Dit artikel introduceert een nieuwe methode voor de synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix (DC-ECM) hydrogels. DC-ECM-hydrogels hebben een uitstekende biocompatibiliteit en bieden een superieure micro-omgeving voor celgroei. Daarom kunnen ze ideale celsteigers en biologische afgiftesystemen zijn.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Synthese van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix (DC-ECM) hydrogels zijn veelbelovende biomaterialen voor weefselmanipulatie en regeneratieve geneeskunde vanwege hun biocompatibiliteit en het vermogen om natuurlijke weefseleigenschappen na te bootsen. Dit protocol heeft tot doel DC-ECM-hydrogels te produceren die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen. Het protocol omvat een combinatie van fysische en chemische verstoring en enzymatische vertering om het celmateriaal te verwijderen met behoud van de structuur en samenstelling van de ECM. De DC-ECM wordt verknoopt met behulp van een chemisch middel om een stabiele en biologisch actieve hydrogel te vormen. De DC-ECM-hydrogel heeft een uitstekende biologische activiteit, ruimtelijke structuur en biologische inductiefunctie, evenals een lage immunogeniciteit. Deze eigenschappen zijn gunstig voor het bevorderen van celadhesie, proliferatie, differentiatie en migratie en voor het creëren van een superieure micro-omgeving voor celgroei. Dit protocol biedt een waardevolle bron voor onderzoekers en clinici op het gebied van weefselmanipulatie. Biomimetische hydrogels kunnen mogelijk de ontwikkeling van effectieve weefselmanipulatiestrategieën voor kraakbeenherstel en -regeneratie bevorderen.
Inleiding
Kraakbeenweefselmanipulatie is een zich snel ontwikkelend vakgebied dat tot doel heeft beschadigd of ziek kraakbeenweefsel te regenereren1. Een belangrijke uitdaging op dit gebied is de ontwikkeling van biomimetische steigers die de groei en differentiatie van chondrocyten, de cellen die verantwoordelijk zijn voor de productie van kraakbeen, kunnen ondersteunen. De ECM van kraakbeenweefsel speelt een cruciale rol bij het reguleren van het gedrag van chondrocyten. DC-ECM is een effectieve steiger voor weefselmanipulatietoepassingen3.
Er zijn een aantal technieken ontwikkeld om DC-ECM uit kraakbeenweefsel te produceren, waaronder chemische, enzymatische en fysische methoden. Deze methoden resulteren echter vaak in het genereren van ECM-hydrogels die onvoldoende biomimetisch zijn, wat hun potentieel voor gebruik in weefselmanipulatietoepassingen beperkt 4,5. Er is dus behoefte aan een effectievere methode voor het produceren van DC-ECM-hydrogels.
De ontwikkeling van deze techniek is belangrijk omdat het het gebied van weefselmanipulatie vooruit kan helpen door een nieuwe benadering te bieden voor het creëren van biomimetische steigers die weefselregeneratie en -herstel kunnen ondersteunen. Bovendien zou deze techniek gemakkelijk kunnen worden aangepast om ECM-hydrogels uit andere weefsels te produceren, waardoor de potentiële toepassingen ervan worden uitgebreid.
In de bredere literatuur is er een groeiende belangstelling voor het gebruik van DC-ECM als steiger voor weefselmanipulatietoepassingen6. Talrijke studies hebben de effectiviteit van DC-ECM-hydrogels aangetoond bij het bevorderen van celgroei en differentiatie in verschillende weefsels, waaronder kraakbeen 7,8. Daarom is de ontwikkeling van een protocol voor het produceren van DC-ECM-hydrogels die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen, een belangrijke bijdrage aan het veld.
Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, komt in deze behoefte tegemoet door een nieuwe methode te bieden voor het produceren van DC-ECM-hydrogels die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen. Het protocol omvat het decellulariseren van kraakbeenweefsel, het isoleren van de resulterende ECM en het creëren van een hydrogel door de ECM te verknopen met een biocompatibel polymeer. De resulterende hydrogel heeft veelbelovende resultaten laten zien bij het ondersteunen van de groei en differentiatie van chondrocyten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Tongde-ziekenhuis in de provincie Zhejiang.
