Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ex Vivo Uitbreiding en genetische manipulatie van hematopoëtische stamcellen van muizen in op polyvinylalcohol gebaseerde culturen

4.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64791

⸱

10 februari 2023

 ,  , 
1MRC Weatherall Institute of Molecular Medicine, University of Oxford

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het initiëren, onderhouden en analyseren van hematopoëtische stamcelculturen van muizen met behulp van ex vivo polyvinylalcoholgebaseerde expansie, evenals methoden om ze genetisch te manipuleren door lentivirale transductie en elektroporatie.

Samenvatting

Zelfvernieuwende multipotente hematopoietische stamcellen (HSC's) zijn een belangrijk celtype vanwege hun vermogen om hematopoëse gedurende het hele leven te ondersteunen en het hele bloedsysteem na transplantatie te reconstrueren. HSC's worden klinisch gebruikt in stamceltransplantatietherapieën, die een curatieve behandeling voor een reeks bloedziekten vertegenwoordigen. Er is veel belangstelling voor zowel het begrijpen van de mechanismen die HSC-activiteit en hematopoëse reguleren, als het ontwikkelen van nieuwe HSC-gebaseerde therapieën. De stabiele kweek en uitbreiding van HSC's ex vivo is echter een belangrijke barrière geweest bij het bestuderen van deze stamcellen in een handelbaar ex vivo systeem. We hebben onlangs een op polyvinylalcohol gebaseerd kweeksysteem ontwikkeld dat de langdurige en grootschalige uitbreiding van transplanteerbare HSC's van muizen en methoden om ze genetisch te bewerken kan ondersteunen. Dit protocol beschrijft methoden om HSC's van muizen te kweken en genetisch te manipuleren via elektroporatie en lentivirale transductie. Dit protocol zal naar verwachting nuttig zijn voor een breed scala aan experimentele hematologen die geïnteresseerd zijn in HSC-biologie en hematopoiese.

Inleiding

Het hematopoietische systeem ondersteunt een reeks essentiële processen bij zoogdieren, van zuurstoftoevoer tot het bestrijden van ziekteverwekkers, via gespecialiseerde bloed- en immuunceltypen. Continue bloedproductie (hematopoiese) is nodig ter ondersteuning van de homeostase van het bloedsysteem, die wordt ondersteund door hematopoëtische stam- en voorlopercellen (HSPC's)1. De meest primitieve hematopoëtische cel is de hematopoietische stamcel (HSC), die unieke capaciteiten heeft voor zelfvernieuwing en multilineage differentiatie 2,3. Dit is een zeldzame celpopulatie, voornamelijk te vinden in het volwassen beenmerg4, waar ze voorkomen met een frequentie van slechts ongeveer één per 30.000 cellen. Van HSC's wordt gedacht dat ze levenslange hematopoiese ondersteunen en helpen om hematopoiese te herstellen na hematologische stress. Deze capaciteiten stellen HSC's ook in staat om het gehele hematopoietische systeem stabiel te reconstrueren na transplantatie in een bestraalde ontvanger5. Dit vertegenwoordigt de functionele definitie van een HSC en vormt ook de wetenschappelijke basis voor HSC-transplantatietherapie, een curatieve behandeling voor een reeks bloed- en immuunziekten6. Om deze redenen zijn HSC's een belangrijk aandachtspunt van de experimentele hematologie.

Ondanks een grote focus van onderzoek, is het een uitdaging gebleven om HSC's ex vivo7 stabiel uit te breiden. We hebben onlangs het eerste langdurige ex vivo expansiecultuursysteem voor muis HSCs8 ontwikkeld. De aanpak kan transplanteerbare HSC's 234-899-voudig uitbreiden over een cultuur van 4 weken. In vergelijking met alternatieve benaderingen was de belangrijkste verandering in het protocol de verwijdering van serumalbumine en de vervanging ervan door een synthetisch polymeer. Polyvinylalcohol (PVA) werd geïdentificeerd als een optimaal polymeer voor de HSC-culturen van de muis8, die nu ook is gebruikt om andere hematopoëtische celtypen9 te kweken. Een ander polymeer genaamd Soluplus (een polyvinylcaprolactam-acetaat-polyethyleenglycol-transplantaatcopolymeer) is echter onlangs ook geïdentificeerd, wat de klonale HSC-expansie lijkt te verbeteren10. Voorafgaand aan het gebruik van polymeren werden serumalbumine in de vorm van foetaal runderserum, runderserumalbuminefractie V of recombinant serumalbumine gebruikt, maar deze hadden beperkte ondersteuning voor HSC-expansie en ondersteunden alleen kortdurende (~ 1 week) ex vivo cultuur7. Er moet echter worden opgemerkt dat HSC-cultuurprotocollen die HSC's in een rustige toestand houden, een langere ex vivo cultuurtijd11,12 kunnen ondersteunen.

