Onderzoekende RNA-structuur met dimethylsulfaatmutatieprofilering met sequencing in vitro en in cellen

Samenvatting

Het protocol geeft instructies voor het modificeren van RNA met dimethylsulfaat voor mutatieprofileringsexperimenten. Het omvat in vitro en in vivo tasten met twee alternatieve bibliotheekvoorbereidingsmethoden.

Samenvatting

De rol van RNA-structuur in vrijwel elk biologisch proces is steeds duidelijker geworden, vooral in het afgelopen decennium. Klassieke benaderingen voor het oplossen van RNA-structuur, zoals RNA-kristallografie of cryo-EM, hebben echter geen gelijke tred gehouden met het snel evoluerende veld en de behoefte aan oplossingen met hoge doorvoer. Mutatieprofilering met sequencing met behulp van dimethylsulfaat (DMS) MaPseq is een op sequencing gebaseerde benadering om de RNA-structuur af te leiden uit de reactiviteit van een base met DMS. DMS methyleert de N1-stikstof in adenosines en de N3 in cytosines aan hun Watson-Crick-gezicht wanneer de base is ongepaard. Het omgekeerd transcriberen van het gemodificeerde RNA met de thermostabiele groep II intron reverse transcriptase (TGIRT-III) leidt ertoe dat de gemethyleerde basen als mutaties in het cDNA worden opgenomen. Bij het sequentiëren van het resulterende cDNA en het in kaart brengen ervan naar een referentietranscript, zijn de relatieve mutatiesnelheden voor elke base indicatief voor de "status" van de base als gepaard of ongepaard. Hoewel DMS-reactiviteiten zowel in vitro als in cellen een hoge signaal-ruisverhouding hebben, is deze methode gevoelig voor vertekening in de behandelingsprocedures. Om deze bias te verminderen, biedt dit artikel een protocol voor RNA-behandeling met DMS in cellen en met in vitro getranscribeerd RNA.

Inleiding

Sinds de ontdekking dat RNA zowel structurele ^1,2 als katalytische³ eigenschappen heeft, is het belang van RNA en zijn regulerende functie in een overvloed aan biologische processen geleidelijk blootgelegd. Inderdaad, het effect van RNA-structuur op genregulatie heeft steeds meer aandacht gekregen⁴. Net als eiwitten heeft RNA primaire, secundaire en tertiaire structuren, verwijzend naar de volgorde van nucleotiden, de 2D-mapping van base-pairing interacties en de 3D-vouwing van deze base-paired structuren, respectievelijk. Hoewel het bepalen van de tertiaire structuur de sleutel is tot het begrijpen van de exacte mechanismen achter RNA-afhankelijke processen, is de secundaire structuur ook zeer informatief over de RNA-functie en is de basis voor verdere 3D-vouwing⁵.

Het bepalen van de RNA-structuur is echter intrinsiek uitdagend geweest met conventionele benaderingen. Terwijl voor eiwitten kristallografie, nucleaire magnetische resonantie (NMR) en cryogene elektronenmicroscopie (cryo-EM) het mogelijk hebben gemaakt om de diversiteit van structurele motieven te bepalen, waardoor structuurvoorspelling alleen uit de sequentie^{mogelijk is 6}, zijn deze benaderingen niet algemeen toepasbaar op RNA's. Inderdaad, RNA's zijn flexibele moleculen met bouwstenen (nucleotiden) die veel meer conformatie- en rotatievrijheid hebben in vergelijking met hun aminozuurtegenhangers. Bovendien zijn de interacties door base-pairing dynamischer en veelzijdiger dan die van aminozuurresiduen. Als gevolg hiervan zijn klassieke benaderingen alleen succesvol geweest voor relatief kleine RNA's met goed gedefinieerde, zeer compacte structuren⁷.

Een andere benadering om de RNA-structuur te bepalen is door middel van chemisch onderzoek in combinatie met next-generation sequencing (NGS). Deze strategie genereert informatie over de bindingsstatus van elk base in een RNA-sequentie (d.w.z. de secundaire structuur). Kortom, de basen in een RNA-molecuul die zich niet bezighouden met base-pairing worden differentieel gemodificeerd door kleine chemische verbindingen. Het reverse-transcriberen van deze RNA's met gespecialiseerde reverse transcriptases (RT's) omvat de modificaties in complementair desoxyribonucleïnezuur (cDNA) als mutaties. Deze cDNA-moleculen worden vervolgens versterkt door de polymerasekettingreactie (PCR) en gesequenced. Om informatie te verkrijgen over hun "status" als gebonden of ongebonden, worden de mutatiefrequenties op elke base in een interessant RNA berekend en ingevoerd in structuurvoorspellingssoftware als beperkingen⁸. Op basis van nearest neighbor-regels⁹ en minimale vrije-energieberekeningen¹⁰ genereert deze software structuurmodellen die het beste passen bij de verkregen experimentele gegevens^11,12.

DMS-MaPseq maakt gebruik van DMS, dat de N1-stikstof in adenosines en N3-stikstof in cytosines op hun Watson-Crick-gezicht op een zeer specifieke manier methyleert¹³. Het gebruik van thermostabiele groep II intron reverse transcriptase (TGIRT-III) in reverse transcriptie creëert mutatieprofielen met ongekende signaal-ruisverhoudingen, waardoor zelfs de deconvolutie van overlappende profielen gegenereerd door twee of meer alternatieve conformaties^14,15 mogelijk is. Bovendien kan DMS celmembranen en hele weefsels binnendringen, waardoor tasten binnen fysiologische contexten mogelijk wordt. Het genereren van gegevens van goede kwaliteit is echter een uitdaging, omdat variaties in de verwerkingsprocedure van invloed kunnen zijn op de resultaten. Daarom bieden we een gedetailleerd protocol voor zowel in vitro als in-cell DMS-MaPseq om bias te verminderen en nieuwkomers naar de methode te begeleiden bij de moeilijkheden die ze kunnen tegenkomen. Vooral in het licht van de recente SARS-CoV2-pandemie zijn hoogwaardige gegevens over RNA-virussen een belangrijk hulpmiddel voor het bestuderen van genexpressie en het vinden van mogelijke therapieën.

