Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snelle ontwikkeling van celtoestandsidentificatiecircuits met polytransfectie

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64793

⸱

24 februari 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 2School of Biological Engineering, University of British Columbia, 3Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology

In dit artikel

Samenvatting

Complexe genetische circuits zijn tijdrovend om te ontwerpen, testen en optimaliseren. Om dit proces te vergemakkelijken, worden zoogdiercellen getransfecteerd op een manier die het testen van meerdere stoichiometrieën van circuitcomponenten in een enkele put mogelijk maakt. Dit protocol beschrijft de stappen voor experimentele planning, transfectie en data-analyse.

Samenvatting

Genetische circuits van zoogdieren hebben het potentieel aangetoond om een breed scala aan ziektetoestanden te detecteren en te behandelen, maar optimalisatie van de niveaus van circuitcomponenten blijft uitdagend en arbeidsintensief. Om dit proces te versnellen, ontwikkelde ons lab polytransfectie, een high-throughput uitbreiding van traditionele zoogdiertransfectie. Bij polytransfectie voert elke cel in de getransfecteerde populatie in wezen een ander experiment uit, waarbij het gedrag van het circuit op verschillende DNA-kopienummers wordt getest en gebruikers een groot aantal stoichiometrieën in een eenpotreactie kunnen analyseren. Tot nu toe zijn polytransfecties aangetoond die de verhoudingen van driecomponentencircuits in een enkele put van cellen optimaliseren; In principe kan dezelfde methode worden gebruikt voor de ontwikkeling van nog grotere circuits. Polytransfectieresultaten kunnen eenvoudig worden toegepast om optimale verhoudingen van DNA tot co-transfect te vinden voor transiënte circuits of om expressieniveaus te kiezen voor circuitcomponenten voor het genereren van stabiele cellijnen.

Hier demonstreren we het gebruik van polytransfectie om een driecomponentencircuit te optimaliseren. Het protocol begint met experimentele ontwerpprincipes en legt uit hoe polytransfectie voortbouwt op traditionele co-transfectiemethoden. Vervolgens wordt polytransfectie van cellen uitgevoerd en enkele dagen later gevolgd door flowcytometrie. Ten slotte worden de gegevens geanalyseerd door segmenten van de single-cell flowcytometriegegevens te onderzoeken die overeenkomen met subsets van cellen met bepaalde componentverhoudingen. In het lab is polytransfectie gebruikt om celclassificaties, feedback- en feedforwardcontrollers, bistabiele motieven en nog veel meer te optimaliseren. Deze eenvoudige maar krachtige methode versnelt ontwerpcycli voor complexe genetische circuits in zoogdiercellen.

Inleiding

Het gebied van de synthetische biologie van zoogdieren heeft zich snel ontwikkeld, van het ontwikkelen van eenvoudige zintuiglijke en responsonderdelen in gekweekte cellijnen tot de optimalisatie van complexe netwerken van genen om echte uitdagingen in diagnostiek en therapieën aan te pakken1. Deze geavanceerde circuits zijn in staat om biologische inputs te detecteren, van microRNA-profielen tot cytokines tot geneesmiddelen met kleine moleculen, en het implementeren van logische verwerkingscircuits, waaronder transistors, banddoorlaatfilters, tuimelschakelaars en oscillatoren. Ze hebben ook veelbelovende resultaten laten zien in diermodellen van ziekten zoals kanker, artritis, diabetes en nog veel meer 1,2,3,4,5. Naarmate de complexiteit van een circuit groeit, wordt het optimaliseren van de niveaus van elk van de componenten echter steeds uitdagender.

Een bijzonder nuttig type genetisch circuit is een celclassificatie, die kan worden geprogrammeerd om cellulaire toestanden te detecteren en erop te reageren. Selectieve productie van eiwit- of RNA-outputs in specifieke cellulaire toestanden is een krachtig hulpmiddel om differentiatie van cellen en organoïden te begeleiden en te programmeren, zieke cellen en / of ongewenste celtypen te identificeren en te vernietigen en de functie van therapeutische cellen te reguleren 1,2,3,4,5 . Het creëren van circuits in zoogdiercellen die celtoestanden van meerdere cellulaire RNA- en / of eiwitsoorten nauwkeurig kunnen classificeren, is echter zeer uitdagend geweest.