In vergelijking met andere kweekmethoden is een groot voordeel van PVA-gebaseerde culturen het aantal cellen dat kan worden gegenereerd en de tijdsduur dat het protocol kan worden gebruikt om HSC's ex vivo te volgen. Dit overwint verschillende barrières op het gebied van experimentele hematologie, zoals het lage aantal HSC's dat per muis kan worden geïsoleerd (slechts een paar duizend) en de moeilijkheid om HSC's in de loop van de tijd in vivo te volgen. Het is echter belangrijk om te onthouden dat deze culturen HSC-proliferatie stimuleren, terwijl de in vivo HSC-pool overwegend rustig is bij een steady state13. Bovendien, hoewel de culturen selectief zijn voor HSC's, hopen extra celtypen zich in de loop van de tijd op met de culturen, en transplanteerbare HSC's vertegenwoordigen slechts ongeveer één op de 34 cellen na 1 maand. Myeloïde hematopoëtische voorlopercellen lijken het belangrijkste verontreinigende celtype te zijn in deze HSC-culturen8. Niettemin kunnen we deze culturen gebruiken om te verrijken voor HSC's uit heterogene celpopulaties (bijv. c-Kit + beenmerg HSPC's14). Het ondersteunt ook transductie of elektroporatie van HSC's voor genetische manipulatie14,15,16. Om HSC's uit de heterogene gekweekte HSPC-populatie te helpen identificeren, is CD201 (EPCR) onlangs geïdentificeerd als een nuttige ex vivo HSC-marker 10,17,18, met transplanteerbare HSC's beperkt tot de CD201 + CD150 + c-Kit + Sca1 + Lineage-fractie.

Dit protocol beschrijft methoden voor het initiëren, onderhouden en beoordelen van op PVA gebaseerde HSC-expansieculturen van muizen, evenals protocollen voor genetische manipulatie binnen deze culturen met behulp van elektroporatie of lentivirale vectortransductie. Deze methoden zullen naar verwachting nuttig zijn voor een reeks experimentele hematologen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures, inclusief fokken en euthanasie, moeten worden uitgevoerd binnen institutionele en nationale richtlijnen. De hieronder beschreven experimenten werden goedgekeurd door het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken. Zie de Tabel met materialen voor een lijst van alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt.

1. Voorraadoplossingen voorbereiden

  1. PVA stock oplossing
    1. Neem 50 ml water van weefselkweekkwaliteit in een kleine glazen fles (geschikt voor autoclaveren). Verwarm het water tot bijna kokend in een magnetron.
    2. Weeg 5 g PVA-poeder af en voeg toe aan het water.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om slechts 1-5 g PVA op te lossen. Het oplossen van grotere hoeveelheden kan leiden tot onvolledige reconstitutie.
    3. Sluit het deksel goed en schud om te mengen. Maak vervolgens het deksel los.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het heropenen, omdat de druk kan veranderen als gevolg van de veranderende watertemperatuur.
    4. Autoclaaf en laat afkoelen. Sluit het deksel goed en schud om te mengen. Maak aliquots in steriele tubes en bewaar ze maximaal 3 maanden bij 4 °C.
  2. Los gelyofiliseerde cytokines op in F-12 medium dat 1 mg/ml PVA bevat. Reconstitueer de stamcelfactor tot 10 μg/ml en trombopoietine tot 100 μg/ml om 1:1.000 voorraden te genereren. Maak aliquots in steriele buisjes en bewaar ze langdurig bij -80 °C. U kunt de aliquots ook maximaal 1 week bij 4 °C bewaren.
    OPMERKING: Vermijd de reconstitutie van cytokines in runderserumalbumine vanwege de negatieve impact op de HSC-expansie van muizen.