Protocol

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor meer informatie over alle materialen, software, reagentia, instrumenten en cellen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Genspecifieke in vitro DMS-MaP

1. RNA in vitro transcriptie
   1. Verkrijg de sequentie van het RNA van belang als dubbelstrengs (ds)DNA (bijvoorbeeld als DNA-fragmenten, plasmiden of PCR van reeds bestaand/genomisch DNA). Als de DNA-sequentie een polymerasepromotor bevat, gaat u naar stap 3.
   2. Voer overlappende PCR uit om een RNA-polymerasepromotor stroomopwaarts van het gewenste DNA-fragment te bevestigen (voorwaartse primer voor T7-polymerase: 5' TAATACGACTCACTATAGG + eerste basen van doelsequentie 3').
   3. In vitro transcribeer het DNA-fragment in RNA. Houd het RNA altijd op ijs.
   4. Verwerk het DNA met behulp van een DNase.
   5. Isoleer het RNA met behulp van een kolomgebaseerde benadering (stap 2.4) of door ethanolprecipitatie (stap 2.5). Elute in een geschikt volume, met een opbrengst van ~50 μg.
   6. Zorg voor de RNA-integriteit door het op een agarose-gel uit te voeren; denatureer het RNA gedurende 2-3 minuten bij 70 °C voordat het wordt uitgevoerd.
      OPMERKING: De buffer en agarose kunnen RNases bevatten die RNA afbreken en het RNA-monster kunnen besmetten. Prefab agarose gels zijn eerder gebruikt in dit lab; de resultaten (vooral met RNA) zijn soms dubbelzinnig. De beste resultaten werden verkregen met agarose of PAGE gels.
   7. Direct gebruik van bewaar het RNA bij −80 °C gedurende enkele maanden, tenzij afbraak zichtbaar is na het ontdooien.
2. In vitro DMS modificatie (bij 105 mM DMS)
   1. Bereid een voldoende hoeveelheid omvouwbuffer voor (0,4 M natriumcacodilaat, pH 7,2, met 6 mM MgCl₂).
      OPMERKING: Voeg voor elke reactie (eindvolume van 100 μL) 89 μL hervouwbuffer toe.
   2. Breng voor elke reactie 89 μL omvouwbuffer over naar een aangewezen buis van 1,5 ml en prewarm bij 37 °C in een thermoshaker die onder een chemische kap wordt geplaatst.
      OPMERKING: DMS is zeer giftig en moet altijd onder een chemische kap worden bewaard totdat het wordt geblust door een reductiemiddel.
   3. Elute 1-10 pmol RNA in 10 μL nucleasevrij water (NF H₂O); overbrengen naar een PCR-buis.
   4. Incubeer in een thermocycler bij 95 °C gedurende 1min om het RNA te denatureren.
   5. Plaats onmiddellijk op een ijsblok om verkeerd vouwen te voorkomen.
   6. Voeg het RNA-monster toe aan de aangewezen buis met hervouwbuffer bij 37 °C, meng goed en incubeer gedurende 10-20 minuten om het RNA opnieuw te vouwen.
      OPMERKING: De meeste RNA's worden gevouwen in de volgorde van milliseconden tot seconden, hoewel er uitzonderingen bestaan¹⁶.
   7. Voeg 1 μL 100% (10,5 M) DMS toe aan het RNA-monster en incubeer gedurende 5 minuten tijdens het schudden met 800-1.400 rotaties per minuut (rpm).
      OPMERKING: Schudden (of andere manieren van mengen) bij deze stap is cruciaal omdat DMS hydrofoob is en mogelijk niet volledig oplost in de hervouwbuffer. Afwijkingen in reactietijden kunnen de reproduceerbaarheid van de DMS-reactiviteit beïnvloeden. Om pipetteerfouten te minimaliseren, kan DMS worden opgelost in 100% ethanol voordat het aan het monster wordt toegevoegd als een eindconcentratie van 1% (105 mM) DMS wordt gehandhaafd. Voor een onbehandelde bestrijding kan DMS worden vervangen door dimethylsulfoxide (DMSO) of water.
   8. Blus na 5 minuten reactietijd met 60 μL 100% β-mercaptoethanol (BME), meng goed en plaats het RNA onmiddellijk op ijs.
      OPMERKING: Het RNA kan veilig uit de kap worden verwijderd na het blussen van de reactie met BME om het op te ruimen. Directe blootstelling van BME aan de omgeving moet echter nog steeds worden vermeden vanwege de sterke geur en irriterende eigenschappen.
   9. Reinig het RNA door natriumacetaat-ethanolprecipitatie (zie stap 2.5) of een kolomgebaseerde benadering (zie stap 2.6) en eluute in 10 μL water.
   10. Kwantificeer het RNA met behulp van een spectrofotometer.
   11. Direct gebruik van bewaar het gemodificeerde RNA bij −80 °C.
       OPMERKING: Langdurige opslag moet worden vermeden, omdat RNA minder stabiel is na dms-behandeling.
3. Genspecifieke RT-PCR van gemodificeerd RNA
   OPMERKING: Zie figuur 1 voor de RT-PCR-opstelling van de met DMS behandelde fragmenten.
   1. Eluteer 100 ng gemodificeerd RNA in 10 μL nucleasevrij (NF) H₂O. Transfer naar een PCR-buis.
   2. Voeg aan de buis 4 μL 5x eerste strengbuffer (FSB), 1 μL dNTP-mengsel (elk 10 mM), 1 μL 0,1 M dithiothreitol (DTT) (vermijd vries-dooicycli), 1 μL RNase-remmer, 1 μL omgekeerde primer (enkele primer of een pool van primers) en 1 μL TGIRT III toe.
      OPMERKING: Voeg voor een pool van primers niet 1 μL van 10 μM van elke primer rechtstreeks toe aan de RT; meng in plaats daarvan eerst de primers en voeg 1 μL toe aan de mix (bij een totale primerconcentratie van 10 μM).
   3. Incubeer bij 57 °C gedurende 30 minuten tot 1,5 uur (doorgaans is 30 minuten voldoende om een product van 500 nt te maken) in een thermocycler.
   4. Voeg 1 μL 4 M NaOH toe, meng door te pipetteren en incubeer bij 95 °C gedurende 3 minuten om het RNA af te breken.
      OPMERKING: Deze stap is cruciaal omdat het TGIRT vrijmaakt van het cDNA door het RNA te degraderen. Als u wordt overgeslagen, kan de downstream PCR worden beïnvloed.
   5. Ruim op met behulp van een kolomgebaseerde aanpak (zie stap 2.6) die de primers voldoende verwijdert en eluuteert in 10 μL NF H₂O.
   6. PCR-amplify het cDNA door 1 μL van het reverse transcriptieproduct per 25 μL van de reactie te gebruiken met een PCR-kit die is ontworpen om opbrengst en betrouwbaarheid in evenwicht te brengen.
      OPMERKING: De primers moeten een smelttemperatuur van ~60 °C hebben.
   7. Voer 2 μL van het PCR-product uit op een agarose-gel of een prefab agarose-gel om het PCR-succes te verifiëren.
   8. Idealiter zou er na de PCR maar één band moeten verschijnen. Als dat zo is, ruimt u de reactie op met behulp van een kolomgebaseerde aanpak. Als er alternatieve banden aanwezig zijn, gebruik dan de resterende PCR-reactie om de juiste band uit de gel te verwijderen. Elute in een voldoende klein volume (bijv. 10 μL).
   9. Kwantificeer de geëxtraheerde fragmenten met behulp van een spectrofotometer.
   10. Indexeer de dsDNA-fragmenten voor sequencing met behulp van een aanpak die geschikt is voor het gewenste sequencingplatform.