Een van de meest tijdrovende stappen van het ontwikkelen van een celclassificatiecircuit is het optimaliseren van de relatieve expressieniveaus van individuele componentgenen, zoals sensoren en verwerkingsfactoren, binnen het circuit. Om circuitoptimalisatie te versnellen en de bouw van meer geavanceerde circuits mogelijk te maken, heeft recent werk wiskundige modellering van celclassificatiecircuits en hun componenten gebruikt om optimale samenstellingen en topologieën te voorspellen 6,7. Hoewel dit tot nu toe krachtige resultaten heeft opgeleverd, wordt wiskundige analyse beperkt door de noodzaak om het input-outputgedrag van componentgenen in het circuit systematisch te karakteriseren, wat tijdrovend is. Verder kunnen een groot aantal contextafhankelijke problemen opduiken in complexe genetische circuits, waardoor het gedrag van een volledig circuit voorspellingen op basis van individuele onderdeelkarakteriseringentart 8,9.

Om sneller complexe zoogdiercircuits zoals celtoestandclassificatoren te ontwikkelen en te testen, ontwikkelde ons lab een techniek genaamd polytransfectie10, een evolutie van plasmide co-transfectieprotocollen. Bij co-transfectie worden meerdere plasmide-DNA-soorten samen met een positief geladen lipide- of polymeerreagens gecomplexeerd en vervolgens op een gecorreleerde manier aan cellen afgeleverd (figuur 1A). Bij polytransfectie worden plasmiden afzonderlijk gecomplexeerd met het reagens, zodat het DNA van elk transfectiecomplex op een gedecorreleerde manier aan cellen wordt afgeleverd (figuur 1B). Met behulp van deze methode worden cellen binnen de getransfecteerde populatie blootgesteld aan talrijke combinaties van verhoudingen van twee of meer DNA-ladingen die verschillende circuitcomponenten dragen.

Om de verhoudingen van circuitcomponenten te meten die aan elke cel worden geleverd, bevat elk transfectiecomplex binnen een polytransfectie een constitutief tot expressie gebrachte fluorescerende reporter die dient als een proxy voor cellulaire opname van het complex. Filler-DNA dat geen elementen bevat die actief zijn in een zoogdiercel, wordt gebruikt om de relatieve hoeveelheid van de fluorescerende reporter en circuitcomponenten af te stemmen die aan een cel worden geleverd in een enkel transfectiecomplex en wordt in meer detail besproken in de discussie. Een voorbeeld van filler-DNA dat in het Weiss-lab wordt gebruikt, is een plasmide met een terminatorsequentie, maar geen promotor, coderende sequentie, enz. Cellen met verschillende verhoudingen van circuitcomponenten kunnen vervolgens worden vergeleken om optimale verhoudingen voor de gencircuitfunctie te vinden. Dit levert op zijn beurt nuttige voorspellingen op voor het kiezen van promotors en andere circuitelementen om optimale genexpressieniveaus te bereiken bij het combineren van circuitcomponenten in een enkele vector voor genetische integratie (bijvoorbeeld een lentivirus, transposon of landingsplatform). Dus in plaats van verhoudingen tussen circuitcomponenten te kiezen op basis van intuïtie of via een tijdrovend proces van vallen en opstaan, evalueert polytransfectie een breed scala aan stoichiometrieën tussen genetische delen in een eenpotreactie.

In ons lab heeft polytransfectie de optimalisatie van vele genetische circuits mogelijk gemaakt, waaronder celclassificaties, feedback- en feedforward-controllers en bistabiele motieven. Deze eenvoudige maar krachtige methode versnelt de ontwerpcycli voor complexe genetische circuits in zoogdiercellen aanzienlijk. Polytransfectie is sindsdien gebruikt om verschillende genetische circuits te karakteriseren om hun multidimensionale input-output overdrachtsfuncties met hoge resolutie10 te onthullen, een alternatieve circuittopologie voor celstatusclassificatie 11 te optimaliseren en verschillende gepubliceerde12,13 en lopende projecten te versnellen.

