimicrobiële middelen op grote schaal worden gebruikt om bacteriële infectieziekten te voorkomen, is antimicrobiële resistentie (AMR) een wereldwijd probleem voor de volksgezondheid^geworden1. De bestrijding van AMR is momenteel de belangrijkste taak van het monitoren van AMR van epidemiologische pathogenen en synergetische therapie van gevoelige antimicrobiële stoffen en lytische bacteriofagen².

In vitro antimicrobiële gevoeligheidstesten (AST) zijn de steunpilaar voor het monitoren van de therapie en het detecteren van het niveau van AMR. Het is een belangrijk onderdeel van de antimicrobiële farmacologie en de cruciale basis voor klinische medicatie. Het Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) van de Verenigde Staten en het Europees Comité voor antimicrobiële gevoeligheidstests (EUCAST) hebben internationale criteria voor ASAT geformuleerd en herzien en de AST-methoden en de breekpunten om de MIC van een bepaalde combinatie van "organisme-antimicrobieel middel" te bepalen als gevoelig (S), resistent (R) of intermediair (I)³ voortdurend gewijzigd en aangevuld^{; 4}. okt.

Van de jaren 1980 tot de jaren 1990 werden automatische instrumenten voor het verdunnen van microbouillon snel ontwikkeld en toegepast in de klinische praktijk, met voorbeelden als Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM en Cobasbact ^5,6,7. Deze instrumenten waren echter duur, vereisten dure verbruiksartikelen en hun detectiebereik was ontworpen voor klinische medicatie voor patiënten ^5,6,7. Om deze redenen zijn ze niet geschikt voor veterinair klinisch onderzoek en detectie van grote hoeveelheden zeer resistente stammen. In deze studie werd een intelligent AST/faag-screeningsysteem met hoge doorvoer, inclusief een matrixinoculator met 96 dots (Figuur 1), beeldacquisitieconverter (Afbeelding 2) en bijbehorende software⁸, ontwikkeld om ASAT uit te voeren voor een batch bacteriestammen tegen meerdere antimicrobiële middelen tegelijk door middel van de agarverdunningsmethode. Bovendien werd het systeem ook gebruikt om de lysispatronen van fagen tegen antimicrobieel resistente bacteriën te detecteren en^{te analyseren 9}, en werden lytische fagen efficiënt geselecteerd uit de faagbibliotheek. Dit systeem bleek efficiënt, betaalbaar en eenvoudig te bedienen te zijn.

Figuur 1: Structureel diagram van de 96-dot matrix inoculator. 1: Inoculatie pin plaat; 2: Mobiele provider; 3: Zaadblok; 4: Geïncubeerde plaat; 5: Basis; 6: Bedieningshendel; 7: Limietpin. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Constructieschema van de beeldacquisitieconverter. 1: Schelp; 2: Het scherm van de vertoning; 3: Beeldacquisitie ruimte; 4: De basis van de opsporingsraad; 5: Opsporingsraad in en uit pakhuis; 6: Besturingskaart; 7: Het omzettingsapparaat van de beeldverwerving; 8: Lichtbron; 9: Beeldscanner. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

De Salmonella-stammen die in deze studie werden gebruikt, werden verzameld bij pluimvee in Shandong, China, na goedkeuring van het Bioveiligheidscomité van het Institute of Animal Sciences and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences, China.

