Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden

5.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64878

⸱

6 januari 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Washington University in St. Louis, 2University of California San Francisco

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Patiënt-afgeleide organoïden (BOB) zijn een driedimensionale (3D) cultuur die de tumoromgeving in vitro kan nabootsen. Bij hooggradige sereuze eierstokkanker vertegenwoordigen BOB's een model om nieuwe biomarkers en therapieën te bestuderen.

Samenvatting

Organoïden zijn 3D-dynamische tumormodellen die met succes kunnen worden gekweekt uit van de patiënt afgeleid ovariumtumorweefsel, ascites of pleuravocht en helpen bij de ontdekking van nieuwe therapieën en voorspellende biomarkers voor eierstokkanker. Deze modellen recapituleren klonale heterogeniteit, de tumormicro-omgeving en cel-cel- en cel-matrixinteracties. Bovendien is aangetoond dat ze morfologisch, cytologisch, immunohistochemisch en genetisch overeenkomen met de primaire tumor. Organoïden vergemakkelijken dus onderzoek naar tumorcellen en de micro-omgeving van de tumor en zijn superieur aan cellijnen. Het huidige protocol beschrijft verschillende methoden om patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden te genereren uit patiënttumoren, ascites en pleurale vloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De patiëntmonsters worden gescheiden in cellulaire suspensies door zowel mechanische als enzymatische spijsvertering. De cellen worden vervolgens verguld met behulp van een keldermembraanextract (BME) en worden ondersteund met geoptimaliseerde groeimedia die supplementen bevatten die specifiek zijn voor het kweken van hoogwaardige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Na het vormen van initiële organoïden kunnen de BOB's een langdurige cultuur ondersteunen, inclusief het passeren voor uitbreiding voor volgende experimenten.

Inleiding

In 2021 werden ongeveer 21.410 vrouwen in de Verenigde Staten nieuw gediagnosticeerd met epitheliale eierstokkanker en stierven 12.940 vrouwen aan deze ziekte1. Hoewel er voldoende vooruitgang is geboekt in chirurgie en chemotherapie, ontwikkelt meer dan 70% van de patiënten met een gevorderde ziekte chemotherapeutische resistentie en sterft binnen 5 jaar na diagnose 2,3. Daarom zijn nieuwe strategieën om deze dodelijke ziekte te behandelen en representatieve, betrouwbare modellen voor preklinisch onderzoek dringend nodig.

Kankercellijnen en patiënt-afgeleide xenografts (PDX) gemaakt van primaire eierstoktumoren zijn de belangrijkste instrumenten die worden gebruikt in onderzoek naar eierstokkanker. Een groot voordeel van kankercellijnen is hun snelle expansie. Hun voortdurende cultuur resulteert echter in fenotypische en genotypische veranderingen die ervoor zorgen dat de kankercellijnen afwijken van het oorspronkelijke primaire kankertumormonster. Vanwege de bestaande verschillen tussen de kankercellijn en de primaire tumor, hebben medicijntests met positieve effecten in cellijnen niet dezelfde effecten in klinische onderzoeken2. Om deze beperkingen te overwinnen, worden PDX-modellen gebruikt. Deze modellen worden gemaakt door vers eierstokkankerweefsel te implanteren in immunodeficiënte muizen. Omdat het in vivo modellen zijn, lijken ze nauwkeuriger op menselijke biologische kenmerken en zijn ze op hun beurt meer voorspellend voor de uitkomsten van geneesmiddelen. Deze modellen hebben echter ook aanzienlijke beperkingen, waaronder de kosten, tijd en middelen die nodig zijn om ze te genereren4.

BOB's bieden een alternatief model voor preklinisch onderzoek dat de beperkingen van zowel kankercellijnen als PDX-modellen overwint. BOB's recapituleren de tumor en tumormicro-omgeving van een patiënt en bieden zo een in vitro tracteerbaar model dat ideaal is voor preklinisch onderzoek 2,3,5. Deze 3D-modellen hebben zelforganisatiemogelijkheden die de primaire tumor modelleren, wat een kenmerk is dat hun tweedimensionale (2D) cellijn-tegenhangers niet bezitten. Verder is aangetoond dat deze modellen genetisch en functioneel hun oudertumoren vertegenwoordigen en dus betrouwbare modellen zijn voor het bestuderen van nieuwe therapieën en biologische processen. Kortom, ze bieden uitbreidings- en opslagmogelijkheden op lange termijn die vergelijkbaar zijn met cellijnen, maar omvatten ook de micro-omgeving en cel-celinteracties die inherent zijn aan muismodellen 4,6.