Figuur 1: Experimentele opstelling voor de RT-PCR van grote met DMS behandelde fragmenten. Bij het uitvoeren van reverse transcriptie op een gemodificeerd RNA worden de wijzigingen in de sequentie waarop de primer gloeit niet geregistreerd. Dus wanneer de fragmenten langer zijn dan 400-500 bp, moeten fragmenten worden ontworpen die elkaar overlappen in de primergebieden, zoals hier wordt geïllustreerd. De lengte van de fragmenten is afhankelijk van de volgorde. Bij gebruik van paired-end 150-cyclus sequencing mogen de fragmenten niet hoger zijn dan 300 bp. Afkortingen: RT-PCR = reverse transcription polymerase chain reaction; DMS = dimethylsulfaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Dms-MaP met het hele genoom met behulp van met virus geïnfecteerde cellen

OPMERKING: In cellen kan dms-behandeling ook worden gecombineerd met de genspecifieke amplificatiebenadering die hierboven is beschreven. De hele genoombibliotheek vereist een enorme sequencingdiepte om volledige dekking op een enkel gen te bereiken. Als virale RNA's echter na extractie een aanzienlijk deel van het ribodepleted RNA uitmaken, zou sequencing van het hele genoom geschikt zijn. Bovendien kunnen andere verrijkingsmethoden worden gecombineerd met de methode voor het genereren van bibliotheken met het hele genoom.