Hier beschrijven en verbeelden we de workflow voor het gebruik van polytransfectie om een genetisch circuit snel te optimaliseren (figuur 2). Het protocol laat zien hoe hoogwaardige polytransfectiegegevens kunnen worden gegenereerd en verschillende veelvoorkomende fouten in het polytransfectieprotocol en de gegevensanalyse kunnen worden vermeden (figuur 3). Vervolgens wordt gedemonstreerd hoe polytransfectie kan worden gebruikt om eenvoudige circuitcomponenten te karakteriseren en, in het proces, polytransfectieresultaten te benchmarken tegen co-transfectie (figuur 4). Ten slotte tonen de resultaten van polytransfectie optimalisatie van het kankerclassificatiecircuit (figuur 5).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

OPMERKING: Tabel 1 en tabel 2 dienen als belangrijke referenties voor dit protocol. Tabel 1 toont reagenschaling voor reacties en tabel 2 toont dna-ratio-rekenkunde voor een voorbeeld polytransfectie beschreven in het protocol (bovenste helft) en voor een mogelijk vervolgexperiment (onderste helft).

1. Cellen voorbereiden op transfectie

  1. Zorg ervoor dat de kweek van menselijke embryonale niercellen (HEK293) 60% -80% confluent is voordat het protocol wordt gestart. Om dit te doen, zaai 1 x 106 cellen in een 100 mm x 15 mm weefselkweek petrischaal 2 dagen eerder, en incubeer bij 37 °C met 5% CO2.
    OPMERKING: Hoewel ons protocol zich richt op HEK293-cellen, kunnen andere celtypen worden vervangen.
  2. Bereid de media en cellen voor op transfecties zoals hieronder beschreven.
    1. Verwarm ten minste 20 ml van een oplossing van dulbecco's gemodificeerd arendmedium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% niet-essentiële aminozuren (NEAA; zie materiaaltabel) voor tot 37 °C. Verwarm ook minstens 2,4 ml trypsine en 2,4 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 °C. Voorwarm gereduceerd serum medium tot ~16 °C.
      OPMERKING: Alle weefselkweekwerkzaamheden moeten met zorg worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
  3. Resuspendie van de cellen in de DMEM-oplossing zoals hieronder beschreven.
    1. Zuig en verwijder de huidige media. Breng 2 ml PBS aan op de HEK293-celcultuur om de cellen te wassen. Zuig de PBS op en verwijder deze.
    2. Breng 2 ml trypsine aan op de HEK293-celcultuur. Plaats de petrischaal in een couveuse bij 37 °C gedurende 3 minuten of totdat de cellen zich niet meer aan de schaal hechten. Breng de schaal terug naar de bioveiligheidskast en verdun de celoplossing door 8 ml DMEM-oplossing in de plaat te doseren.
    3. Meng de oplossing door meerdere keren zachtjes op en neer te pipetteren. Zuig alle media op en plaats deze in een conische buis van 15 ml.
  4. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 minuten om ze te pelleteren. Zuig de media op (zorg ervoor dat de cellen niet worden opgezogen) en gooi het weg. Resuspendeer de cellen in 5 ml DMEM-oplossing en meng door voorzichtig op en neer te pipetteren.
  5. Schat de huidige celconcentratie met behulp van een geautomatiseerde celteller (vermeld in de materiaaltabel). Zaai zes putjes (in dit voorbeeld) in een 24-well plaat met 1 x 105 cellen (voor een zaaidichtheid van 50.000 cellen/cm2).
  6. Voeg de DMEM-oplossing tot 500 μL toe (voeg eerst DMEM-oplossing toe aan de putjes) en label vervolgens één put per behandeling als volgt: geen kleurcontrole, mKO2-controle, TagBFP-controle, NeonGreen-controle, alle kleurcontrole en polytransfectie 1. TagBFP, mKO2 en NeonGreen controleputten zijn enkele kleurcontroles voor alle fluorescerende eiwitten die zijn opgenomen in de polytransfectie.