2. HSC beenmergextractie en c-Kit+ verrijking

  1. Ontleed de dijbenen, scheenbenen, bekkens en wervelkolom van vers geëuthanaseerde 8-12 weken oude C57BL / 6-muizen (via CO 2-verstikking en / of cervicale dislocatie) en plaats de botten in PBS op ijs.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de oppervlakken en gereedschappen zijn gesteriliseerd met 70% ethanol.
  2. Reinig de botten met pluisvrije delicate taakdoekjes, verwijder spieren en ruggenmerg en voeg toe aan een vijzel met ~ 3 ml PBS.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de stamper en vijzel worden gesteriliseerd met 70% ethanol en vervolgens eenmaal worden uitgewassen met PBS.
  3. Plet de botten met de stamper zonder te slijpen om schuifkrachten te minimaliseren. Breek grote beenmergfragmenten die in de PBS vrijkomen met behulp van een naald van 19 G die is bevestigd aan een spuit van 5 ml. Breng de celsuspensie door een filter van 70 μm over in een conische buis van 50 ml.
  4. Zodra de suspensie is overgebracht, herhaalt u dit met verse PBS totdat de botten zijn gebleekt en er geen merg zichtbaar is. Streef naar een eindvolume van ~30 ml per muis en ~50 ml voor twee muizen.
  5. Meng de beenmergcellen, verzamel 10 μL cellen en tel met behulp van Türks' oplossing in een verdunning van 1:10-1:20 met een hemocytometer.
    OPMERKING: Van één muis wordt verwacht dat hij 2-5 × 108 hele beenmergcellen oplevert.
  6. Draai gedurende 5 minuten bij 450 × g bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in koude PBS (350 μL voor één muis of 500 μL voor twee muizen).
  7. Voeg 0,2 μl allophycocyanine (APC) anti-c-Kit antilichaam per 10 miljoen cellen toe en incubeer gedurende 30 minuten in het donker bij 4 °C.
  8. Voeg 5 ml koude PBS toe aan de geïncubeerde cellen om overtollig antilichaam af te spoelen en filtreer door een filter van 50 μm in een verse conische buis van 15 ml.
  9. Was de originele tube met 7 ml koude PBS en breng deze door het filter. Als er filterverstopping optreedt, krast u het filteroppervlak met een P1000-tip.
  10. Draai gedurende 5 minuten bij 450 × g bij 4 °C, gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in koude PBS (350 μL voor één muis of 500 μL voor twee muizen).
  11. Voeg 0,2 μL anti-APC microbeads per 10 miljoen cellen toe en incubeer gedurende 15 minuten in het donker bij 4 °C. Voeg 12 ml steriele PBS toe om overtollige microbeads af te wassen.
  12. Draai de cellen bij 450 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C en resuspensie in 2 ml koude PBS. Terwijl de cellen in deze stap draaien, gaat u verder met stap 2.13.
  13. Bereid u voor op kolomverrijking door een magnetische filtratiekolom in de magneet van een magnetische kolomscheider te plaatsen, met een filter van 50 μm aan de bovenkant en een conische buis van 15 ml eronder.
  14. Laat 3 ml steriele PBS door het 50 μm filter en de filtratiekolom lopen. Zodra de PBS is doorlopen, passeert u de celsuspensie door de kolom, gevolgd door drie wasbeurten van 3 ml koude PBS elke keer. Wacht voor elke wasbeurt tot de kolom stopt met druppelen voordat u de volgende wasbeurt toevoegt.
  15. Verwijder de kolom van de magneet en plaats deze op een verse buis van 15 ml. Voeg 5 ml koude PBS toe, plaats de kolomzuiger op de kolom en elueer de cellen door op de zuiger te duwen.
  16. Meng de c-Kit-verrijkte cellen, verzamel 10 μL cellen en tel met behulp van Türks' oplossing in een verdunning van 1:2 met een hemocytometer. De typische opbrengst van één muis is 2-5 × 106 c-Kit+ cellen.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen de cellen direct in HSC-media worden gezaaid of worden voorbereid voor HSC-fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) zuivering.

