$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Met zijn opmerkelijke winsten in gevoeligheid, snelheid en veelzijdigheid, voorziet moderne massaspectrometrie (MS) onderzoekers met grotere mogelijkheden voor proteoomkarakterisering. Met verbeterde technologieën eisen onderzoekers een hoger niveau van strengheid in hun resultaten. Daarom zijn innovatieve monstervoorbereidingsstrategieën, ontworpen om complexe proteomische mengsels te isoleren, scheiden en verwerken voorafgaand aan MS, van gelijk belang voor het proteomics-workflow. De chemische diversiteit van proteomische systemen sluit een ‘one-size-fits-all’ aanpak voor monstervoorbereiding uit. Echter, zoals te zien is in deze verzameling methoden, zijn er meerdere protocollen beschikbaar om de kwaliteit en betrouwbaarheid van MS-gegevens te maximaliseren. Deze verzameling beoogt onderzoekers te voorzien van gemakkelijk te implementeren hulpmiddelen en trucs die zijn ontworpen om het verwachte resultaat van proteomische en metabolische workflows te verbeteren.
Capillaire HPLC- en UPLC-kolommen zijn bijna ubiek voor uitgebreide proteomics-workflows. Terwijl zelfgevulde capillaire kolommen een goedkope alternatief zijn voor commerciële kolommen, kunnen degenen die hebben geprobeerd hun eigen kolommen te vullen, bekend zijn met inconsistente vulsnelheden en variabele kolomkwaliteit. Kovalchuk en collega's aan de Russische Academie van Wetenschappen demonstreren hun FlashPack-aanpak om de efficiënte en consistente vulling van de UPLC-capillare kolommen te garanderen1. Een combinatie van precies gecontroleerde variabelen vermindert de vorming van een koepel aan de capillaire ingang en maakt snelle kolomvullen mogelijk met behulp van een lagedruk vulbom.
Immunopeptidomics is een opkomende subdiscipline van proteomics, met klinische implicaties in oncologie en immuuntherapieën. Betrouwbare MS-analyse vereist isolatie van MHC klasse I/II, of humane leukocyt antigeen (HLA) peptide liganden. Om de reproduceerbaarheid van dit isolatieprotocol te verbeteren, demonstreren Sirois en collega's aan de Universiteit van Montreal een kleinschalig parel-gebaseerd affiniteitscapturatie-workflow, samen met verwachte MS-resultaten van het herstelde immunopeptidoom2.
Om de strengheid van de proteomics-gegevens verder te verbeteren en de verwerking van grote aantallen monsters op hoog niveau te vergemakkelijken, wenden onderzoekers zich steeds meer tot robotische platforms om de monsterstapverwerkingsstappen te automatiseren. Er is een goedkope robotische platform beschikbaar, hoewel dit vereist dat de gebruiker de gewenste manipulatiestappen programmeert, wat een belemmering kan zijn voor het gebruik van dit apparaat. Han et al. aan de University of Colorado Anschutz Medical Campus hebben een eenvoudig open-source coderingspakket bedacht en demonstreren de basisstappen die betrokken zijn bij eiwitvertering op de Opentrons OT-2 robotische platform3.
Surfactanten zoals SDS worden vaak gebruikt om cellulaire extractie en proteoomsolubilisatie voorafgaand aan MS te vergemakkelijken. Echter, SDS verwijdering kan onvolledig zijn, of anders het risico op monsterverlies lopen. Nickerson en collega's aan Dalhousie University demonstreren een wegwerpbare cartridge om het proces van eiwitprecipitatie te automatiseren4. Een combinatie van zout en organisch oplosmiddel is cruciaal om de eiwitrecuperatie te maximaliseren en kan in minimale tijd met hoge opbrengsten worden uitgevoerd.
Metabolomics volgt de voetsporen van proteoomanalyse, met een groeiende database van referentie MS-spectra die wordt gebruikt om onbekende metabolieten in gerichte en niet-gerichte workflows te identificeren. Net als bij de proteomics-analyse zijn spectrale identificaties vatbaar voor valse positieve matches, en daarom is een statistisch rapport van de valse ontdekkingssnelheid (FDR) essentieel om resultaten met lage betrouwbaarheid te filteren. Li en collega's aan Jinan University werkten samen met Chi-Biotech Co. om een webgebaseerde workflow te produceren op basis van hun XY-Meta programma en om een doelwit-decoy database van metabolieten te genereren5. Ze demonstreren de stappen om de doelwitdatabase te genereren en de metabolische resultaten te filteren op basis van een gewenste FDR.
Ten slotte wordt een protocol voor isolatie van een enkele celproteoom gedemonstreerd door Petelski en collega's aan Northeastern University6. Het Single-Cell ProtEomics (SCoPE2) protocol stelt onderzoekers in staat om honderden tot duizenden eiwitten in een enkele experiment te kwantificeren, met behulp van een isobare drager om monstersverlies te verminderen. De sleutel tot het protocol is een snelle thermische cyclusstap om de cellen te lyseren, evenals efficiënte tryptische vertering met behulp van een groter dan typisch bedrag aan enzym en isobare labelen met TMT-tags.
Ondanks tientallen jaren ervaring in proteomics, is dit volwassen veld gewoon geëvolueerd om meer uitdagende problemen aan te pakken. Het vermogen om een groter aantal monsters, of kleinere hoeveelheden materiaal, te verwerken met grotere consistentie en vertrouwen in de data-output blijft technologische innovaties aandrijven. De uitwisseling van ideeën met betrekking tot chemische manipulaties, instrumentele en informatie-benaderingen is essentieel voor de groei van dit veld. Het ‘probleem’ van één onderzoeker kan al zijn opgelost door een eenvoudige ‘tip of truc’ om de uitdaging te overwinnen. Het is daarom een positief teken dat er zoveel unieke strategieën voor proteoomanalyse beschikbaar zijn. Voor de uitdagingen die nog resten, is het waarschijnlijk dat iemand al aan een mogelijke oplossing werkt.