2. Transfectie uitvoeren

  1. Bereid buisjes voor elk DNA-aggregaat voor. Zet 1,5 ml microcentrifugebuizen opzij en label de buizen als: geen kleurcontrole, mKO2-controle, TagBFP-controle, NeonGreen-controle, alle kleurcontrole, polytransfectiemix 1 en polytransfectiemix 2.
    1. Voeg 36 μL gereduceerd serummedium toe aan de no color control, mKO2 control, TagBFP control, NeonGreen control en alle color control tubes. Voeg 18 μL gereduceerd serummedium toe aan elk van de polytransfectiemix 1 en polytransfectiemix 2 buisjes.
      OPMERKING: De plasmideconcentraties worden verondersteld 150 ng/μl te zijn.
    2. Voeg 600 ng vulplasmide toe aan de controlebuis zonder kleur. Voeg 300 ng mKO2 en 300 ng vulplasmide toe aan de mKO2-kleurcontrolebuis. Voeg 300 ng TagBFP en 300 ng vulplasmide toe aan de TagBFP-kleurcontrolebuis.
    3. Voeg 300 ng constitutief NeonGreen plasmide en 300 ng vulplasmide toe aan de NeonGreen kleurcontrolebuis. Voeg 100 ng elk van mKO2, TagBFP en constitutieve NeonGreen, evenals 300 ng vulplasmide toe aan de controlebuis voor alle kleuren.
    4. Voeg 150 ng mKO2 toe aan de polytransfectiemix 1 buis. Voeg 75 ng reporter NeonGreen plasmide en 75 ng vulplasmide toe aan de polytransfectiemix 1 buis.
    5. Voeg 150 ng TagBFP toe aan de polytransfectiemix 2 buis. Voeg 75 ng L7ae-plasmide en 75 ng vulplasmide toe aan de polytransfectiemix 2-buis.
  2. Maak de transfectiemastermix in een microcentrifugebuis van 1,5 ml door 216 μl gereduceerd serummedium te combineren met 9,48 μl transfectiereagens (zie tabel 1 voor reagensverhoudingen en reactieschaling). Meng goed door op en neer te pipetteren en zet apart.
  3. Voeg 1,58 μL enhancer-reagens toe aan elk van de no color control, single color control en alle kleurcontrolebuizen. Voeg 79 μL enhancer-reagens toe aan elk van de polytransfectiemengbuizen. Meng elke tube afzonderlijk door krachtig te pipetteren.
  4. Voeg de transfectiemastermix toe aan elke buis die DNA bevat.
    1. Voeg 37,58 μL transfectiemastermix toe aan elk van de no color control, single color control en alle color control tubes. Meng elke tube afzonderlijk door krachtig te pipetteren.
    2. Voeg 18,79 μL transfectiemastermix toe aan elk van de polytransfectiemengbuizen. Meng elke tube afzonderlijk door krachtig te pipetteren.
  5. Doseer de transfectiemengsels in de putten.
    1. Pipetteer 65,97 μL van elke transfectiemix voor de besturingselementen geen kleur, één kleur en alle kleuren in de overeenkomstige putjes.
    2. Pipetteer 32,98 μL van de polytransfectiemeng 1 in de polytransfectieput en draai de plaat snel maar voorzichtig in een strak figuur-achtpatroon langs een plat oppervlak om de complexen effectief te verdelen. Vervolgens pipet 32,98 μL van de polytransfectiemenging 2 in dezelfde polytransfectieput en draai de plaat op dezelfde manier.
  6. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C, met 5% CO2 en zonder schudden, gedurende een periode van 48 uur.
    OPMERKING: Om de levensvatbaarheid van de cel te vergroten, kunnen de celmedia elke 6 uur na transfectie worden vervangen (hoewel dit niet altijd nodig is, en met HEK293-cellen en zijn derivaten, moet men voorzichtig zijn om de cellen niet los te maken van de plaat bij het veranderen van de media).
ReagensAantalSchalen
Gereduceerd serummedium voor DNA-mengsel36 μL per besturingsbuis, 18 μL per polytransfectiebuis0,05 μL gereduceerd serummedium/ng DNA per buis, met 10-20% extra volume om rekening te houden met pipetteren
DNA300-600 ng per buis
P30001,58 μL per besturingsbuis, 0,79 μL per polytransfectiebuis0,0022 μL P3000/ng DNA per buis, met 10-20% extra
Gereduceerd serummedium voor Lipo master mix36 μL per besturingsbuis, 18 μL per polytransfectiebuis0,05 μL gereduceerd serum medium/ng totaal DNA, met 10-20% extra volume om rekening te houden met pipetteren
Transfectie en enhancer reagens1,58 μL per besturingsbuis, 0,79 μL per polytransfectiebuis0,0022 μL Lipofectamine 3000/ng DNA, met 10-20% extra