3. Het initiëren van celculturen met c-kit-verrijkte HSPC's

  1. Bereid vers medium (tabel 1) voor het aantal benodigde cellen/putjes. Zaai 0,5-1 miljoen cellen per ml voor c-Kit-verrijkte HSPC's.
  2. Spin de c-Kit-verrijkte cellen af en resuspensie in HSC-medium bij de gewenste celdichtheid.
  3. Breng de cellen over naar fibronectine-gecoate of negatieve oppervlaktegeladen platen, bij 200 μL per 96-well plaat of 1 ml per 24-well plaat.
  4. Plaats de cellen in een weefselkweekincubator ingesteld op 37 °C en 5% CO2.

4. Het initiëren van celculturen met FACS gezuiverde HSC's

  1. Bereid een geschikt volume van de gebiotinyleerde afstammingsantilichaamkleuring: 3 μL mastermix (tabel 2) per 10 miljoen cellen, verdund 1:100 in PBS.
  2. Spin de c-Kit-verrijkte cellen af en resuspensie in de afstammingsantilichaamvlek gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  3. Wassen met 10 ml steriele PBS en gedurende 5 minuten bij 450 × g draaien bij 4 °C.
  4. Bereid een passend volume van de verse HSC-antilichaamkleuring (tabel 3): 300 μl per 10 miljoen cellen. Bereid naast deze monsterkleuring de juiste kleuringscontrolemonsters voor compensatie en gating voor.
    OPMERKING: Werk in een weefselkweekkap met het licht uit bij gebruik van kleurstof-geconjugeerde antilichamen.
  5. Resuspendeer de cellen in de HSC-antilichaamkleuring en incubeer gedurende 90 minuten bij 4 °C. Meng de cellen elke 20-30 minuten door te tikken om celpellets te voorkomen.
  6. Wassen met 10 ml steriele PBS en gedurende 5 minuten bij 450 × g draaien bij 4 °C.
  7. Zuig het supernatant op, veeg de pellet om te verstoren en resuspensie in steriele PBS met 0,5 μg / ml propidiumjodide (PI).
  8. Bereid vers medium (tabel 1) voor het aantal benodigde putjes en plaat in fibronectine of negatieve oppervlaktegeladen platen (200 μL per 96-well plaat of 1 ml per 24-well plaat).
  9. Bereid de FACS-machine voor op het sorteren en sorteer CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage- HSC's rechtstreeks in mediabevattende putten (zie figuur 1 voor de standaard FACS-gatingstrategie die hier wordt gebruikt). Sorteer tot 200 cellen per 96-well plaat put of tot 1.000 cellen per 24-well plaat put.
    OPMERKING: FACS-machines moeten worden bediend door een getrainde wetenschapper. Het wordt aanbevolen dat gebruikers contact opnemen met hun lokale FACS-faciliteit om deze sorteerstrategie te bespreken als ze geen ervaring hebben met FACS-isolatie van muis-HSC's.

5. Mediawijzigingen uitvoeren

  1. Voor celculturen die zijn gestart met c-Kit-verrijkte cellen, begint u na 2 dagen met mediaveranderingen. Voor celculturen die zijn geïnitieerd met FACS-geïsoleerde HSC's, begint u na 5 dagen met mediaveranderingen.
  2. Bereid voldoende vers voorverwarmd (~37 °C) HSC medium (tabel 1) voor alle putjes.
  3. Verwijder de plaat voorzichtig uit de weefselkweekincubator.
    OPMERKING: Aangezien HSPC's op negatieve oppervlaktegeladen platen gemakkelijker worden verstoord dan die op fibronectine, moet extra voorzichtig worden gehandeld bij het veranderen van het medium op negatieve oppervlaktegeladen platen om te voorkomen dat de celculturen worden verstoord.
  4. Verwijder met behulp van een pipet of vacuümpomp langzaam ~ 90% -95% van het medium uit de meniscus van de put.
    OPMERKING: Vermijd het opzuigen van het medium vanaf de basis van de put, anders worden veel cellen verwijderd.
  5. Voeg 200 μL (voor 96-well platen; 1 ml voor 24-well platen) vers medium toe aan de put.
  6. Breng de plaat terug naar de weefselkweekincubator.
  7. Herhaal stap 5.1-5.6 elke 2-3 dagen tot het experimentele eindpunt.
  8. Voor celculturen die zijn gestart met c-Kit-verrijkte HSPC's (sectie 3), splitst u de culturen in een verhouding van 1:2-1:3 na ~ 3 weken. Voor celculturen die zijn gestart met FACS-gezuiverde HSC's (sectie 4), splitst u de culturen in een verhouding van 1: 2-1: 3 na ~ 3 weken en wanneer de culturen >90% confluent zijn.
    OPMERKING: De exacte tijdlijn is afhankelijk van de experimentele interesses. Deze culturen zijn gekarakteriseerd voor 4-8 weken8, maar extra kweeklengtes kunnen mogelijk zijn.