Het huidige protocol beschrijft de creatie van BOB's uit patiënt-afgeleide tumoren, ascites en pleuravloeistofmonsters met een succespercentage van meer dan 97%. De BOB-culturen kunnen vervolgens gedurende meerdere generaties worden uitgebreid en worden gebruikt om de gevoeligheid voor medicamenteuze therapie en voorspellende biomarkers te testen. Deze methode vertegenwoordigt een techniek die kan worden gebruikt om behandelingen te personaliseren op basis van de therapeutische reacties van BOB's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle menselijke weefselmonsters die voor onderzoek zijn verzameld, zijn verkregen volgens het door de Institutional Review Board (IRB) goedgekeurde protocol. De onderstaande protocollen werden uitgevoerd in een steriele menselijke weefselkweekomgeving. Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van menselijke proefpersonen. In aanmerking komende patiënten moesten een diagnose of vermoedelijke diagnose van eierstokkanker hebben, bereid en in staat zijn om geïnformeerde toestemming te ondertekenen en ten minste 18 jaar oud zijn. Tumorweefsel (kwaadaardige primaire tumor of gemetastaseerde plaatsen), ascites en pleuravocht werden verkregen van instemmende patiënten op het moment van hun procedure. Deze monsters werden onmiddellijk naar het laboratorium vervoerd en verwerkt voor het genereren van organoïden met behulp van de hieronder beschreven methoden.

1. Mediavoorbereiding

  1. Complete voorbereiding van organoïde media
    1. Bereid R-spondin 1/Noggin geconditioneerd medium voor volgens een eerder gepubliceerd rapport7.
      OPMERKING: R-spondin-1/Noggin geconditioneerd medium is een betaalbaarder alternatief voor in de handel verkrijgbare recombinante eiwitten. HEK293T-cellen die stabiel R-spondin-1 en Noggin afscheiden via lentivirus-gemedieerde transductie waren een genereus geschenk van Ron Bose, Washington University School of Medicine in St. Louis, en Anil Rustgi, New York-Presbyterian / Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Commercieel geconditioneerd medium zou als substituut kunnen worden gebruikt (zie materiaaltabel).
  2. Om het volledige organoïde medium te maken, combineert u 10% R-spondin 1/Noggin geconditioneerd medium, 50 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF-10, 10 ng/ml FGF2, 1x B27, 10 mmol/l nicotinamide, 1,25 mmol/l N-acetylcysteïne, 1 μmol/l prostaglandine E2, 10 μmol/l SB202190, 500 nmol/L A83-01 en 10 μM ROCK-remmer (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Het medium kan maximaal 3 maanden bij 4 °C worden bewaard. Dit medium is overgenomen uit Hill et al.11. De concentraties en ingrediënten van het medium zijn hetzelfde, met toevoeging van een ROCK-remmer.
  3. Bereid organoïde basismedium door 500 ml van een geavanceerde formulering van DMEM / F12 te combineren met 1% penicilline-streptomycine, 1x dipeptide, L-alanyl-L-glutamine en 1x HEPES (10 mM) (zie tabel met materialen).

2. Oogsten van organoïden uit ascites en pleuravocht

OPMERKING: Ascites en pleuravocht moeten zo snel mogelijk worden verwerkt voor de beste opbrengst van organoïden. Ontdooi eerder geïniformeerde BME-, DNase- I- en DNase I-reactiebuffer (zie materiaaltabel) door deze op ijs te plaatsen totdat de inhoud vloeibaar is.