Tabel 1: Reagenschaling voor transfecties. De tabel geeft de juiste verhouding aan van het op te nemen reagens voor de DNA-hoeveelheid in een enkel putje. Dit kan worden gebruikt om reacties effectief te schalen en mastermixen te vormen. De hoeveelheden reagens zijn geschaald tot een overschot van 20%.

3. Cellen voorbereiden op flowcytometrie

  1. Verwarm ten minste 4,2 ml DMEM-oplossing voor tot 37 °C. Verwarm ten minste 4,2 ml trypsine en 4,2 ml PBS voor tot 37 °C. Houd de fluorescentie-geactiveerde celsorteeroplossing (FACS) op 4 °C totdat deze klaar is voor gebruik.
  2. Resuspendie van de cellen in de FACS-bufferoplossing (PBS aangevuld met 1% BSA, 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur [EDTA] en 0,1% natriumazide [NaN3], om klontering te verminderen; zie materiaaltabel) zoals hieronder beschreven.
    1. Zuig en verwijder de huidige media in elke put. Doseer 5 ml PBS in elke put om de cellen te wassen. Zuig de PBS op en verwijder deze.
    2. Doseer 5 ml trypsine in elk putje. Plaats de plaat in een incubator bij 37 °C gedurende 3 minuten, of totdat de cellen zich niet meer aan de schaal hechten. Breng de plaat terug naar de bioveiligheidskast en verdun de celoplossingen door 5 ml DMEM-oplossing in elk putje te doseren.
    3. Meng voor elk putje de oplossing door meerdere keren zachtjes op en neer te pipetteren. Zuig voor elk putje alle media op en plaats het in een conische buis van 15 ml.
  3. Centrifugeer de cellen op 300 x g gedurende 3 minuten om ze te pelleteren. Zuig de media op, zorg ervoor dat de cellen niet worden geaspireerd en weggegooid. In elke buis, resuspendeerde de cellen in 5 ml FACS-bufferoplossing, mengen door zachtjes op en neer te pipetteren.
  4. Laat elke celsuspensieoplossing door een zeef gaan (om klonten te verwijderen) in afzonderlijke kegelvormige buizen voor flowcytometrie. Houd deze buizen niet langer dan 1 uur op ijs en voer zo snel mogelijk flowcytometrie uit.

4. Uitvoeren van flowcytometrie

OPMERKING: Het bedienen van een flowcytometer vereist een goede training en kennis van de noodzakelijke taken. Aangezien software en apparatuur kunnen variëren en gebruikers in het algemeen moeten worden getraind, verwijst deze sectie naar specifieke bewerkingen die nuttig zijn om uit te voeren.