1. Bereiding van de DC-ECM-hydrogel
OPMERKING: In deze studie werd het kraakbeen verkregen uit de kniegewrichten van 12 maanden oude Bama-miniatuurvarkens, waardoor de verzameling van botweefsel werd vermeden.
- Neem het verzamelde kraakbeen en blokkeer en hak het in 1-2 mm3 stukken met een scalpel.
- Doe 20 g van het gehakte kraakbeen in een centrifugebuisje van 50 ml en voeg 20 ml hypotone Tris-HCl-buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0) toe om het weefsel volledig onder te dompelen. Plaats de centrifugebuis gedurende 3 uur in een vriezer van -80 °C en vervolgens gedurende 3 uur in een oven van 37 °C. Herhaal de stap voor invriezen en verwarmen zes keer. In deze stap hoeft de hypotone Tris-HCl-buffer niet te worden vervangen.
- Schud de centrifugebuis gedurende 30 s met behulp van een vortexmixer met een snelheid van 1.000 tpm. Plaats een roestvrijstalen zeef (poriegrootte: ~250 μm) op een nieuwe centrifugebuis van 50 ml.
- Decanteer het gedecellulariseerde kraakbeen langzaam in de roestvrijstalen zeef, was het weefsel drie keer met steriele PBS en vang het kraakbeen op.
- Voeg 10 ml trypsine-oplossing toe (0,25% trypsine in PBS) en plaats de tube gedurende 24 uur op een shaker bij 37 °C. Vervang gedurende deze periode de trypsine om de 4 uur. Filtreer de suspensie met behulp van de roestvrijstalen zeef en bewaar het weefsel. De trypsine kan 's nachts worden behandeld tijdens een van de verteringsprocessen, en dit heeft geen invloed op de uiteindelijke vertering.
- Was het getrypsiniseerde weefsel met hypertone buffer (1,5 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,6).
- Voeg 10 ml nuclease-oplossing toe (50 E/ml deoxyribonuclease en 1 E/ml ribonuclease in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) en plaats de tube gedurende 4 uur op een shaker bij 37 °C.
- Verwijder de nuclease-oplossing, was het kraakbeen driemaal met steriele PBS en voeg hypotone Tris-HCl-oplossing toe. Plaats de centrifugebuis op een shaker en spoel gedurende 20 uur op kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de hypotone Tris-HCl-oplossing, was het kraakbeen driemaal met steriele PBS en voeg 1% Triton X-100-oplossing toe om het weefsel gedurende 24 uur onder te dompelen.
- Verwijder de Triton X-100-oplossing en spoel het gedecellulariseerde kraakbeen gedurende 3 dagen grondig af met gedestilleerd water, waarbij u het gedestilleerde water elke 12 uur ververst.
- Week het kraakbeen gedurende 4 uur in een perazijnzuuroplossing (0,1% PAA in 4% ethanol). Verwijder de perazijnzuuroplossing en was het kraakbeen drie keer met steriel gedestilleerd water.
- Plaats de roestvrijstalen zeef (poriegrootte: ~250 μm) op een centrifugebuis van 50 ml. Decanteer het gedecellulariseerde kraakbeen langzaam in de roestvrijstalen zeef en vang het kraakbeen op. Test de mate van decellularisatie en het behoud van de matrix van het kraakbeen door het gehalte aan DNA, collageen en glycosaminoglycaan (GAG) te schatten.
- Doe het gedecellulariseerde kraakbeen in een maalkom, voeg vloeibare stikstof toe en maal het gedecellulariseerde kraakbeen tot een poeder. Neem 2 g van het gedecellulariseerde kraakbeenpoeder, voeg 80 ml 0,5 M azijnzuur en 20 mg pepsine toe en verteer gedurende 24 uur. Centrifugeer op 400 x g gedurende 10 minuten; gooi het bezinksel weg en vang de supernatansoplossing (DC-ECM-oplossing) op.
- Decanteer 1 ml DC-ECM-oplossing per putje in platen met 6 putjes. Plaats de 6-wells platen in een lyofilisator. Vries de DC-ECM-oplossing in. Zodra de temperatuur in de vriesdroger daalt tot -40 °C, zet u de vacuümpomp aan en houdt u de vacuümgraad gedurende 22 uur op 10 Pa.