  1. Verkrijg ascites en pleuravocht van instemmende patiënten op het moment van standaardzorgoperaties of -procedures en vervoer bij kamertemperatuur in een reiscontainer naar het laboratorium.
    OPMERKING: Alle ascites- of pleuravochtverwerking moet worden uitgevoerd in een steriele omgeving.
  2. Breng 50 ml ascites of pleuravocht over naar 50 ml conische buizen (het aantal buizen is afhankelijk van het volume van de verkregen ascites). Centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gebruik na het centrifugeren een glazen Pasteurpipet om het supernatant voorzichtig op te zuigen.
  3. Ga verder door 50 ml ascites of pleuravloeistof toe te voegen aan de eerder gecentrifugeerde pellet en centrifugeer opnieuw bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het supernatant voorzichtig aan met een glazen Pasteurpipet. Herhaal deze stap totdat alle ascites of pleuravocht zijn verwerkt.
  4. Bereid een DNase I-oplossing van 100 μg/ml door 1.000 μl nucleasevrij water, 100 μl DNase I-reactiebuffer en 10 μl DNase I te combineren.
    OPMERKING: De toegepaste DNase I-behandeling is voldoende om een eencellige suspensie te maken, ongeacht de aanwezigheid van celaggregaten in sommige patiëntmonsters12.
  5. Suspendeerde elke celpellet in 1 ml 100 μg/ml DNase I-oplossing. Voeg de DNase I-oplossing druppelsgewijs voorzichtig toe en laat de buis 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
    OPMERKING: Voeg minimaal 1 ml DNase I-oplossing toe. Als 1 ml niet genoeg is om de pellet te verstoren, voeg dan nog eens 1 ml toe.
  6. Voeg na de incubatie 25 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de cellen en keer voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.
  7. Resuspensie van de nieuw gevormde celkorrels in voorverwarmde 5 ml 1x rode bloedcel (RBC) lysisbuffer (zie materiaaltabel). Stel de vortex in op 458 x g en vortex de oplossingen in elke conische buis. Zodra de oplossingen homogeen zijn, gebruikt u een serologische pipet om de inhoud van alle conische buizen te combineren tot een enkele conische buis van 50 ml.
  8. Incubeer de conische buis met de vortexoplossing bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: Onderzoek de pellet. Een roze/rode pellet duidt op de aanwezigheid van RBC's, waardoor de RBC-lysisbufferstap moet worden herhaald totdat de pellet niet langer rood is.
  9. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet. Was vervolgens de pellet met 10 ml PBS, draai de oplossing op 458 x g en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.650 x g bij 4 °C.
  10. Als een grote celkorrel wordt gevormd, zuigt u de PBS op met behulp van een glazen Pasteurpipet en voegt u 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de pellet. Vortex de oplossing op 458 x g en breng 300-400 μL over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer de microcentrifugebuis bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Het deel van de celpellet dat niet in de microcentrifugebuis wordt geplaatst, kan worden ingevroren voor toekomstig gebruik (500 μL cellen tot 1 ml 10% DMSO in FBS). De bevroren celpellet kan wekenlang worden bewaard bij −80 °C en jarenlang bij plaatsing in vloeibare stikstof13.
  11. Zuig het organoïde basismedium voorzichtig op (stap 1.3) met behulp van een glazen Pasteurpipet en resuspensie in BME (zie materiaaltabel) met behulp van koude uiteinden.
    OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het wordt aanbevolen om 25% organoïde basismedium (stap 1.3) te gebruiken met geresuspendeerde cellen tot 75% BME.
  12. Plaat 40 μL aliquots van de geresuspendeerde celoplossing op een 6-well plaat. Plaat maximaal vijf aliquots per put (figuur 1).
  13. Plaats de plaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in een incubator van 37 °C om de BME te laten stollen. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.

figure-protocol-1
Figuur 1: Plating van patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden. Representatief beeld van de organoïde beplating. Aliquots van het organoïdemengsel worden zorgvuldig verguld, zodat er geen bubbels worden gevormd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Organoïden oogsten uit weefsel

OPMERKING: Weefsel moet zo snel mogelijk worden verwerkt voor de beste opbrengst van organoïden.