6. Elektropoleren van gekweekte HSPC's

OPMERKING: Dit protocol is voor elektroporatie van Cas9/sgRNA ribonucleoproteïne (RNP), maar kan worden aangepast voor elektroporatie van mRNA of andere recombinante eiwitten. Initieer culturen met voldoende aantallen cellen om dit op het gewenste experimentele tijdstip uit te voeren.

  1. Voer 1 dag voor elektroporatie een mediumwissel uit, zoals beschreven in rubriek 5.
    OPMERKING: Een minimum van een nachtelijke cultuur vóór elektroporatie wordt aanbevolen. Cellen worden echter meestal 1-3 weken vóór transductie gekweekt.
  2. Stel op de dag van elektroporatie de nucleofector in. Schakel het apparaat in. Selecteer op het touchscreen de X-module en vervolgens de gebruikte cuvetmaat .
  3. Bereid voldoende P3-oplossing (volgens de instructies van de fabrikant) voor de schaal van de elektroporatie (100 μL per cuvette of 20 μL per microcuvet) en laat balanceren tot kamertemperatuur.
  4. Bereid voldoende vers medium (tabel 1) voor het aantal putjes dat wordt verguld en voeg 500 μL medium voor een 24-well plaatput of 100 μL media toe aan een 96-well plaatput.
  5. Ontdooi sgRNA (voorverdund tot 2 μg/ml in RNase-vrij water) op ijs en meng 16 μg sgRNA met 30 μg Cas9-enzym (bij 10 μg/ml) in een steriele PCR-buis. Voeg een extra PCR-buis toe met alleen Cas9-eiwit als controle. Meng door met de buis te vegen en draai vervolgens kort naar beneden. Incubeer bij 25 °C gedurende 10 minuten in een thermocycler om de RNP te complexeren en houd de buizen vervolgens op ijs.
    OPMERKING: Dit kan vervijfvoudigd worden als elektroporatie in microcuvetten wordt uitgevoerd.
  6. Meng en breng de HSPC's voor elektroporatie over in een buis; verzamel 10 μL van de cellen en tel met behulp van de oplossing van Türks in een verdunning van 1:2 met een hemocytometer.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om 1-5 miljoen cellen per 100 μL cuvet te elektroporeren (vervijfvoudigd voor de microcuvet).
  7. Draai het juiste aantal cellen in een buis van 1,5 ml bij 450 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig zoveel mogelijk van het supernatant op en resuspendien met 100 μL nucleofectiebuffer.
  8. Breng de celsuspensie onmiddellijk over in de PCR-buis met de gecomplexeerde RNP en pipet langzaam op en neer om voorzichtig te mengen en over te brengen naar een elektroporatiecuvet van 100 μL. Werp het mengsel langzaam en in één vloeiende beweging in de cuvette om de vorming van luchtbellen in de cuvette te voorkomen.
  9. Selecteer op de elektroporator de positie van de putten die worden geëlektroporeerd. Selecteer op het touchscreen het celtypeprogramma CD34+, mens of typ de pulscode EO100 in. Druk op de knop OK .
  10. Breng de cuvetten over naar de elektroporator. Druk op de Start-knop op het touchscreen om de elektroporatie te starten. Voeg direct na elektroporatie 500 μL van het kweekmedium toe aan de cuvette (100 μL bij gebruik van een microcuvet).
  11. Breng de cellen voorzichtig over naar de voorbereide plaat en keer terug naar de weefselkweekincubator.
  12. Voor procedures waarbij een AAV6-donorsjabloon wordt gebruikt, voegt u de vector toe onmiddellijk nadat de cellen zijn overgebracht naar een met fibronectine gecoate plaat in een concentratie van 5.000 vectoren / cel.
  13. Bereid na 6-18 uur vers medium en voer een mediumwissel uit zoals beschreven in rubriek 5. Verwijder voor deze mediumverandering slechts 80% -90% van het medium.
    OPMERKING: Vermijd het optrekken van het medium vanaf de basis van de put.
  14. Analyseer de cellen door middel van flowcytometrie na 2 of meer dagen (zie rubriek 8 voor meer informatie).
  15. Blijf elke 2 dagen mediumveranderingen uitvoeren, zoals beschreven in rubriek 5, totdat het experimentele eindpunt is bereikt.
    OPMERKING: Bewerkingssnelheden van CRISPR/Cas9 met behulp van deze methode zijn sterk afhankelijk van de targetingefficiëntie van het ontworpen sgRNA. Bewerkingspercentages tot 95% zijn waargenomen met een efficiënte gids15. Richtlijnen voor sgRNA-ontwerp zijn eerder elders beschreven19,20.