1. DMS behandeling
   1. Kweek cellen die besmet zijn met het virus tot het gewenste stadium van infectie.
   2. Breng de celcontainer over in een speciale zuurkast die geschikt is voor het hanteren van zowel virussen op het vereiste bioveiligheidsniveau als de chemische dampen die worden gegenereerd door middelen zoals DMS.
   3. Voeg een volume DMS van 2,5% toe aan het kweekmedium en sluit de container (meestal een plaat van 10 cm) af met parafilm.
      OPMERKING: Het is gemakkelijk om te weinig en te veel te wijzigen met DMS. Bij het rechtstreeks toevoegen van DMS aan cellen is het erg belangrijk om goed te mengen. U kunt het nieuwe medium ook voorwarmen in een conische buis van 50 ml bij 37 °C en het DMS direct krachtig schuddend toevoegen. Decanteer het gebruikte medium op de cellen en pipetteer langzaam in het DMS-bevattende medium.
   4. Breng gedurende 5 minuten over naar een incubator van 37 °C.
      OPMERKING: Afhankelijk van de hoeveelheid tijd die nodig is om het DMS buiten de incubator te verwerken, is het mogelijk dat 5 minuten tot overmodificatie leiden. Voorkom de tijd van het toevoegen van het DMS aan het incuberen tot ≤1 min. Als u het experiment voor de eerste keer uitvoert, wordt aanbevolen om een DMS-titratie uit te voeren en de incubatietijd (tussen 3 minuten en 10 minuten) te variëren om de optimale wijzigingssnelheid te vinden en ervoor te zorgen dat de resultaten robuust zijn over een venster van concentraties.
   5. Pipetteer voorzichtig het DMS-bevattende medium (in geschikt chemisch afval) en voeg voorzichtig 10 ml stopbuffer toe (PBS met 30% BME [bijv. 3 ml BME en 7 ml PBS]).
      OPMERKING: De toevoeging van DMS en BME kan de cellen van de plaat tillen als de cellen niet sterk hechten. Als de cellen worden opgetild, kunnen ze worden behandeld als suspensiecellen - in plaats van het DMS-bevattende medium te verwijderen, de stopbuffer direct toe te voegen en de cellen met DMS en BME uit te schrapen in een conische buis van 50 ml. Pelleteer de cellen door gedurende 3 minuten te centrifugeren bij 3.000 × g; zorg ervoor dat u zich ontdoet van eventuele resterende DMS, die onder de cellen in grote druppels kan pelleteren. Een extra wasstap in 30% BME wordt aanbevolen als het DMS-medium in eerste instantie niet kan worden verwijderd.
   6. Schraap de cellen en breng ze over in een conische buis van 15 ml.
   7. Pellet door centrifugeren bij 3.000 × g gedurende 3 min.
   8. Verwijder het supernatant en was 2x met 10 ml PBS.
   9. Verwijder voorzichtig zoveel mogelijk resterende PBS.
   10. Los de pellet op in een geschikte hoeveelheid van het RNA-isolatiereagens (bijv. 3 ml voor een T75-kweekkolf, 1 ml voor een plaat van 10 cm).
       OPMERKING: Onvoldoende hoeveelheden van het reagens kunnen de RNA-opbrengst beïnvloeden.
2. RNA-extractie en ribosomale RNA (rRNA) depletie
   1. Voeg aan 1 ml gehomogeniseerde cellen in het RNA-isolatiereagens 200 μL chloroform toe, vortex gedurende 15-20 s tot felroze en incubeer vervolgens gedurende maximaal 3 minuten totdat fasescheiding zichtbaar is.
      OPMERKING: De roze lipidefase moet zich onderaan vestigen. Als dit niet het geval is, was de vortexingtijd waarschijnlijk onvoldoende.
   2. Draai op maximale snelheid (~ 20.000 × g) gedurende 15 minuten bij 4 °C.
   3. Breng de bovenste waterige fase over in een nieuwe buis.
   4. Reinig het RNA door natriumacetaat-ethanolprecipitatie (zie stap 2.5) of een kolomgebaseerde benadering (zie stap 2.6) en eluute in een voldoende volume NF H₂O.
   5. Controleer de RNA-integriteit op een agarose-gel. Zoek naar twee banden die overeenkomen met de twee ribosomale subeenheden.
   6. Put de rRNA's uit met behulp van de voorkeursbenadering en eluuteer in een adequaat volume (meestal 20-50 μL) NF H₂O.
      OPMERKING: Voor downstream-toepassingen wordt ~ 500 ng totaal RNA voorgesteld in een volume van 8 μL. Niet-ribosomale RNA's vormen meestal slechts 5% -10% van het totale RNA.
   7. Kwantificeren met behulp van een spectrofotometer.
3. Bibliotheek generatie
   1. Gebruik genspecifieke RT-PCR of andere benaderingen om bibliotheken te genereren¹⁵. Als u willekeurige hexameren gebruikt voor priming, voeg dan een incubatiestap toe bij een lage T_m (37-42 °C) om hexameergloeiing mogelijk te maken.
      OPMERKING: Standaard bibliotheekgeneratiekits kunnen ook worden gebruikt door het RT-enzym te vervangen door TGIRT en de RT-temperatuur te wijzigen in 57 °C.
4. Kolomgebaseerde RNA-opschoning met behulp van de RNA Clean &Concentrator-kolommen
   OPMERKING: Alle stappen moeten bij kamertemperatuur worden uitgevoerd.
   1. Voeg NF H₂O toe aan de monsterbuis om deze op een volume van 50 μL te brengen.
   2. Voeg 100 μL bindingsbuffer en 150 μL 100% ethanol toe aan het monster.
   3. Mix en breng over naar een spinkolom.
   4. Draai bij 10.000-16.000 × g gedurende 30 s; gooi de flowthrough weg.
   5. Voeg 400 μL RNA-voorbereidingsbuffer toe.
   6. Draai bij 10.000-16.000 × g gedurende 30 s; gooi de flowthrough weg.
   7. Voeg 700 μL RNA-wasbuffer toe.
   8. Draai bij 10.000-16.000 × g gedurende 30 s; gooi de flowthrough weg.
   9. Voeg 400 μL RNA-wasbuffer toe.
   10. Draai bij 10.000-16.000 × g gedurende 30 s; gooi de flowthrough weg.
   11. (Optioneel) Breng de kolom over naar een nieuwe verzamelbuis en draai gedurende 2 minuten op 10.000-16.000 × g .
   12. Breng de kolom over in een schone RNAse-vrije buis en voeg een geschikte hoeveelheid NF H₂O toe.
   13. Draai op 10.000-16.000 × g gedurende 1 minuut.
5. Zuur fenol-chloroform RNA extractie.
   1. Voeg een gelijk volume zuurfenol:chloroform:isoamylalcohol toe.
   2. Vortex grondig, en centrifugeer op 14.000 × g gedurende 5 minuten.
   3. Als er geen fasescheiding is, voeg dan 20 μL van 2 M NaCl toe en herhaal de centrifugatie.
   4. Breng de waterige fase over in een nieuwe buis.
   5. Voeg 500 μL isopropanol en 2 μL co-precipitant toe.
   6. Meng en incubeer bij RT gedurende 3 minuten; incubeer vervolgens bij -80 °C 's nachts.
   7. Pelleteer het RNA door centrifugeren met maximale snelheid (~ 20.000 × g) gedurende 30 minuten bij 4 °C.
   8. Was de pellet met 200 μL ijskoude 70% ethanol.
   9. Draai op maximale snelheid (~ 20.000 × g) gedurende 5 minuten; gooi de flowthrough weg.
   10. Resuspendeer de pellet in de juiste hoeveelheid NF H₂O.
6. Op kolommen gebaseerde cDNA-opschoning met behulp van de kolommen Oligo Clean en Concentrator
   OPMERKING: Alle stappen moeten bij kamertemperatuur worden uitgevoerd.
   1. Voeg NF H₂O toe aan de monsterbuis om deze op een volume van 50 μL te brengen.
   2. Voeg 100 μL bindingsbuffer en 400 μL 100% ethanol toe.
   3. Mix en breng over naar een spinkolom.
   4. Draai bij 10.000-16.000 × g gedurende 30 s; gooi de flowthrough weg.
   5. Voeg 750 μL DNA-wasbuffer toe.
   6. Draai bij 10.000-16.000 × g gedurende 30 s; gooi de flowthrough weg.
   7. (Optioneel) Breng de kolom over naar een nieuwe verzamelbuis en draai op 10.000-16.000 × g gedurende 2 min.
   8. Breng de kolom over in een schone RNAse-vrije buis en voeg een geschikte hoeveelheid NF H₂O toe.
   9. Draai op 10.000-16.000 × g gedurende 1 minuut.

