Methodenartikel

Het bestuderen van eiwit-arginine-methylering: benaderingen en methoden

DOI:

10.3791/64821

⸱

20 januari 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BESPREKTE ARTIKELEN:

Hutchinson, A., Seitova, A. Productie van recombinante PRMT-eiwitten met behulp van het Baculovirus expressievectorsysteem. Journal of Visualized Experiments. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor globale en betrouwbare R-methyleringsanalyse van eiwitten. Journal of Visualized Experiments. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Het onderzoeken van het arginine-methyloom door middel van nucleaire magnetische resonantiespectroscopie. Journal of Visualized Experiments. (178), doi: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Kwantitatieve methoden om de activiteit van proteïne argininemethyltransferase 1-9 in cellen te bestuderen. Journal of Visualized Experiments. (174), doi: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. De proximity ligation assay maakt detectie, lokalisatie en kwantificering van proteïne arginine methylering in vast weefsel mogelijk. Journal of Visualized Experiments. (185), doi: 10.3791/64294 (2022).

Redactioneel

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteïn arginine methylering is een posttranslationele modificatie die betrokken is bij de regulatie van een breed spectrum van biologische processen1,2,3. De negen leden van de familie van eiwit arginine methyltransferases (PRMT's) kunnen arginine methyleren op een monomethyl- en di-methyl symmetrische of asymmetrische manier. Het begrijpen van de functionele gevolgen en het catalogiseren van de gemethyleerde substraten van PRMT's hebben de kennis van de PRMT-enzymen aanzienlijk bevorderd en hun koppeling aan ziekte vergemakkelijkt2. Bovendien heeft de ontwikkeling van krachtige en selectieve remmers chemische biologie-gebaseerde benaderingen mogelijk gemaakt om PRMT's te bestuderen en heeft de klinische ontwikkeling van de PRMT-targeting agentia versneld3. Naarmate het veld van PRMT's vordert, zullen nieuwe methoden en hun toepassingen verder de regulatie en biologie van deze enzymen verduidelijken.

In deze methodencollectie biedt een artikel over de recombinante productie van de PRMT-eiwitten een gedetailleerd verslag van een op baculovirus gebaseerd expressiesysteem4. Verschillende PRMT's kunnen worden gegenereerd met behulp van de bacteriële expressie; grotere of complexe afhankelijke PRMT's zoals PRMT7 of PRMT5 vereisen echter een expressiesysteem van insectencellen. Deze methode heeft al talloze in vitro inspanningen ten goede gekomen om de substraten van PRMT's te bepalen.

Het bestuderen van PRMT-substraten in de cellulaire omgeving vereist geavanceerde detectiebenaderingen. Twee artikelen in deze collectie presenteren verschillende methodologieën die vertrouwen op antilichaamverrijking van gemethyleerde arginines gevolgd door massaspectrometrie kwantificering of antilichaam-onafhankelijke kwantificering met behulp van nucleaire magnetische resonantie (NMR). Er zijn verschillende antilichamen ontwikkeld die verschillende methyleringstoestanden herkennen en zijn gebruikt in studies die de PRMT-substraten identificeren5. De massaspectrometriemethode maakt de kwantitatieve evaluatie van cellulair eiwit arginine methylering mogelijk door gebruik te maken van metabolische labeling, daaropvolgende geavanceerde scheidingstechnieken en antilichaamsgebaseerde verrijking6. Verschillende leden van de PRMT-familie geven de voorkeur aan methylering van argininen die zich in repetitieve RGG-motieven bevinden die in de intrinsiek ongeordende gebieden van eiwitten voorkomen7. De op NMR-spectroscopie gebaseerde methode maakt het mogelijk om de methyleringstoestand en positie van alle argininederivaten (mono en di, symmetrisch en asymmetrisch) te bepalen, waarbij ze betrouwbaar kunnen worden gekwantificeerd binnen complexe biologische monsters8.

Ten slotte, om gemethyleerde arginineresiduen in specifieke eiwitten te identificeren, bieden twee artikelen benaderingen op basis van western blotting en de proximity ligatie assay (PLA). Beide methoden maken gebruik van op antilichamen gebaseerde detectie, maar verschillen in de detectiemethode en de verstrekte informatie. De western blot-methode is kwantitatief en is waardevol gebleken bij het karakteriseren van chemische sondes9. De PLA geeft informatie over de ruimtelijke locatie van de gemethyleerde arginine omdat deze het doeleiwitantilichaam en het generieke antilichaam voor mono- of di-methyl arginine gebruikt, waardoor de noodzaak om specifieke antilichamen te genereren wordt omzeild en kan opmerkelijk worden gebruikt op vast weefsel10.

Samen zullen deze diverse methodologieën robuuste ontdekking van gemethyleerde argininen in verschillende celsystemen en ziektetoestanden mogelijk maken en de fundamentele kennis van de biologische functie van de PRMT-enzymen verder bevorderen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.B.L. wordt ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC). Het Structural Genomics Consortium is een geregistreerde liefdadigheidsinstelling (nr: 1097737) die fondsen ontvangt van Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech, Genome Canada via Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN-subsidie 875510], Janssen, Merck KGaA (ook bekend als EMD in Canada en de VS), Pfizer en Takeda.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

Gerelateerde artikelen