7. Transduceren van gekweekte HSPC's met lentivirale vector

OPMERKING: Start culturen met voldoende aantallen cellen, om dit uit te voeren op het gewenste experimentele tijdstip.

  1. Lentivirale vector genereren en titeren (afhankelijk van de experimentele doelen). Ontdooi lentivirale vector op ijs.
  2. Voer een mediumwissel uit (zoals in sectie 5); meng en breng vervolgens de HSPC's over voor transductie in een buis. Verzamel 10 μL van de cellen en tel met behulp van de oplossing van Türks in een verdunning van 1:2 met een hemocytometer.
    OPMERKING: Cellen kunnen onmiddellijk na plating worden getransduceerd. Cellen worden echter meestal 1-3 weken vóór transductie gekweekt.
  3. Herplaat de vereiste dosis cellen voor transductie (meestal 100.000 cellen per 96-well plaat). Afzonderlijk, plaat niet-getransduceerde negatieve controlecellen.
    OPMERKING: Als u negatieve oppervlaktegeladen platen gebruikt, breng de cellen dan over naar met fibronectine gecoate platen voor lentivirale vectortransductie.
  4. Voeg lentivirale vector toe aan elke bron van cellen: voeg 20 transductie-eenheden per cel toe om ~ 30% transductie-efficiëntie te bereiken. Bepaal de lentivirale vectordosis echter empirisch, afhankelijk van de experimentele vereisten.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat lentivirale vector wordt verwijderd volgens de institutionele richtlijnen.
  5. Breng de cellen gedurende 6 uur terug naar de weefselkweekincubator. Voer daarna een mediumwissel uit zoals beschreven in rubriek 5.
    OPMERKING: Het supernatant bevat levend virus. Weggooien volgens institutionele richtlijnen.
  6. Analyseer de cellen door flowcytometrie (bijvoorbeeld voor GFP-expressie) na 2 dagen of meer. Zie rubriek 8 voor meer informatie.
  7. Blijf elke 2 dagen mediumveranderingen uitvoeren, zoals beschreven in rubriek 5, totdat het experimentele eindpunt is bereikt.

8. Flowcytometrische analyse van HSPC-culturen

  1. Bereid een geconcentreerd gekweekt ex vivo HSC-antilichaammengsel in PBS met 2% FBS (tabel 4). Bewaar het mengsel bij 4 °C in het donker gedurende maximaal 1 maand.
    OPMERKING: Werk in een weefselkweekkap met de lichten uit bij gebruik van kleurstof-geconjugeerde antilichamen.
  2. Voeg 2 μL geconcentreerd antilichaammengsel toe aan 50 μL cellen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C in het donker. Bereid naast deze monsterkleuring de juiste kleuringscontrolemonsters voor compensatie en gating voor.
  3. Voeg 200-1.000 μL PBS met 2% FBS toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 450 × g bij 4 °C. Verwijder zoveel mogelijk supernatant en resuspensie in 100-500 μL PBS met 2% FBS en 0,5 μg/ml PI.
  4. Stel de flowcytometer in en registreer ten minste 10.000 levende cellen per monster.
    OPMERKING: Flowcytometers moeten worden bediend door een getrainde wetenschapper. Gebruikers moeten contact opnemen met hun lokale FACS-faciliteit om deze analyse te bespreken als ze geen ervaring hebben met flowcytometrie.
  5. Exporteer de gegevens in FCS-indeling en analyseer de gegevens met behulp van de juiste flowcytometrie-analysesoftware. Zie figuur 2 voor de hier gebruikte standaard gatingstrategie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Voor de FACS-zuivering van HSC's verwachten we dat binnen het c-Kit-verrijkte beenmerg ~0,2% van de cellen de CD150+CD34-c-Kit+Sca1+Lineage-populatie zijn voor jonge (8-12 weken oude) C57BL/6 muizen (Figuur 1). Het is echter waarschijnlijk dat transgene muizen of muizen van verschillende leeftijden verschillende HSC-frequenties vertonen. Na 4 weken kweek verwachten we dat de CD201+CD150+c-Kit+Sca1+