3. Analyse van de sequencinggegevens

OPMERKING: Om secundaire RNA-structuurmodellen te maken van de DMS-MaP-sequencinggegevens, moeten de resulterende .fastq-bestanden in verschillende stappen worden verwerkt. Deze stappen kunnen automatisch worden uitgevoerd met behulp van de

1. Trim de adapters met TrimGalore of Cutadapt.
2. Wijs de reads toe aan de referentiesequenties (.fasta-indeling) met Bowtie2.
3. Tel de reads met gespecialiseerde RNA-structuursoftware (bijv. DREEM¹⁴, RNA-Framework¹⁷ of iets dergelijks) en maak reactiviteitsprofielen.
4. (Optioneel) Cluster de reads om alternatieve RNA-conformaties te vinden met DREEM¹⁴, DRACO¹⁷, DANCE-MaP¹⁸ of iets dergelijks.
5. Voorspel de minimale vrije energiestructuur op basis van de reactiviteitsprofielen met behulp van RNAStructure¹², ViennaRNA of iets dergelijks.
6. Visualiseer de RNA^11-structuur met behulp van VARNA (https://varna.lri.fr/) of iets dergelijks.
   OPMERKING: Voor de praktische bruikbaarheid bevatten software zoals DREEM (www.rnadreem.org) en RNA-Framework¹⁹ stap 1-5 enorm in hun pijplijnen, wat het analyseproces stroomlijnt. Elke structuurvoorspelling moet echter met zorg worden behandeld (bijvoorbeeld door de overeenkomst van de structuur met de gegevens te verifiëren²⁰.

Resultaten

Genspecifieke in vitro DMS-MaP
Om de 5'UTR van SARS2 te bestuderen, werden de eerste 300 bp van het virus besteld als een gBlock-sequentie, naast drie primers. Die omvatten twee primers om het fragment ("FW" &"RV") via PCR te verspreiden, evenals een om de T7-promotor ("FW-T7") te bevestigen. Deze sequenties zijn te zien in tabel 1.

Naam	Volgorde (5'->3')
FW	ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC
RV	GCAAACTGAGTTGGACGTGT
FW-T7	TAATACGACTCACTATAGG ATTAAAGGTTTATACCTTCCCAGGTAAC

Tabel 1: Primersequentie voor DMS-MaP RT-PCR van SARS-CoV2 5'UTR. Hier zijn FW-T7 en RV nodig om een DNA-sjabloon voor in vitro transcriptie te genereren, de RV wordt gebruikt in de reverse transcriptie en het FW-RV primer-paar wordt gebruikt in de daaropvolgende PCR-amplificatie van het cDNA. De primers gloeien naar het allereerste begin van het SARS-CoV2-genoom (FW) en de sequentie direct stroomafwaarts van het interessegebied. Afkortingen: DMS-MaP = Mutatieprofilering met sequencing met behulp van dimethylsulfaat; RT-PCR = reverse transcriptie polymerase kettingreactie; SARS-CoV2 = ernstig acuut respiratoir syndroom-coronavirus 2; UTR = onvertaald gebied; RV = omgekeerde primer; FW = voorwaartse primer.

Om RNA uit het gBlock-fragment te genereren, werd de sequentie van de T7-polymerasepromotor bevestigd met behulp van overlap-PCR met behulp van de PCR-premix volgens het schema in figuur 2A. Uit het langwerpige fragment werd RNA gegenereerd met behulp van de T7 Transcription Kit. Het DNA-sjabloon werd vervolgens verteerd met behulp van de DNase- en RNA-isolatie met behulp van RNA Clean &Concentrator-kolommen.

Kwaliteitscontrole van de in vitro transcriptie werd gedaan door het RNA-product op een 1% agarose-gel naast een ssRNA-ladder te laten lopen. Omdat er slechts één band zichtbaar was, werden in vitro DMS-sonde en RT-PCR uitgevoerd (zie figuur 2B).

Om het succes van de PCR-reactie te verifiëren, werd het monster uitgevoerd op een 2% agarose-gel met behulp van een dsDNA-ladder. Na indexering moet de band ~ 150 bp hoger lopen op dezelfde gel, rekening houdend met de grootte van de indexerende primers.