- Haal de gevriesdroogde DC-ECM-oplossing eruit, plaats deze in centrifugebuizen en bewaar bij -20 °C. De minimale opslagperiode van gevriesdroogde DC-ECM-oplossing is meer dan een half jaar.
- Voeg 1 ml steriel gedestilleerd water toe om 20 mg gevriesdroogde DC-ECM-oplossing in de centrifugebuis op te lossen. Schud gedurende 1 minuut met behulp van een vortexmixer met een snelheid van 1.000 tpm bij RT. Voeg 1 mg vitamine B2 (0,1% g/v) toe aan de DC-ECM-oplossing, incubeer gedurende 60 minuten bij 37 °C en bestraal gedurende 3 minuten met UV-licht (370 nm, 3,5 mW/cm2) om een hydrogel (DC-ECM-hydrogel) te vormen.
2. Detectie van gedecellulariseerd kraakbeen
- DNA-gehaltedetectie van gedecellulariseerd kraakbeen
LET OP: Extraheer het DNA met behulp van de DNEasy Blood & Tissue Kit.- Neem eerst 20 mg DC-ECM-kraakbeen in een centrifugebuis. Voeg 180 μL buffer GTL en 20 μL proteïnase K toe door vortexoscillatie en incubeer het kraakbeen gedurende 4 uur bij 56 °C totdat het volledig is opgelost.
- Schud de centrifugebuis gedurende 15 s met behulp van een vortexmixer met een snelheid van 1.000 tpm bij RT. Voeg vervolgens 200 μL Buffer GL en watervrije ethanol toe en meng grondig door vortextrillingen. Centrifugeer de monsters gedurende 1 minuut met een snelheid van 6.000 x g bij 4 °C.
- Voeg 500 μL buffer GW1 toe aan de adsorptiekolom en centrifugeer de monsters gedurende 1 minuut met een snelheid van 12.000 x g bij 4 °C. Voeg 500 μL buffer GW2 toe aan de adsorptiekolom en centrifugeer gedurende 1 minuut bij 20.000 x g bij 4 °C. Voeg ten slotte 50 μL gesteriliseerd water toe aan de adsorptiekolom en centrifugeer gedurende 1 minuut met een snelheid van 6.000 x g bij 4 °C om de DNA-oplossing op te vangen. Bepaal het DNA-gehalte met behulp van een spectrofotometer.
- Detectie van collageengehalte in het gedecellulariseerde kraakbeen
- Om het collageengehalte in het gedecellulariseerde kraakbeen te detecteren, gebruikt u hydroxyproline als collageenaminozuurmarker. Zuur 5 mg gedecelluleerd kraakbeen aan met 5 ml zoutzuur 6 M bij 100 °C gedurende 20 minuten en neutraliseer het vervolgens met 5 ml natriumhydroxideoplossing van 6 M.
- Bereken het gehalte aan hydroxyproline door de extinctie van het monster bij 570 nm te meten met een spectrofotometer. Verkrijg een concentratie-absorptie lineaire regressie met behulp van het standaard hydroxyprolinemonster.
- Detectie van GAG-gehalte in het gedecellulariseerde kraakbeen
OPMERKING: Het GAG-gehalte in het DC-ECM-kraakbeen werd gedetecteerd met behulp van een colorimetrische kwantitatieve detectiekit voor GAG in weefsel. Alle onderstaande reagentia zijn beschikbaar in de kit.- Neem 200 mg DC-ECM-kraakbeenpoeder en voeg 500 μL reagens A toe door vortexoscillatie. Incubeer het monster gedurende 16 uur bij 4 °C en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 14.000 x g .
- Neem 50 ml monsteroplossing en voeg 50 μl zoutrijke oplossing (reagens B) en 50 μl zuuroplossing (reagens C) toe door vortexoscillatie. Incubeer het monster gedurende 10 minuten.
- Voeg 750 μL kleurstofoplossing (reagens D) toe door vortexoscillatie en incubeer het monster gedurende 30 minuten in donkere omstandigheden. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op 14.000 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 μL reinigingsoplossing (Reagens E) toe en meng goed. Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten bij 14.000 x g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 1 μL dissociatieoplossing (reagens F) toe aan het monster en meng goed. Incubeer het monster gedurende 30 minuten onder donkere omstandigheden. Bepaal ten slotte het GAG-gehalte met behulp van een spectrofotometer bij 600 nm.