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hopen dat dit protocol een nuttige benadering biedt om HSC-biologie, hematopoëse en hematologie in het algemeen te onderzoeken. Sinds de initiële ontwikkeling van de PVA-gebaseerde kweekmethode voor FACS-gezuiverde HSC's8 is de methode uitgebreid. Het is bijvoorbeeld aangetoond dat de methode werkt met c-Kit verrijkt met beenmerg en met negatieve oppervlaktegeladen platen14. De compatibiliteit met transductie en elektroporatie is ook aangetoond14,15

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

We danken de WIMM Flow Cytometry Core voor toegang tot flowcytometrie en de WIMM Virus Screening Core voor lentivirale vectorgeneratie. Dit werk werd gefinancierd door het Kay Kendall Leukaemia Fund en de UK Medical Research Council.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Equipment
Dissection kitFisher Scientific12764416
HemocytometerAppleton Woods LtdHC002
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonza V4XP-3024
Pestle and mortarScientific Laboratory Supplies LimitedX18000
QuadroMACS separatorMiltenyi Biotec130-090-976
Materials
5 mL syringeVWR International Ltd720-2519
19 G needleVWR International Ltd613-5394
50 μm cell strainerSysmex04-004-2317
70 μm cell strainerCorning431751
Kimtech wipesVWR International Ltd115-2075
LS MACS columnMiltenyi Biotec130-042-401
Reagents
Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3, 100 μgIDT 1081058
Animal free recombinant mouse stem cell factor PeprotechAF-250-03
Animal free recombinant mouse thrombopoietinPeprotechAF-315-14
Anti-mouse CD117 APC (clone: 2B8)ThermoFisher17-1171-83
Anti-mouse CD117 BV421 (clone: 2B8)Biolegend105828
Anti-mouse CD127 APC/Cy7 (clone: A7R34)Biolegend135040
Anti-mouse CD127 biotin (clone: A7R34)Biolegend135006
Anti-mouse CD150 PE/Cy7 (clone: TC15-12F12.2)Biolegend115914
Anti-mouse CD201 APC (clone: eBio1560)ThermoFisher17-2012-82
Anti-mouse CD34 FITC (clone: RAM34)ThermoFisher11-0341-85
Anti-mouse CD4 APC/Cy7 (clone: RM4-5)Biolegend100526
Anti-mouse CD4 biotin (clone: RM4-5)Biolegend100508
Anti-mouse CD45R APC/Cy7 (clone: RA3-6B2)Biolegend103224
Anti-mouse CD45R biotin (clone: RA3-6B2)Biolegend103204
Anti-mouse CD48 BV421 (clone: HM48-1)Biolegend103428
Anti-mouse CD8 biotin (clone: 53-6.7)Biolegend100704
Anti-mouse CD8a APC/Cy7 (clone: 53-6.7)Biolegend100714
Anti-mouse Ly6G/Ly6C APC/Cy7 (clone: RB6-8C5)Biolegend108424
Anti-mouse Ly6G/Ly6C biotin (clone: RB6-8C5)Biolegend108404
Anti-mouse Sca1 PE (clone: D7)Biolegend108108
Anti-mouse Ter119 APC/Cy7 (clone: TER-119)Biolegend116223
Anti-mouse Ter119 biotin (clone: TER-119)Biolegend116204
CellBIND plates, 24-wellCorning3337negative surface charged
CellBIND plates, 96-well Corning3330negative surface charged
Custom synthetic sgRNA Synthego, Sigma Aldrich, IDTCustom order
Fetal bovine serumMerck Life Science UK LimitedF7524-50ML
Fibronectin Coated plates, 96-wellBD Biosciences354409
Ham's F-12 Nutrient MixGibco11765054
Insulin-Transferrin-Selenium-X (100x)Gibco51500.056
Phosphate buffered salineAlfa AesarJ61196.AP
Polyvinyl alcoholSigma AldrichP8136
Propidium IodideEnzo Life Sciences (UK) LtdEXB-0018
Streptavidin APC/Cy7Biolegend405208
Türks’ solutionSigma Aldrich109277
VirkonMettler-Toledo Ltd95015662