  1. Onderzoek eerst de cellen die zijn getransfecteerd met de vulplasmidecontrole (geen kleurcontrole) om te selecteren op celkenmerken en afwijkingen (inclusief aggregaten, puin, enz.) te voorkomen. Hoewel er veel combinaties van parameters zijn om cellen te onderscheiden, gebruikt u de volgende drie algemene opties als een goede manier om onderscheidende kenmerken te visualiseren.
    1. Kijk naar het zijverstrooiingsgebied (log of lineaire schaal per voorkeur/celtype) versus het voorwaartse spreidingsgebied (lineaire schaal).
    2. Kijk naar de zijspreidingshoogte (logschaal) versus de zijspreidingsbreedte (lineaire schaal).
    3. Kijk naar de voorwaartse spreidingsbreedte (lineaire schaal) versus de voorwaartse spreidingshoogte (lineaire schaal).
  2. Kijk vervolgens naar de besturingselementen voor één kleur. Gebruik de all color control om de instrumentspanningen af te stemmen, zodat de signalen van elk fluorescerend eiwit worden genormaliseerd tot equivalente willekeurige eenheden (a.u.) van fluorescentie. Voer vervolgens de enkele kleurregelaars uit voor elk fluorescerend eiwit, die worden gebruikt om de compensatiematrix in te stellen, waardoor doorbloedingscorrectie mogelijk is.
    OPMERKING: Idealiter zou het volledige dynamische bereik van de fluorescentiewaarden zichtbaar moeten zijn. Verdere normalisatie van fluorescerende eiwitsignalen kan worden gedaan via conversie naar gestandaardiseerde eenheden (bijv. Moleculen van equivalent fluoresceïne [MEFLs; zie Beal et al.15]). Om MEFL-conversie tijdens de analyse mogelijk te maken, voert u regenboogkalibratieparels uit. Een dergelijke kalibratie is ook nuttig voor het verminderen van instrument-tot-instrument en dagelijkse signaalvariatie16.
  3. Voer de polytransfectiemonsterbuis uit.
    OPMERKING: Waar mogelijk wordt aanbevolen om 1.000 x 10 ^ (^ = mengsels) cellen uit te voeren, omdat hogerdimensionale polytransfecties tijdens de analyse in meer bakken moeten worden onderverdeeld en elke bak voldoende cellen nodig heeft (idealiter >10) om statistisch significante vergelijkingen te maken.

5. Uitvoeren van post-experiment analyse

  1. Gebruik in eerste instantie gegevens van de bedieningselementen (en, indien van toepassing, de kralen) om nauwkeurige resultaten te garanderen. Gebruik een van de beschikbare softwaretools om live cell gating (met behulp van poorten zoals hierboven beschreven), compensatie en autofluorescentiecorrectie uit te voeren.
    OPMERKING: We gebruiken meestal aangepaste MATLAB-code (bijv. https://github.com/jonesr18/MATLAB_Flow_Analysis of Cytoflow17), die zowel een grafische gebruikersinterface als een python-bibliotheek heeft die geschikt is voor de voorbewerkingsfase en voor polytransfectieanalyse.
MethodeComplexng Fluorescerende Markerng L7ae (fractie)ng Reporter (fractie)ng Filler DNA (fractie)Totaal (ng)
Polytransfectie 1600
→115075 (½)75 (½)300
→215075 (½)75 (½)300
Polytransfectie 2600
→115025 (1/6)125 (5/6)300
→2150125 (5/6)25(1/6)300

Tabel 2: DNA-hoeveelheden voor polytransfectie aangetoond in het protocol, en een voorbeeld vervolgexperiment met afgestemde plasmideverhoudingen. De bovenste helft van de tabel toont de samenstelling van plasmiden die worden gebruikt in een eenvoudig polytransfectie-experiment. De onderste helft toont de samenstelling van een bijgewerkt experiment dat de plasmideverhoudingen aanpast om een hypothetische concentratieruimte beter te subsamplen, waarbij de genexpressiemodulator een meer optimale 1: 5-verhouding heeft ten opzichte van zijn reporter, wat meer getransfecteerde cellen oplevert om rond deze verhouding te bemonsteren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In figuur 1 vergelijken we co-transfectie met polytransfectie. In een co-transfectie worden alle plasmiden in dezelfde transfectiemix afgeleverd, wat resulteert in een hoge correlatie tussen de hoeveelheid van elk plasmide die een enkele cel ontvangt (figuur 1A). Hoewel het aantal totale plasmiden dat aan elke cel wordt geleverd aanzienlijk varieert, is de fluorescentie van de twee reporter-eiwitten in de individuele cellen in de populatie goed gecorreleerd, wat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Rapid prototyping-methoden zoals computerondersteund ontwerp (CAD), breadboarden en 3D-printen hebben een revolutie teweeggebracht in mechanische, elektrische en civieltechnische disciplines. Het vermogen om snel door vele mogelijke oplossingen voor een bepaalde uitdaging te zoeken, versnelt de vooruitgang in een veld aanzienlijk. Wij geloven dat polytransfectie een analoge technologie is voor biologische engineering, die snelle prototyping van genetische circuits mogelijk maakt. Bovendien vereisen andere rapid prototypi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

