Snelle ontwikkeling van celtoestandsidentificatiecircuits met polytransfectie

Summary

Complexe genetische circuits zijn tijdrovend om te ontwerpen, testen en optimaliseren. Om dit proces te vergemakkelijken, worden zoogdiercellen getransfecteerd op een manier die het testen van meerdere stoichiometrieën van circuitcomponenten in een enkele put mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft de stappen voor experimentele planning, transfectie en data-analyse.

Abstract

Genetische circuits van zoogdieren hebben het potentieel aangetoond om een breed scala aan ziektetoestanden te detecteren en te behandelen, maar optimalisatie van de niveaus van circuitcomponenten blijft uitdagend en arbeidsintensief. Om dit proces te versnellen, ontwikkelde ons lab polytransfectie, een high-throughput uitbreiding van traditionele zoogdiertransfectie. Bij polytransfectie voert elke cel in de getransfecteerde populatie in wezen een ander experiment uit, waarbij het gedrag van het circuit op verschillende DNA-kopienummers wordt getest en gebruikers een groot aantal stoichiometrieën in een eenpotreactie kunnen analyseren. Tot nu toe zijn polytransfecties aangetoond die de verhoudingen van driecomponentencircuits in een enkele put van cellen optimaliseren; In principe kan dezelfde methode worden gebruikt voor de ontwikkeling van nog grotere circuits. Polytransfectieresultaten kunnen eenvoudig worden toegepast om optimale verhoudingen van DNA tot co-transfect te vinden voor transiënte circuits of om expressieniveaus te kiezen voor circuitcomponenten voor het genereren van stabiele cellijnen.

Hier demonstreren we het gebruik van polytransfectie om een driecomponentencircuit te optimaliseren. Het protocol begint met experimentele ontwerpprincipes en legt uit hoe polytransfectie voortbouwt op traditionele co-transfectiemethoden. Vervolgens wordt polytransfectie van cellen uitgevoerd en enkele dagen later gevolgd door flowcytometrie. Ten slotte worden de gegevens geanalyseerd door segmenten van de single-cell flowcytometriegegevens te onderzoeken die overeenkomen met subsets van cellen met bepaalde componentverhoudingen. In het lab is polytransfectie gebruikt om celclassificaties, feedback- en feedforwardcontrollers, bistabiele motieven en nog veel meer te optimaliseren. Deze eenvoudige maar krachtige methode versnelt ontwerpcycli voor complexe genetische circuits in zoogdiercellen.

Introduction

Het gebied van de synthetische biologie van zoogdieren heeft zich snel ontwikkeld, van het ontwikkelen van eenvoudige zintuiglijke en responsonderdelen in gekweekte cellijnen tot de optimalisatie van complexe netwerken van genen om echte uitdagingen in diagnostiek en therapieën aan te pakken¹. Deze geavanceerde circuits zijn in staat om biologische inputs te detecteren, van microRNA-profielen tot cytokines tot geneesmiddelen met kleine moleculen, en het implementeren van logische verwerkingscircuits, waaronder transistors, banddoorlaatfilters, tuimelschakelaars en oscillatoren. Ze hebben ook veelbelovende resultaten laten zien in diermodellen v....

Protocol

OPMERKING: Tabel 1 en tabel 2 dienen als belangrijke referenties voor dit protocol. Tabel 1 toont reagenschaling voor reacties en tabel 2 toont dna-ratio-rekenkunde voor een voorbeeld polytransfectie beschreven in het protocol (bovenste helft) en voor een mogelijk vervolgexperiment (onderste helft).

1. Cellen voorbereiden op transfectie

1. Zorg ervoor dat de kweek van menselijke embryonale niercellen (HEK293) 60% -80% confluent is voordat het protocol wordt gestart. Om dit te doen, zaai 1 x 10⁶ cellen in een 100 mm x 15 mm weefselkweek pet....

Results

In figuur 1 vergelijken we co-transfectie met polytransfectie. In een co-transfectie worden alle plasmiden in dezelfde transfectiemix afgeleverd, wat resulteert in een hoge correlatie tussen de hoeveelheid van elk plasmide die een enkele cel ontvangt (figuur 1A). Hoewel het aantal totale plasmiden dat aan elke cel wordt geleverd aanzienlijk varieert, is de fluorescentie van de twee reporter-eiwitten in de individuele cellen in de populatie goed gecorreleerd, wat.......

Discussion

Rapid prototyping-methoden zoals computerondersteund ontwerp (CAD), breadboarden en 3D-printen hebben een revolutie teweeggebracht in mechanische, elektrische en civieltechnische disciplines. Het vermogen om snel door vele mogelijke oplossingen voor een bepaalde uitdaging te zoeken, versnelt de vooruitgang in een veld aanzienlijk. Wij geloven dat polytransfectie een analoge technologie is voor biologische engineering, die snelle prototyping van genetische circuits mogelijk maakt. Bovendien vereisen andere rapid prototypi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15mL Corning Falcon kegelbuisjes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petrischaal	Elke gewenste maatschappij		(Niet-pyrogeen, steriele, RNase, DNase, DNA en pyrogeenvrij)
Bovine serum albumine	NEB	B9000S
Centrifuge	Elke gewenste maatschappij		In staat om 15mL Falcon buisjes bloot te stellen aan 300 rcf
Countess 3 Geautomatiseerde celteller	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Celtellingkamer Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Niet-commercieel softwarepakket		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Gebruik de juiste media voor uw celtype
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Foetaal bovien serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cellen	ATCC	CRL-1573	Gebruik het relevante celtype voor uw experimenten. HEK cellen hebben de neiging om zeer efficiënt te transfecteren.
HeLa cellen	ATCC	CRL-12401	Gebruik het relevante celtype voor uw experimenten.
Lipofectamine 3000 en P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Gebruik het juiste reagens voor uw celtype; transfectie en enhancer reagens
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Niet-essentiële aminozuren oplossing	Gibco	11140050
Microcentrifugebuisjes, 1.5 mL	Elke gewenste maatschappij
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reductie serum medium
Fosfaat gebufferde zoutoplossing	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow kalibratie kralen	Spherotech	URCP-100-2H
Natriumazid	Sigma Aldrich	S2002
Trypsine	VWR	25-053-CI