- Scanning elektronenmicroscoop (SEM) en transmissie elektronenmicroscoop (TEM) analyse van het gedecellulariseerde kraakbeen
- Vergelijk het gedecellulariseerde kraakbeen en het normale kraakbeenweefsel. Plaats het monster in een 2,5% glutaaraldehyde-oplossing, incubeer het een nacht bij 4 °C en was het vervolgens driemaal met PBS.
- Fixeer het monster gedurende 1 uur in 1% OsO4 en was het vervolgens drie keer met PBS.
- Dehydrateer het monster door achtereenvolgens onderdompeling in 50%, 70%, 90% en 100% ethanol, evenals 100% aceton gedurende elk 15 minuten. Breng het monster gedurende 15 minuten in een gemengde oplossing van hexamethyldisilazaan en ethanol (1:1), gevolgd door onderdompeling in zuiver hexamethyldisilazaan gedurende 15 minuten.
- Plaats het monster in een HCP-2-droger en droog het vervolgens met vloeibare stikstof. Smeer vervolgens het volledig gedroogde preparaat in met een dunne laag goud-palladium met behulp van sputtercoating en beeld af met SEM. De sputtercoating werd uitgevoerd met een vermogen van 120 W gedurende 5 minuten. Het experiment werd uitgevoerd onder de volgende omstandigheden: een werkspanning van 15 kV en een vacuümgraad lager dan 5 x 10−5 Pa.
- Voor de TEM-analyse wordt het monster gedurende 1 uur in een mengsel van watervrij aceton en hars (1:1) geplaatst, gevolgd door een mengsel van watervrij aceton en hars (1:3) gedurende 3 uur. Plaats het monster vervolgens een nacht in hars.
- Plaats het monster in ingebedde met medium gevulde capsules en verwarm gedurende 9 uur op 70 °C.
- Snijd het monster na het inbedden in dunne plakjes van 70 nm met behulp van een ultrafijne microtoom en leg het op een koperen gaas.
- Spuit 20 μL uranylacetaatkleuringsoplossing op het koperen gaas en kleurs gedurende 15 minuten bij RT. Verwijder de kleuroplossing door het gaas twee keer voorzichtig te wassen met gedestilleerd water.
- Spuit vervolgens 20 μL loodcitraatkleuringsoplossing op het koperen gaas en kleur gedurende 15 minuten bij RT. Was het gaas drie keer met gedestilleerd water.
- Plaats het koperen gaas op een schone petrischaal bekleed met filtreerpapier. Fotografeer de secties na het drogen aan de lucht met TEM. De sonde werd aangebracht met een neerwaartse kracht van 500 nN, gescand met een snelheid van 1 Hz en had een elastische constante (k-waarde) van 40 Nm-1. De straal van de sondepunt werd gemeten op 8 nm.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om een betere DC-ECM-kraakbeenhydrogel te bereiden, hebben we de eerdere literatuur bestudeerd en beoordeeld en de verschillende decellularisatieprotocollen vergeleken in termen van de decellularisatieratio, immunogeniciteit en mechanische functionaliteit9.