R.W. is mede-oprichter van Strand Therapeutics en Replay Bio; R.W. en R.J. dienden een voorlopig patent in met betrekking tot een celtypeclassificatie.

Dankbetuigingen

We willen graag voormalige Weiss Lab-leden bedanken die hebben geleid of bijgedragen aan de ontwikkeling van de polytransfectiemethode en de toepassing ervan op celclassificaties: Jeremy Gam, Bre DiAndreth en Jin Huh; andere Weiss-lableden die hebben bijgedragen aan verdere ontwikkeling / optimalisatie van methoden: Wenlong Xu, Lei Wang en Christian Cuba-Samaniego; Prof. Josh Leonard en groepsleden, waaronder Patrick Donahue en Hailey Edelstein, voor het testen van polytransfectie en het geven van feedback; en Prof. Nika Shakiba voor het uitnodigen van dit manuscript en het geven van feedback. We willen ook de National Institutes of Health [R01CA173712, R01CA207029, P50GM098792] bedanken; Nationale Wetenschapsstichting [1745645]; Cancer Center Support (core) Grant [P30CCA14051, gedeeltelijk] van de NCI en National Institutes of Health [P50GM098792] voor de financiering van dit werk.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15mL Corning Falcon kegelbuisjesThermoFisher Scientific14-959-53A
24-well petrischaalElke gewenste maatschappij(Niet-pyrogeen, steriele, RNase, DNase, DNA en pyrogeenvrij)
Bovine serum albumineNEBB9000S
CentrifugeElke gewenste maatschappijIn staat om 15mL Falcon buisjes bloot te stellen aan 300 rcf
Countess 3 Geautomatiseerde celtellerThermoFisher ScientificAMQAX2000
Countess Celtellingkamer SlidesThermoFisher ScientificC10228
CytoflowNiet-commercieel softwarepakkethttps://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/# 
DMEMVWR10-013-CVGebruik de juiste media voor uw celtype
EDTAThermoFisher Scientific03690-100ML
Foetaal bovien serumSigma AldrichF4135
HEK cellenATCCCRL-1573Gebruik het relevante celtype voor uw experimenten. HEK cellen hebben de neiging om zeer efficiënt te transfecteren.
HeLa cellenATCCCRL-12401Gebruik het relevante celtype voor uw experimenten.
Lipofectamine 3000 en P3000 enhancerThermoFisher ScientificL3000001Gebruik het juiste reagens voor uw celtype; transfectie en enhancer reagens
LSRFortessa flow cytometerBD BiosciencesN/A
MEM Niet-essentiële aminozuren oplossingGibco11140050
Microcentrifugebuisjes, 1.5 mLElke gewenste maatschappij
Opti-MEMThermoFisher Scientific31985070reductie serum medium
Fosfaat gebufferde zoutoplossingThermoFisher Scientific70011044
Rainbow kalibratie kralenSpherotechURCP-100-2H
NatriumazidSigma AldrichS2002
TrypsineVWR25-053-CI