Figuur 2: In vitro transcriptie van het DNA-sjabloon. A) Om in vitro een DNA-sjabloon te transcriberen dat nog geen intrinsieke RNA-polymerasepromotor heeft, moet het sjabloon eerst door overlappende PCR worden bijgevoegd. Dit wordt gedaan door gebruik te maken van een voorwaartse primer, die de sequentie TAATACGACTCACTATAGG (in het geval van het T7 RNA-polymerase) bevat, stroomopwaarts van de eerste basen die overlappen met het gewenste fragment. De onderstreepte basis symboliseert hier de transcriptiestartplaats van het polymerase. Zodra de promotor zich aan het dsDNA-fragment heeft gehecht, kan het worden getranscribeerd door het T7-polymerase. Belangrijk is dat het polymerase de streng tegenover de genoemde promotorsequentie gebruikt als de sjabloon (blauw), waardoor effectief RNA ontstaat dat identiek is aan de sequentie direct na de aangegeven promotorsequentie (rood). (B) Een 1% agarose gel met een ssRNA Ladder (baan 1) en het in vitro getranscribeerde RNA product op 300 nt (baan 2). (C) Een 2% agarose gel met GeneRuler 1 kb plus Ladder (baan 1), het PCR-product na RT-PCR op 300 bp (baan 2), en het geïndexeerde fragment na bibliotheekvoorbereiding op 470 bp (baan 3). Afkortingen: RT-PCR = reverse transcription polymerase chain reaction; DMS = dimethylsulfaat; nt = nucleotiden; dsDNA = dubbelstrengs DNA; ssRNA = enkelstrengs RNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In vivo DMS-MaP met het hele genoom met behulp van met virus geïnfecteerde cellen
Voorafgaand aan de DMS-behandeling waren de HCT-8-cellen geïnfecteerd met OC43. Wanneer een cytopathisch effect (CPE) werd waargenomen 4 dagen na infectie (dpi) (zoals te zien in figuur 3A), werden deze cellen behandeld en werd het RNA geëxtraheerd en ribodepleted. Bij het uitvoeren van het totale RNA op een agarose-gel waren twee heldere banden zichtbaar, goed voor de 40S- en 60S-subeenheden van het ribosoom, die ongeveer 95% van de totale RNA-massa uitmaken (zie figuur 3B). Wanneer RNA-extractie niet succesvol was of werd afgebroken (bijvoorbeeld door meerdere vries-dooicycli), waren de RNA-afbraakproducten zichtbaar op de bodem van de gel (zie figuur 3C, tweede rijstrook). Bovendien verdwenen na uitputting van het rRNA de twee heldere banden, waardoor er een uitstrijkje in de baan achterbleef (zie figuur 3C, derde rijstrook). Ten slotte, na voorbereiding van de bibliotheek, hadden de monsters verschillende grootteverdelingen en werden ze weergegeven als een uitstrijkje op de uiteindelijke PAGE-gel. De band werd weggesneden tussen 200 nucleotiden (nt) en 500 nt, in overeenstemming met de 150 x 150 paired-end sequencing run gepland om deze bibliotheken te analyseren. Het belangrijkste is dat de adapterdimmers met ~150 nt werden gescheiden (zie figuur 3D).

Figuur 3: Controlepunten van in vivo DMS-MaP met virus-geïnfecteerde cellen. (A) Lichtmicroscopiebeeld van virus-geïnfecteerde HCT-8-cellen, 4 dagen dpi. Om de hoogst mogelijke opbrengst van viraal RNA uit het totale RNA te verkrijgen en tegelijkertijd de nadelige effecten als gevolg van celdood te minimaliseren, moet DMS worden toegevoegd wanneer CPE begint of zelfs daarvoor, zoals te zien is in de afbeelding. (B) Een 1% agarose gel met zes monsters van 1 μg totaal RNA. In elke baan zijn twee heldere banden zichtbaar, goed voor de subeenheden van de 40S en 60S, omdat ribosomaal RNA ~ 95% van het totale RNA uitmaakt. Opmerking: In-cell DMS-behandeling veroorzaakt enige RNA-fragmentatie en uitstrijkjes, maar de twee rRNA-banden moeten nog steeds zichtbaar zijn. Milde fragmentatie na modificatie wordt getolereerd omdat de informatie die het methylatiemerk bevat wordt gegenereerd en rapporteert over de RNA-structuur tijdens de DMS-incubatie terwijl de cellen nog in leven zijn. (C) Een 1% Agarose gel van GeneRuler 1 kb plus ladder DNA marker (lane 1) totaal RNA dat eerder gedurende 6 maanden bij −80 °C was opgeslagen (lane 2) en ribodepleted RNA (lane 3). Bij lange tijd opslaan van RNA met verschillende vries-dooicycli, begint het RNA af te breken en mag het mogelijk niet worden gebruikt voor indringende experimenten. Bovendien, na ribodepleting van het totale RNA, vervagen de twee heldere banden, goed voor de 40S- en 60S-subeenheden van het ribosoom, en begint een uitstrijkje van de resterende RNA's te vertonen. (D) Een PAGE-gel van GeneRuler 1 kb plus ladder DNA-marker (baan 1) en een bibliotheekmonster van geprepareerd RNA met het hele genoom. De gel moet worden weggesneden op basis van de sequencingbehoeften. Voor een paired-end sequencing run van 150 cycli van beide zijden, moet de gel worden weggesneden tussen 300 bp en 500 bp. Adapterdippen (met 170 bp) moeten worden gescheiden. Afkortingen: DMS-MaP = Mutatieprofilering met sequencing met behulp van dimethylsulfaat; dpi = dagen na infectie; CPE = cytopathisch effect. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na sequencing werden de .fastq-bestanden geanalyseerd door een taak in te dienen bij de DREEM-webserver (http://rnadreem.org/), samen met een .fasta-referentiebestand. De uitvoer die door de server wordt gegenereerd, omvat kwaliteitscontrolebestanden die zijn gegenereerd door fastqc (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/) en TrimGalore (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/), evenals andere uitvoerbestanden die de gemiddelde mutatiefrequenties van de populatie bevatten. Afgezien van het diagram met de mutatiefrequenties met een interactief .html (zie figuur 4A) formaat en een .csv bestand met de ruwe reactiviten per base en een struct_constraint.txt bestand, leesbaar door verschillende RNA-structuurvoorspellingssoftware, omvat dit ook een bitvector.txt bestand rapportage over de by-read mutaties. Hieruit werden de populatiegemiddelde structuren berekend door de .fasta- en struct_constraint.txt-bestanden in te dienen bij de RNAfold-webserver (http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi). Dit maakt gebruik van de ViennaRNA-software om structuurvoorspellingen te genereren op basis van de minimale vrije energie, die online kan worden bekeken of gedownload in ct- of Vienna-formaat. Om RNA-structuurmodellen te genereren, werden deze downloadbare bestanden ingediend bij VARNA (https://varna.lri.fr/, zie figuur 4B). Ten slotte kunnen bitvector.txt bestanden worden gebruikt door de stabiele versie van DREEM (https://codeocean.com/capsule/6175523/tree/v1) om te zoeken naar alternatieve RNA-conformaties. Om goede structuurmodellen te verkrijgen met DREEM, moet een dekking van 10.000 reads per basis worden bereikt; voor clustering kunnen maximaal 100.000 leesbewerkingen per basis vereist zijn. Een overzicht van de gehele workflow is te vinden in Figuur 4C.