1. Toepassing van het intelligente AST-systeem met hoge doorvoer⁸

1. Entmateriaal bereiding
   1. Incubeer het kwaliteitscontrole-organisme Escherichia coli en 93 Salmonellastammen die op ASAT moeten worden getest op Mueller-Hinton-agarplaten (MHA) gedurende 16-18 uur bij 37 °C³.
   2. Bereid het inoculum van elke stam voor zodat het overeenkomt met de 0,5 McFarland-troebelheidsnorm op basis van de methode gespecificeerd in de CLSI-norm³en verdun vervolgens 10 keer.
   3. Plaats 200 μL steriele normale zoutoplossing in het horizontale 1e putje (A1) van de plaat met 96 putjes als negatieve controle, twee suspensies van het kwaliteitscontroleorganisme in het horizontale 2e en 3e^putje (A2 en A3) als respectievelijk de positieve controle^{, en kwaliteitscontrole}. Voeg 200 μl van de verdunde inoculumsuspensies van elke geteste kleuring toe aan de overeenkomstige 93 putjes in het zaadblok met 96 putjes.
2. Bereiding van antimicrobiële agarplaat
   1. Stel de concentratiebereiken van verschillende geteste antibacteriële middelen in volgens het berekeningsbereik van de Lar-index (van 0.125R tot 8R). De concentraties variëren van het kwaliteitscontrolebereik of 0,0625R (afhankelijk van het lagere bereik) tot 8R.
      OPMERKING: Als de Lar-index niet wordt berekend, kan het bereik van de antibioticaconcentraties worden ingesteld op basis van de behoeften van AST.
   2. Voer een log2-verdubbelingsverdunningsschema uit voor een antibiotische oplossing, te beginnen met een geschikte voorraadconcentratie op basis van de agarverdunningsmethode gespecificeerd in de CLSI-standaard³.
   3. Steriliseer glazen flessen van 50 ml met 18 ml Mueller-Hinton-agarmedia. Voeg 2 ml van de juiste verdunningen van de antimicrobiële oplossing toe aan 18 ml gesmolten media afgekoeld tot 45-50 °C, meng grondig en giet in de platen in de bioveiligheidskast.
   4. Laat de agar stollen bij kamertemperatuur (RT), laat een opening onder het deksel van geïncubeerde platen en blaas om het agaroppervlak te drogen voordat u het inoculeert.
   5. Label de soorten antimicrobiële middelen en concentraties op de achterkant van de geïncubeerde platen. Schik de meerdere geïncubeerde platen van elk antimicrobieel middel in een stapel in log2-verdubbelende verdunningsvolgorde.
   6. Bereid twee medicijnvrije agarplaten voor als controles voor elk antimicrobieel middel.
3. Inoculatiestappen voor 96-dot matrix inoculator
   1. Installeer de geautoclaveerde inoculatiepenplaat op de steun van een 96-dot matrix-inoculator in de bioveiligheidskast.
   2. Plaats het voorbereide zaadblok met geteste stammen en een met agar geïncubeerde plaat op de mobiele drager, met dezelfde positioneringshoek voor de twee platen.
   3. Duw de mobiele drager zo dat het zaadblok zich direct onder de inoculatiepenplaat bevindt.
   4. Druk op de bedieningshendel, beweeg de inoculatiepenplaat naar beneden en richt de 96 pennen op de inocula in 96 putjes van het zaadblok.
   5. Laat de bedieningshendel met bediening los en reset vervolgens de inoculatiepenplaat onder invloed van de veer.
   6. Druk 2-3 keer op de bedieningshendel om elk entmateriaal goed te roeren en onder te dompelen. Duw en verplaats de draagplaat zodat de geïncubeerde plaat zich direct onder de inoculatiepenplaat bevindt.
   7. Druk op de bedieningshendel, beweeg de inoculatiepenplaat naar beneden en stop 1-2 s om de inoculatiepennen volledig in contact te laten komen met het oppervlak van de geïncubeerde plaat.
   8. Laat de bedieningshendel los. Hiermee is één inenting voltooid. Plaats een andere geïncubeerde plaat terug en ga door met de cyclus totdat een groep antimicrobiële agarplaten klaar is.