Referenties

  1. Prochazka, L., Benenson, Y., Zandstra, P. W. Synthetic gene circuits and cellular decision-making in human pluripotent stem cells. Current Opinion in Systems Biology. 5, 93-103 (2017).
  2. Sayeg, M. K., et al. Rationally designed microRNA-based genetic classifiers target specific neurons in the brain. ACS Synthetic Biology. 4 (7), 788-795 (2015).
  3. Zhen, X., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-Input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. 333 (6047), 1307-1311 (2011).
  4. Nissim, L., et al. Synthetic RNA-based immunomodulatory gene circuits for cancer immunotherapy. Cell. 171 (5), 1138-1150 (2017).
  5. Nissim, L., Bar-Ziv, R. H. A tunable dual-promoter integrator for targeting of cancer cells. Molecular Systems Biology. 6, 444(2010).
  6. Mohammadi, P., Castel, S. E., Brown, A. A., Lappalainen, T. Quantifying the regulatory effect size of cis-acting genetic variation using allelic fold change. Genome Research. 27 (11), 1872-1884 (2017).
  7. Prochazka, L., et al. Discrete-to-analog signal pluripotent stem cells conversion in human. BioRxiv. , (2021).
  8. Del Vecchio, D. Modularity, context-dependence, and insulation in engineered biological circuits. Trends in Biotechnology. 33 (2), 111-119 (2015).
  9. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  10. Gam, J. J., DiAndreth, B., Jones, R. D., Huh, J., Weiss, R. A 'poly-transfection' method for rapid, one-pot characterization and optimization of genetic systems. Nucleic Acids Research. 47 (18), 106(2019).
  11. Jones, R. D., et al. Robust and tunable signal processing in mammalian cells via engineered covalent modification cycles. Nature Communications. 13 (1), 1720(2022).
  12. Jones, R. D., et al. An endoribonuclease-based feedforward controller for decoupling resource-limited genetic modules in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 5690(2020).
  13. DiAndreth, B., Wauford, N., Hu, E., Palacios, S., Weiss, R. PERSIST platform provides programmable RNA regulation using CRISPR endoRNases. Nature Communications. 13 (1), 2582(2022).
  14. Frei, T., et al. Characterization and mitigation of gene expression burden in mammalian cells. Nature Communications. 11 (1), 4641(2020).
  15. Beal, J., Weiss, R., Yaman, F., Adler, A., Davidsohn, N. A method for fast, high-precision characterization of synthetic biology devices. Computer Science and Artificial Intelligence Laboratory Technical Report. Massachusetts institute of technology. , Cambridge. MIT-CSAIL-TR-2012-008 (2012).
  16. Beal, J., et al. Meeting measurement precision requirements for effective engineering of genetic regulatory networks. ACS Synthetic Biology. 11 (3), 1196-1207 (2022).
  17. Teague, B. Cytoflow: A Python toolbox for flow cytometry. bioRxiv. , (2022).
  18. Ferreira, J. P., Overton, K. W., Wang, C. L. Tuning gene expression with synthetic upstream open reading frames). Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11284-11289 (2013).
  19. Michaels, Y. S., et al. Precise tuning of gene expression levels in mammalian cells. Nature Communications. 10 (1), 818(2019).
  20. Saito, H., et al. Synthetic translational regulation by an L7Ae-kink-turn RNP switch. Nature Chemical Biology. 6 (1), 71-78 (2010).
  21. Wroblewska, L., et al. Mammalian synthetic circuits with RNA binding proteins for RNA-only delivery. Nature Biotechnology. 33 (8), 839-841 (2015).
  22. Wagner, T. E., et al. Small-molecule-based regulation of RNA-delivered circuits in mammalian cells. Nature Chemical Biology. 14 (11), 1043-1050 (2018).
  23. Sekuklu, S. D., Donoghue, M. T. A., Spillane, C. miR-21 as a key regulator of oncogenic processes. Biochemical Society Transactions. 37, 918-925 (2009).
  24. Stanton, B. C., et al. Genomic mining of prokaryotic repressors for orthogonal logic gates. Nature Chemical Biology. 10 (2), 99-105 (2014).
  25. Stanton, B. C., et al. Systematic transfer of prokaryotic sensors and circuits to mammalian cells. ACS Synthetic Biology. 3 (12), 880-891 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Genetische circuitszoogdiercellenflowcytometrieco-transfectieoptimalisatie van DNA-ratiofluorescente reporterscelclassificatorsynthetische biologie
Snelle ontwikkeling van celtoestandsidentificatiecircuits met polytransfectie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.