  1. Verzamel en transporteer de tumor op ijs in een reiscontainer met PBS.
  2. Plaats het monster op een weefselkweekschaal van 10 cm (figuur 2). Gebruik een wegwerp scalpel om het weefsel te hakken. Gebruik vervolgens het doffe uiteinde van een wegwerpspuit en plet het weefsel totdat een homogeen mengsel is gemaakt.
  3. Plaats met een tang het homogene weefselmengsel in een dissociatiebuis. Voeg voor elke 1-2 ml gehomogeniseerd weefsel 7-8 ml 1 mg/ml type II collagenaseoplossing (zie materiaaltabel) toe in organoïde basismedium (stap 1.3) en 1 ml DNase I-oplossing. Vortex de oplossing bij 458 x g.
    OPMERKING: De hoeveelheid weefsel bepaalt de hoeveelheid collagenase-oplossing en het aantal benodigde buizen.
  4. Gebruik de dissociatiemachine (zie materiaaltabel) om het weefsel vloeibaar te maken terwijl het zich in de collagenase-oplossing bevindt. Voer het programma 37C_h_TDK3 (1 uur) uit totdat het een eencellige suspensie is.
    OPMERKING: Het programma moet opnieuw worden uitgevoerd als het resulterende mengsel niet homogeen is (d.w.z. als er nog weefselstukken in het mengsel aanwezig zijn). Als het weefsel wordt verteerd maar de oplossing stroperig is, verdun dan met organoïde basismedium (stap 1.3).
  5. Breng het gehomogeniseerde mengsel over in een nieuwe conische buis van 50 ml en voeg 20-40 ml organoïde basismedium toe (stap 1.3). Filter vervolgens de oplossing door een 100 μm celzeef in een nieuw gelabelde conische buis van 50 ml.
  6. Centrifugeer het gefilterde mengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
  7. Bereid een DNase I-oplossing van 100 μg/ml door 1.000 μl nucleasevrij water, 100 μl DNase I-reactiebuffer en 10 μl DNase I te combineren.
    OPMERKING: De toegepaste DNase I-behandeling is voldoende om een eencellige suspensie te maken, ongeacht de aanwezigheid van celaggregaten in sommige patiëntmonsters12.
  8. Resuspendie van de cellen in 1 ml 100 ug/ml DNase I-oplossing. Voeg de DNase I-oplossing druppelsgewijs voorzichtig toe en laat de buis 15 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
  9. Voeg na de incubatie 25 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de cellen en keer voorzichtig om om te mengen. Centrifugeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.
  10. Resuspendie van de nieuw gevormde celkorrel in 5 ml voorverwarmde 1x RBC-lysisbuffer. Vortex de oplossingen in elke conische buis op 458 x g.
  11. Incubeer de conische buis met de celkorrel geresuspendeerd in de RBC-lysisbuffer gedurende 5 minuten. Zodra de incubatie is voltooid, centrifugeert u gedurende 5 minuten bij 1.650 x g bij 4 °C.
    OPMERKING: Onderzoek de pellet. Een roze/rode pellet duidt op de aanwezigheid van RBC's, waardoor de RBC-lysisbufferstap moet worden herhaald totdat de pellet wit lijkt.
  12. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet. Was vervolgens de pellet met 10 ml PBS, draai de oplossing op 458 x g en centrifugeer gedurende 5 minuten op 1.650 x g bij 4 °C.
  13. Als een grote celkorrel wordt gevormd, zuigt u de PBS op met behulp van een glazen Pasteurpipet en voegt u 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan de pellet. Vortex de oplossing op 458 x g en breng 300-400 μL over in een microcentrifugebuis. Centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Het gedeelte van de celpellet dat niet in de microcentrifugebuis wordt geplaatst, kan worden ingevroren voor toekomstig gebruik (500 μL cellen tot 1 ml 10% DMSO in FBS) (stap 5.1). De bevroren celpellet kan wekenlang worden bewaard bij −80 °C en jarenlang bij plaatsing in vloeibare stikstof13.
  14. Zuig het organoïde basismedium voorzichtig aan met een glazen Pasteurpipet en resuspensie in BME met behulp van koude uiteinden.
    OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedium (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen.
  15. Plaats de geresuspendeerde celoplossing op een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaat maximaal vijf aliquots per put.
  16. Plaats de putplaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.

figure-protocol-2
Figuur 2: Tumorweefsel voorafgaand aan dissectie. Representatief beeld van tumorweefsel verkregen voor organoïde generatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Doorgifte van organoïden

OPMERKING: Als het monster confluent is, kan elke organoïde put wekelijks naar twee nieuwe putten worden doorgegeven.