Op basis hiervan bereidden we de DC-ECM kraakbeenhydrogel voor en onderzochten we het effect van een radiaal georiënteerde extractieve matrix/mesenchymale stamcel exosoom bio-inkt bij de behandeling van osteochondral...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een systematische aanpak voor de bereiding van gedecellulariseerde kraakbeen extracellulaire matrix hydrogels die de natuurlijke ECM van kraakbeenweefsel nauw nabootsen. Het protocol omvat een combinatie van fysische, chemische en enzymatische verstoring om cellulair materiaal te verwijderen met behoud van de structuur en samenstelling van de ECM. De kritieke stappen van het protocol omvatten het aanpassen van de decellularisatietijd en -methoden en het zorgen voor volledige decellularisatie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gesponsord door het Medicine and Health Technology Plan van de provincie Zhejiang (2019KY050), het Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan van de provincie Zhejiang (2019ZA026), het Key Research and Development Plan in de provincie Zhejiang (subsidie nr. 2020C03043), het Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan van de provincie Zhejiang (2021ZQ021) en de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ22H060007).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl, pH7.6 | Beyotime | ST776-100 mL | |
| 1 M Tris-HCl, pH8.0 | Beyotime | ST780-500 mL | |
| -80 °C Freezer | Eppendorf | F440340034 | |
| Deoxyribonuclease | Aladdin | D128600-80KU | |
| DNEasy Blood &Tissue Kit | Qiagen | No. 69506 | |
| GAG colorimetric quantitative detection kit | Shanghai Haling | HL19236.2 | |
| HCP-2 dryer | Hitachi | N/A | |
| Nanodrop8000 | Thermo Fisher | N/A | Spectrofotometer |
| PBS (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Ribonuclease | Aladdin | R341325-100 mg | |
| Sigma500 | ZIESS | N/A | Scanning elektronenmicroscoop |
| Spectra S | Thermo Fisher | N/A | Transmissie elektronenmicroscoop |
| Roestvrijstalen zeef | SHXB-Z-1 | Shanghai Xinbu | |
| Triton X-100 | Beyotime | P0096-500 mL | |
| Trypsine | Gibco | 15050065 | |
| Uv-lamp | Omnicure 2000 | N/A | |
| Vitamine B2 | Gibco | R4500-5G | |
| Vortex mixer | Shanghai Qiasen | 78HW-1 |
Referenties
- Vega, S. L., Kwon, M. Y., Burdick, J. A. Recent advances in hydrogels for cartilage tissue engineering. European Cells & Materials. 33, 59-75 (2017).
- Yang, J., Zhang, Y. S., Yue, K., Khademhosseini, A. Cell-laden hydrogels for osteochondral and cartilage tissue engineering. Acta Biomaterialia. 57, 1-25 (2017).
- Bejleri, D., Davis, M. E. Decellularized extracellular matrix materials for cardiac repair and regeneration. Advanced Healthcare Materials. 8 (5), e1801217(2019).
- Brown, M., Li, J., Moraes, C., Tabrizian, M., Li-Jessen, N. Y. K. Decellularized extracellular matrix: New promising and challenging biomaterials for regenerative medicine. Biomaterials. 289, 121786(2022).
- Barbulescu, G. I., et al. Decellularized extracellular matrix scaffolds for cardiovascular tissue engineering: Current techniques and challenges. International Journal of Molecular Sciences. 23 (21), 13040(2022).
- Zhang, W., Du, A., Liu, S., Lv, M., Chen, S. Research progress in decellularized extracellular matrix-derived hydrogels. Regenerative Therapy. 18, 88-96 (2021).
- Zhu, W., et al. Cell-derived decellularized extracellular matrix scaffolds for articular cartilage repair. International Journal of Artificial Organs. 44 (4), 269-281 (2021).
- Li, T., Javed, R., Ao, Q. Xenogeneic decellularized extracellular matrix-based biomaterials for peripheral nerve repair and regeneration. Current Neuropharmacology. 19 (12), 2152-2163 (2021).
- Xia, C., et al. Decellularized cartilage as a prospective scaffold for cartilage repair. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 101, 588-595 (2019).
- Chen, P., et al. Desktop-stereolithography 3D printing of a radially oriented extracellular matrix/mesenchymal stem cell exosome bioink for osteochondral defect regeneration. Theranostics. 9 (9), 2439-2459 (2019).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Yuan, X., et al. Stem cell delivery in tissue-specific hydrogel enabled meniscal repair in an orthotopic rat model. Biomaterials. 132, 59-71 (2017).
- Zheng, L., et al. Intensified stiffness and photodynamic provocation in a collagen-based composite hydrogel drive chondrogenesis. Advanced Science. 6 (16), 1900099(2019).
- Young, J. L., Holle, A. W., Spatz, J. P.Nanoscale and mechanical properties of the physiological cell-ECM microenvironment. Experimental Cell Research. 343 (1), 3-6 (2016).
- Abdolghafoorian, H., et al. Effect of heart valve decellularization on xenograft rejection. Experimental and Clinical Transplantation. 15 (3), 329-336 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