Figuur 4: Voorbeeldgegevens verkregen uit chemische sonde-experimenten van de SARS-CoV2 5'UTR. (A) Reactiviteitsprofiel van de eerste 300 basen van het SARS-CoV2-genoom gekleurd per base (A: rood, C: blauw, U: groen, G: geel). De ruwe reactiviteit wordt berekend als de absolute mutatiefrequentie gedeeld door de dekking. Basen met open conformatie hebben hoge reactiviteitswaarden; bases die zich bezighouden met base-pairing hebben lage reactiviteitswaarden. u en G zijn niet gewijzigd door DMS en hebben lage reactiviteitswaarden, afkomstig van polymerase-ontrouw. De voorspellingen zijn gedaan met de DREEM webserver. (B) Structuurmodel van de SARS-CoV2 5'UTR voorspeld op basis van reactiviteitswaarden gemaakt met VARNA. Bases met hoge reactiviteitswaarden zijn rood gekleurd; basen met lage reactiviteitswaarden zijn wit gekleurd. (C) Workflow van de DMS-MaP-analyse die begint met de .fastq-bestanden die zijn verkregen uit sequencing. Deze kunnen worden gecontroleerd met behulp van fastqc; de adaptersreeksen worden bijgesneden met TrimGalore en vervolgens met Bowtie2 weer toegewezen aan een referentiesequentie. Van de verkregen .bam-bestanden telt DREEM de mutaties in elke read, waardoor een mutatiekaart of .bitvector.txt bestand ontstaat. Deze rapporteren de mutaties van elke read op een positieafhankelijke manier, op basis waarvan de populatiegemiddelde reactiviteitsprofielen kunnen worden gemaakt. Als alternatief kunnen bitvectoren worden geclusterd met behulp van DREEM om te zoeken naar alternatieve RNA-conformaties. Ten slotte worden de verkregen structuurmodellen gevisualiseerd met behulp van software (bijv. VARNA). Afkortingen: DMS-MaP = Mutatieprofilering met sequencing met behulp van dimethylsulfaat; SARS-CoV2 = ernstig acuut respiratoir syndroom-coronavirus 2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Het protocol beschrijft hier hoe RNA in vitro en in cellen kan worden onderzocht met behulp van DMS-mutatieprofileringsexperimenten. Bovendien geeft het instructies over het voorbereiden van bibliotheken voor Illumina-sequencing om genspecifieke gegevens te genereren en de verkregen .fastq-bestanden te analyseren. Daarnaast kunnen genoombrede bibliotheekbenaderingen worden gebruikt. Genspecifieke RT-PCR produceert echter de hoogste kwaliteit en meest robuuste gegevens. Daarom is het belangrijk om bij het vergelijken tussen monsters ervoor te zorgen dat ze worden voorbereid met identieke sequencingstrategieën, omdat het genereren van bibliotheken enige vertekening veroorzaakt. De reproduceerbaarheid moet altijd worden gemeten met behulp van replica's.

Verschillende voorzorgsmaatregelen
RNA is een onstabiel molecuul dat gevoelig is voor afbraak, zowel door verhoogde temperaturen als door RNases. Daarom worden speciale maatregelen — het gebruik van persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), RNAse-vrij materiaal en RNAse-remmers — aanbevolen. Het belangrijkste is dat RNA waar mogelijk op ijs moet worden gehouden. Dit geldt vooral voor gemethyleerd RNA, dat nog gevoeliger is voor hoge temperaturen.

Het is belangrijk om te bevestigen dat de RNA-structuur van belang niet gevoelig is voor de DMS-concentratie en buffercondities. Buffers zoals 100 mM Tris, 100 mM MOPS en 100 mM HEPES bij pH 7-7,5 geven een hoog signaal, maar zijn mogelijk niet voldoende om de pH tijdens de reactie²¹ te handhaven. Aangezien DMS hydrolyseert in water, waardoor de pH daalt, is een sterke buffer van cruciaal belang om een neutrale pH te behouden tijdens de modificatiereactie. Van de toevoeging van bicine is aangetoond dat het helpt om de pH als iets basaal²¹ te handhaven, maar resulteert in een lage DMS-modificatie op Gs en Us, wat informatief kan zijn, maar afzonderlijk moet worden geanalyseerd vanwege de productie van een veel lager signaal dan As en Cs en wordt niet verder besproken in dit protocol.

In genspecifieke RT-PCR wordt het gemodificeerde RNA omgekeerd getranscribeerd in het DNA en in fragmenten versterkt door PCR. Hoewel de grootte van het RNA theoretisch onbeperkt kan zijn, mogen deze PCR-fragmenten niet groter zijn dan een lengte van 400-500 basenparen (bp) om vertekening tijdens de reverse transcriptiereactie te voorkomen. Idealiter zouden de fragmenten binnen het bereik van de sequencingrun moeten vallen (d.w.z. als sequencing wordt uitgevoerd met behulp van een 150 x 150 cyclus gepaard-end sequencingprogramma, mag een enkel fragment niet hoger zijn dan 300 bp). Bij gebruik van sequencingprogramma's met minder cycli kunnen de PCR-producten worden gefragmenteerd met behulp van een dsDNase. Bovendien, omdat sequenties binnen de primersequenties geen structurele informatie bevatten, moeten de fragmenten elkaar overlappen wanneer het onderzochte RNA >1 fragment omvat. RT-reacties kunnen meerdere RT-primers bevatten voor verschillende fragmenten (tot 10 verschillende RT-primers). Afhankelijk van de sequenties kan het poolen van de RT-primers de omgekeerde transcriptie minder efficiënt maken, maar werkt meestal goed. Elke PCR-reactie moet afzonderlijk worden uitgevoerd.