Referenties

  1. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  2. Eaves, C. J. Hematopoietic stem cells: concepts, definitions, and the new reality. Blood. 125 (17), 2605-2613 (2015).
  3. Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo. Nature Reviews Genetics. 21 (9), 541-554 (2020).
  4. Crane, G. M., Jeffery, E., Morrison, S. J. Adult haematopoietic stem cell niches. Nature Reviews Immunology. 17 (9), 573-590 (2017).
  5. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  6. Granot, N., Storb, R. History of hematopoietic cell transplantation: challenges and progress. Haematologica. 105 (12), 2716-2729 (2020).
  7. Wilkinson, A. C., Nakauchi, H. Stabilizing hematopoietic stem cells in vitro. Current Opinion in Genetics & Development. 64, 1-5 (2020).
  8. Wilkinson, A. C., et al. Long-term ex vivo haematopoietic-stem-cell expansion allows nonconditioned transplantation. Nature. 571 (7763), 117-121 (2019).
  9. Nishimura, T., et al. Use of polyvinyl alcohol for chimeric antigen receptor T-cell expansion. Experimental Hematology. 80, 16-20 (2019).
  10. Becker, H. J., et al. A single cell cloning platform for gene edited functional murine hematopoietic stem cells. bioRxiv. , (2022).
  11. Kobayashi, H., et al. Environmental optimization enables maintenance of quiescent hematopoietic stem cells ex vivo. Cell Reports. 28 (1), 145-158 (2019).
  12. Kobayashi, H., Takubo, K. A culture method to maintain quiescent human hematopoietic stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61938(2021).
  13. Aal Wilson,, et al. Hematopoietic stem cells reversibly switch from dormancy to self-renewal during homeostasis and repair. Cell. 135 (6), 1118-1129 (2008).
  14. Ochi, K., Morita, M., Wilkinson, A. C., Iwama, A., Yamazaki, S. Non-conditioned bone marrow chimeric mouse generation using culture-based enrichment of hematopoietic stem and progenitor cells. Nature Communications. 12 (1), 3568(2021).
  15. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12 (1), 686(2021).
  16. Haney, M. S., et al. Large-scale in vivo CRISPR screens identify SAGA complex members as a key regulators of HSC lineage commitment and aging. bioRxiv. , (2022).
  17. Che, J. L. C., et al. Identification and characterization of in vitro expanded hematopoietic stem cells. EMBO Reports. 23 (10), e55502(2022).
  18. Zhang, Q., Konturek-Ciesla, A., Yuan, O., Bryder, D. Ex vivo expansion potential of murine hematopoietic stem cells: a rare property only partially predicted by phenotype. bioRxiv. , (2022).
  19. Schindele, P., Wolter, F., Puchta, H. CRISPR guide RNA design guidelines for efficient genome editing. Methods in Molecular Biology. 2166, 331-342 (2020).
  20. Hanna, R. E., Doench, J. G. Design and analysis of CRISPR-Cas experiments. Nat Biotechnol. 38 (7), 813-823 (2020).
  21. Wilkinson, A. C., Ishida, R., Nakauchi, H., Yamazaki, S. Long-term ex vivo expansion of mouse hematopoietic stem cells. Nature Protocols. 15 (2), 628-648 (2020).
  22. Ieyasu, A., et al. An all-recombinant protein-based culture system specifically identifies hematopoietic stem cell maintenance factors. Stem Cell Reports. 8 (3), 500-508 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Polyvinylalcoholcultuurextractie van beenmerglentivirale transductieelektroporatietechniekc-Kit-verrijkingfluorescentie-geactiveerde sorteringstamceltransplantatie
Ex Vivo Uitbreiding en genetische manipulatie van hematopoëtische stamcellen van muizen in op polyvinylalcohol gebaseerde culturen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.