  1. Voeg met behulp van een pipet van 1 ml 1 ml organoïde basismedium (stap 1.3) toe aan elk putje en pipetteer het medium rechtstreeks op de organoïde tabbladen om het te dissociëren. Verzamel al het medium met de geresuspendeerde pellets in een conische buis van 15 ml.
  2. Centrifugeer de conische buis van 15 ml met het mengsel gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 1.650 x g . Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
  3. Voeg 1 ml dierlijk, recombinant enzym (zie tabel met materialen) toe aan de celpellet, draai de oplossing op 458 x g en breng over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml. Laat de buis 15 minuten incuberen in een waterbad van 37 °C.
  4. Na incubatie, centrifugeer bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig vervolgens het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
  5. Resuspendeerde de pellet in BME.
    OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedia (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen.
  6. Plaats de geresuspendeerde celoplossing in een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaat maximaal vijf aliquots per put. Zodra alle aliquots zijn verguld, plaatst u de putplaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan elk putje.

5. Invriezen en ontdooien van organoïden

  1. Invriezen van organoïden
    1. Begin met stap 4.1-4.4.
    2. Resuspendeer de celpellet in 0,5-1 ml vriesmedium voor herstelcelcultuur (zie tabel met materialen) en breng 1 ml over naar elke cryovial.
    3. Plaats de cryovialen vervolgens in een met isopropanol gevulde container bij −80 °C gedurende maximaal 2 weken voordat u ze overbrengt naar een tank met vloeibare stikstof voor langdurige opslag13.
  2. Ontdooien van organoïden
    1. Haal de monsters uit de tank met vloeibare stikstof en ontdooi bij een waterbad van 37 °C.
    2. Eenmaal ontdooid, overbrengen in een conische buis van 15 ml en centrifugeren bij 1.650 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Na het centrifugeren zuigt u het supernatant voorzichtig op met behulp van een glazen Pasteurpipet.
    3. Resuspendeerde de pellet in BME.
      OPMERKING: De hoeveelheid BME is gebaseerd op de grootte van de pellet. Het toevoegen van 25% organoïde basismedia (stap 1.3) met geresuspendeerde cellen tot 75% BME wordt aanbevolen.
    4. Plaats de geresuspendeerde celoplossing op een 6-wellsplaat in aliquots van 40 μL. Plaats maximaal vijf aliquots per put.
    5. Plaats de plaat onmiddellijk gedurende 20 minuten in de incubator. Voeg na de incubatie voorzichtig 2 ml volledig organoïde medium (stap 1.2) toe aan de putjes.