Bij het onderzoeken van RNA met DMS spelen de experimentele omstandigheden een extra rol, omdat veel RNA's thermodynamisch onstabiel zijn en hun conformatie veranderen op basis van omgevingsfactoren zoals temperatuur. Om onregelmatigheden te voorkomen, moeten de experimentele omstandigheden zo constant mogelijk worden gehouden, ook met betrekking tot de reactietijden. De buffercondities lijken tot op zekere hoogte uitwisselbaar te zijn 17,20,22,23 wanneer de basisvoorwaarden worden gehandhaafd - de buffercapaciteit en aanwezigheid van monovalente (Na) en tweewaardige ionen (Mg) - om een goede vouwing van RNA²⁴ te garanderen.

Met betrekking tot de bibliotheekvoorbereiding van gewijzigde RNA's moet rekening worden gehouden met verschillende aspecten. Ten eerste zijn gemodificeerde RNA's, zoals eerder vermeld, minder stabiel dan hun ongewijzigde tegenhangers, wat betekent dat ze mogelijk de optimalisatie van de fragmentatietijden vereisen voor een optimale verdeling van de fragmentgrootte. Bovendien gebruiken bepaalde RNA-bibliotheekvoorbereidingskits, evenals vele andere RNAseq-benaderingen, willekeurige primers in de reverse transcriptiekit. Dit kan leiden tot een lagere dekking van de referentie, vooral in de 3 'van een gen, en uiteindelijk tot onvoldoende dekkingsdiepte. Als de dekking van een bepaalde regio te laag is, kan het nodig zijn om die bases uit de structuurvoorspelling te verwijderen. Naast RT-PCR en RNAseq-kits voor het hele genoom kunnen andere bibliotheekvoorbereidingsbenaderingen worden gebruikt. Protocollen die de ligatie van 3' en/of 5' adapters aan het RNA omvatten, zijn voordelig bij het gebruik van kleine fragmenten RNA of wanneer het verlies van tastende informatie in de primergebieden moet worden vermeden.

Ten slotte moet de analyse van de chemische sonde-experimenten altijd zorgvuldig worden geïnterpreteerd. Momenteel is er geen software die de RNA-structuur van een RNA alleen uit de sequentie met hoge nauwkeurigheid voorspelt. Hoewel chemische tasterbeperkingen de nauwkeurigheid aanzienlijk verbeteren, is het genereren van goede modellen voor lange RNA's (>500 nt) nog steeds een uitdaging. Deze modellen moeten verder worden getest door andere benaderingen en/of mutagenese. RNA-voorspellingssoftware optimaliseert voor het maximale aantal basenparen, waardoor open conformaties aanzienlijk worden bestraft, die mogelijk niet nauwkeurig RNA-vouw⁵ vertegenwoordigen. Het verkregen structuurmodel moet dus worden getest door de voorspellingsovereenkomst te kwantificeren met de onderliggende chemische tastergegevens (bijvoorbeeld door AUROC) en tussen replicaties (bijvoorbeeld door mFMI), zoals geïllustreerd door Lan et ^al.20.

Idealiter zouden verschillende experimenten in verschillende systemen om het verkregen structuurmodel uit te dagen, moeten worden gebruikt om iemands hypothese te versterken. Deze kunnen het gebruik van in vitro en in-cell benaderingen, compenserende mutaties en verschillende cellijnen en soorten omvatten. Bovendien zijn ruwe reactiveringen vaak net zo of zelfs informatiever dan structuurvoorspellingen, omdat ze de "grondwaarheid" -momentopname van het RNA-vouwensemble vastleggen. Als zodanig zijn ruwe reactiveringen zeer geschikt en informatief voor het vergelijken van structuurveranderingen tussen verschillende omstandigheden. Belangrijk is dat de laagste vrije energiestructuren die zijn berekend met behulp van chemische indringende beperkingen met computationele voorspelling alleen moeten worden gebruikt als een starthypothese voor een compleet structuurmodel.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 Kb Plus DNA Ladder	10787018	Thermo
2-mercaptoethanol	M6250-250ML	Sigma
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5	AM9720	Thermo
Advantage PCR	639206	Takara
CloneAmp HiFi PCR Premix	639298	Takara
DMS	D186309	Sigma
dNTPs 10 mM each	U151B	Promega
E-Gel EX Agarose Gels, 2%	G402022	Thermo	precast agarose gels
Ethanol (200 proof)	E7023-4X4L	Sigma
Falcon tubes, 15 mL, 50 mL
GlycoBlue			co-precipitant
HCT-8 cells	ATCC #CCL-244
Invitrogen MgCl2 (1 M)	AM9530G	fisherscientific
Isopropanol	278475	Sigma
Megascript T7 transcription	AM1334	Thermo
NanoDrop spectrophotometer
Novex TBE Gels, 8%, 10 well	EC6215BOX	Thermo
OC43	ATCC #VR-1558
RiboRuler Low Range RNA Ladder	SM1831	Thermo
RNAse H	M0297L	NEB
Sodium Cacodylate, 0.4 M, pH 7.2	102090-964	VWR
Sodium hydroxide solution	S8263-150ML	Sigma
SuperScript II Reverse Transcriptase for FSB and DTT	18064014	Thermo
TGIRT-III Enzyme	TGIRT50	Ingex
The Oligo Clean & Concentrator	D4060	Genesee
The RNA Clean & Concentrator kits zijn RNA opruiming kits	R1016	Genesee
TRIzol Reagents	15596018	Thermo	RNA isolatiereagens
Water, (For RNA Work) (DEPC-Behandeld, DNASE, RNASE vrij/Mol. Biol.)	BP561-1	fisherscientific
xGen Broad-range RNA Library Prep 16rxn	10009865	IDT
Zymo RNA clean and concentrator columns