   9. Vervang een andere inoculatiepenplaat en een zaadblok en inoculeer een andere groep geteste stammen. Cyclus totdat alle inentingen zijn voltooid.
      OPMERKING: Inoculeer eerst een controle-agarplaat (geen antimicrobieel middel), vervolgens de plaat in volgorde van geneesmiddelconcentratie van laag naar hoog, en een tweede controle-agarplaat als laatste om ervoor te zorgen dat er geen besmetting of overdracht van antimicrobiële middelen plaatsvindt. Het inoculatievolume is afhankelijk van het volume van de natuurlijke afzetting van elke pin van ongeveer 2 μL.
4. Incubatie van de antimicrobiële agarplaten
   1. Incubeer de geïnoculeerde antimicrobiële agarplaten bij RT totdat het vocht in de inoculumplekken in de agar is opgenomen.
   2. Keer de platen om en incubeer ze gedurende 16-20 uur bij 37 °C voor de geteste stammen om ervoor te zorgen dat de ongeremde bacteriën kolonies vormen.
5. Beeldacquisitie en datastatistieken
   1. Dubbelklik op het AST-beeldacquisitiesysteem met 96 dots om het programma te openen.
   2. Klik op Testinformatie in de taakbalk. Klik op Nieuw om een nieuwe testtaak aan te maken en vul de informatie in volgens de aanwijzingen, inclusief de code, naam, bron, bacteriën, aantal stammen, antibiotica en gradiënt.
   3. Klik op Gegevensverzameling > Foto > Testitem om de nieuwe taak te selecteren die is gemaakt. Klik op Antibiotica om de naam van het antibioticum te selecteren en klik op Gradiënt om de beginconcentratie van dit antibioticum te selecteren.
   4. Klik op Verbinden om verbinding te maken met de beeldacquisitieconverter.
   5. Plaats de bijbehorende geïncubeerde platen op de basis van de detectieplaat met de ontbrekende hoek rechtsvoor ter oriëntatie en duw ze in de beeldacquisitieconverter.
   6. Klik op Collectie om de afbeeldingen te verkrijgen. De antibioticagradiënt springt automatisch naar de volgende gradiënt. Plaats om de beurt het volgende bord en blijf klikken op Verzamelen totdat de platen voor dit antibioticum zijn verzameld.
   7. Klik op Antibiotica en selecteer de volgende set geïncubeerde platen. Klik op Verloop om het startverloop te selecteren en door te gaan naar de volgende ronde van het verzamelen van afbeeldingen.
   8. Klik na het voltooien van alle collecties op Verzenden. Het programma herkent automatisch het aantal witte pixels dat op elk inoculatiepunt in de afbeeldingen is geformatteerd, bepaalt of er kolonievorming is en zet de afbeeldingen om in MIC-waarden.
   9. Klik op Query om alle MIC-resultaten van de stammen tegen de geteste antibiotica te verkrijgen.
      OPMERKING: Het intelligente AST-systeem met hoge doorvoer is geschikt voor het bepalen van MIC's van grote partijen bacteriestammen. Het testproces, inclusief voorbereiding, inenting, incubatie en het lezen van de resultaten, duurt 3 dagen. De soorten antibiotica en MIC-detectiebereiken kunnen worden ingesteld op basis van de respectieve behoeften, en de belangrijkste verbruiksartikelen kunnen worden hergebruikt.
6. Berekening van de Lar-index
   1. Bepaal de Lar-index nauwkeurig met de formule: , waarbij:
      MIC_i: minimale remmende concentratie.
      Het bereik van _{MIC-distributies van MIC-3} tot MIC₃ vertegenwoordigt seriële tweevoudige concentraties gecentreerd op R: 0.125R, 0.25R, 0.5R, R, 2R, 4R en 8R.
      is 2 i, en het bereik vanⁱ is -3 tot 3.
      R: de breekpunten van resistentie van bacteriën tegen antimicrobiële middelen gestandaardiseerd door CLSI.
      f: de MIC-frequentieverdeling.
      OPMERKING: De algemene Lar-index is het rekenkundig gemiddelde van alle Lar-indices. Nadat de Lar-index is berekend, rondt u de eindwaarde af op twee significante cijfers achter de komma.