6. Insluiten en genereren van formaline-fixed paraffine-embedded (FFPE) dia's om de organoïde samenstelling te evalueren

  1. Na het kweken van organoïden gedurende ten minste 10 dagen om voldoende grootte te garanderen, verwijdert u het volledige organoïde medium uit de putten en voegt u 1 ml 2% paraformaldehydefixatief (PFA) toe. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5-10 min.
  2. Was na incubatie de gekweekte organoïde aliquots 3x gedurende 5 minuten telkens met 1 ml PBS.
  3. Verwijder de PBS uit elk putje en voeg 1 ml warme 2% agar in gedeïoniseerd H2O toe aan elk putje. Til bij het toevoegen van de agar de gekweekte organoïde aliquots van de plaat op met behulp van een spatel.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de agar niet te laten verharden voordat u de gekweekte organoïde aliquots optilt.
    1. Laat de agar bij kamertemperatuur in de put stollen.
  4. Maak met een kleine spatel de gestolde agar uit de put en bewaar deze in een cassette gedurende maximaal 48 uur (zie materiaaltabel) bij 4 °C in 70% ethanol tot verwerking14.
  5. Sluit de monsters in paraffine 15 in, snijd de dia's tot een dikte van 5 μm en bevlek de dia's met hematoxyline en eosine (H &E, zie materiaaltabel) kleuring met behulp van een standaardprotocol15.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om BOB's te genereren, werden de monsters mechanisch en enzymatisch verteerd tot eencellige suspensies. De cellen werden vervolgens geresuspendeerd in BME en aangevuld met specifiek ontworpen media (figuur 3). Organoïden worden meestal vastgesteld over een tijdsbestek van 10 dagen, waarna ze discrete organoïden in cultuur vertonen (figuur 4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Eierstokkanker is uiterst dodelijk vanwege het gevorderde stadium bij de diagnose, evenals de gemeenschappelijke ontwikkeling van chemotherapieresistentie. Veel vooruitgang in het onderzoek naar eierstokkanker is gemaakt door gebruik te maken van kankercellijnen en PDX-modellen; Er is echter een duidelijke behoefte aan een representatiever en betaalbaarder in vitro model. BOB's hebben bewezen de tumorheterogeniteit, de tumormicro-omgeving en de genomische en transcriptomische kenmerken van hun primaire tumoren n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn dankbaar voor de begeleiding van Ron Bose, MD, PhD, en de hulp van Barbara Blachut, MD, bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program en het Reproductive Scientist Development Program erkennen voor hun steun aan dit project.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% HEPESLife Technologies15630080
1% Penicillin-StreptomycinFisher Scientific30002CI
1.5 mL Eppendorf Tubes Genesee Scientific14125
10 cm Tissue Culture Dish TPP93100
10 mL Serological Pipet
100 µm Cell FilterMidSci100ICS
15 mL centrifuge tubesCorning430052
2 mL CryovialSimport ScientificT301-2
2% Paraformaldehyde FixativeSigma-Aldrich
37 °C water bath NEST602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media SupplementMillipore SigmaSCM104
6 well platesTPP92006
70% EthanolSigma-AldrichR31541GA
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12ThermoFisher12634028
AgarLamda BiotechC121
B-27Life Technologies17504044
Centrifuge 
Cultrex Type 2R&D Systems3533-010-02basement membrane extract
DNase INew England Bio LabsM0303S
DNase I Reaction BufferNew England Bio LabsM0303S
EGFPeproTechAF-100-15
FBS Sigma-AldrichF2442
FGF-10PeproTech100-26
FGF2PeproTech100-18B
gentleMACS C TubesMiltenyi BioTech130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator with HeatersMiltenyi BioTech130-096-427We gebruiken het protocol van de fabrikant.
GlutaMAXLife Technologies35050061dipeptide, L-alanyl-L-glutamine
Hematoxylin and Eosin Staining KitFisher ScientificNC1470670
Histoplast Paraffin WaxFisher Scientific22900700
Microcentrifuge 
Mr. Frosty Freezing ContainerFisher Scientific07202363S
N-acetylcysteineSigma-AldrichA9165
NicotinamideSigma-AldrichN0636
p1000 Pipette with Tips 
p200 Pipette with Tips 
Pasteur Pipettes 9"Fisher Scientific1367820D
PBSFisher ScientificMT21031CM
Pipet Controller
Prostaglandin E2R&D Systems2296
Puromycin ThermoFisherA1113802
Recombinant Murine NogginPeproTech250-38
Recovery Cell Culture Freezing MediumInvitrogen12648010
Red Blood Cell Lysis BufferBioLegend420301
ROCK Inhibitor (Y-27632)R&D Systems1254/1
SB202190Sigma-AldrichS7076
T75 FlaskMidSciTP90076
Tissue Culture Hood 
Tissue Embedding Cassette
TrypLE ExpressInvitrogen12604013dierpvrij, recombinant enzym
Type II CollagenaseLife Technologies17101015
Vortex

Referenties

  1. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
  2. Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
  3. Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
  4. Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
  5. Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429(2021).
  6. Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
  7. Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109(2020).
  8. Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408(2015).
  9. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  10. Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
  11. Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
  12. Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
  13. Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106(2020).
  14. Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
  15. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
  16. Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
  17. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to Matrigel. Nature Reviews Materials. 5 (7), 539-551 (2020).
  18. Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581(2020).
  19. Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Eierstokkanker-organoïdenorganoïdcultuurtumormicro-omgevingmechanische digestieenzymatische digestiebasaalmembraanextractpasseren van organoïdencryopreservatiehematoxyline-eosin-kleuring
Generatie en kweek van hoogwaardige sereuze eierstokkankerpatiënt-afgeleide organoïden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.