2. Intelligent faagscreeningsysteem met hoge doorvoer⁹

1. Voorbereiding van het faagzaadblok en dubbellaagse geïncubeerde platen met bacteriën.
   1. Gebruik de dubbellaagse agarmethode¹⁰ of vloeibare cultuurmethode¹¹ voor het maken van verschillende fagen. Verdun tot een geschikte parallelle concentratie met een titer van 1 x 10^4-5 pfu/ml en voeg 200 μL van het faaginoculum toe aan het zaadblok met 96 putjes.
   2. Maak dubbellaagse platen met bacteriën (10 ml onderste agarmedia [agar 12 g/L] en 6 ml bovenste semi-agarmedia [6 g/L] met 100 μL bacteriën [0,5 McFarland]) om te testen.
   3. Maak een dubbellaagse geïncubeerde plaat voor elke te testen stam. Laat een opening onder het deksel van de dubbellaagse plaat en blaas om het agaroppervlak in de bioveiligheidskast te drogen.
2. Screeningtest
   1. Plaats het voorbereide faagzaadblok en de dubbellaagse plaat op de mobiele drager van de 96-dot matrix-inoculator en breng alle faaginocula over naar het semi-agar-oppervlak. Ga door met de cycli totdat alle geteste stammen zijn voltooid.
   2. Laat de geënte dubbellaagse platen op RT blijven totdat het vocht in de entplekken volledig is opgenomen in de semi-agar.
   3. Keer de platen om en incubeer gedurende 4-6 uur onder geschikte omstandigheden voor de geteste stammen om ervoor te zorgen dat er duidelijke lytische vlekken ontstaan.
3. Gegevens analyseren
   1. Verkrijg en bewaar het beeld van het experimentele resultaat van elke dubbellaagse plaat met behulp van de beeldacquisitieconverter (stappen 1.5.4-1.5.6).
   2. Noteer het aantal en de morfologieën van de verschillende vormen van vlekken in een spreadsheet op basis van de verkregen afbeeldingen en bereken de respectieve verhoudingen van de verschillende soorten fagen.

Results

In navolging van het protocol van het intelligente high-throughput AST-systeem, werd de toepassing ervan geïllustreerd door Salmonella van pluimvee in Shandong, China, als voorbeeld.

De groei van Salmonella-stammen op agarplaten met ampicilline (R van 32 μg/ml) in concentraties van 2 tot 256 μg/ml, bepaald door de beeldacquisitieconverter, wordt weergegeven in figuur 3. De horizontale 1^e put A1 was de negatieve controle en vertoonde ge...

Discussion

De agarverdunningsmethode is goed ingeburgerd en wordt op grote schaal gebruikt. Het principe van het AST-systeem met hoge doorvoer was dat van de agarverdunningsmethode. Een van de cruciale stappen binnen het protocol was de nauwkeurige overdracht met hoge doorvoer van 96 inocula tegelijk, die meerdere keren achter elkaar werd uitgevoerd. Om deze kritieke stap te voltooien, waren de pinnen van de 96-dot matrix-inoculator uniform en zeer glad. De natuurlijke afzetting van elke pin was een volume van ongeveer 2 μL, dat zi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well  culture plate	Beijing lanjieke Technology Co., Ltd	11510
96-dot matrix AST image acquisition system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
96-dot matrix inoculator	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Gepatternd product
Agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB8274-1
Amikacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A857053
Amoxicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A822839
Ampicillin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	A830931
Analytical balance	Sartorius	BSA224S
Automated calculation software for Lar index of AMR	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Bacteria Salmonella strains	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Animal origin
Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Ceftiofur	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C873619
Ciprofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824343
Clavulanic acid	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C824181
Clean worktable	Suzhou purification equipment Co., Ltd	SW-CJ-2D
Colistin sulfate	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	C805491
Culture plate	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Gepatternd product
Doxycycline	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	D832390
Enrofloxacin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	E809130
Filter 0.22 μm	Millipore	SLGP033RB
Florfenicol	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	F809685
Gentamicin	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	G810322
Glass bottle 50 mL	Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd	QX-7
High-throughput resistance detection system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Image acquisition converter	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A	Gepatternd product
Meropenem	Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd	M861173
Mueller-Hinton agar	Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd	HB6232
Petri dish 60 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16021-1
Petri dish 90 mm x 15 mm	Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd	16001-1
Salmonella phages	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	N/A
Shaker incubator	Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd	MQD-S2R
Turbidimeter	Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd	F-TC2015
Varms base type library system V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Vertical high-pressure steam sterilizer	Shanghai Shen'an medical instrument factory	LDZX-75L
Veterinary pathogen resistance testing management system	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright
Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0	Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences	In-house software copyright