Het huidige protocol beschrijft methoden voor het evalueren van DNA-schadehersteleiwitten in van patiënten afgeleide eierstokkankerorganoïden. Hier zijn uitgebreide plating- en kleuringsmethoden opgenomen, evenals gedetailleerde, objectieve kwantificeringsprocedures.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het visualiseren van DNA-schadehersteleiwitten in patiënt-afgeleide eierstokkanker organoïden via immunofluorescentietests
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Immunofluorescentie is een van de meest gebruikte technieken om doelantigenen met een hoge gevoeligheid en specificiteit te visualiseren, waardoor de nauwkeurige identificatie en lokalisatie van eiwitten, glycanen en kleine moleculen mogelijk is. Hoewel deze techniek goed ingeburgerd is in tweedimensionale (2D) celcultuur, is er minder bekend over het gebruik ervan in driedimensionale (3D) celmodellen. Eierstokkankerorganoïden zijn 3D-tumormodellen die de klonale heterogeniteit van tumorcellen, de micro-omgeving van de tumor en cel-cel- en cel-matrixinteracties samenvatten. Ze zijn dus superieur aan cellijnen voor de evaluatie van medicijngevoeligheid en functionele biomarkers. Daarom is het vermogen om immunofluorescentie te gebruiken op primaire eierstokkankerorganoïden uiterst gunstig voor het begrijpen van de biologie van deze kanker. De huidige studie beschrijft de techniek van immunofluorescentie om DNA-schadehersteleiwitten te detecteren in hoogwaardige sereuze patiënt-afgeleide ovariumkankerorganoïden (PDO's). Na blootstelling van de BOB's aan ioniserende straling, wordt immunofluorescentie uitgevoerd op intacte organoïden om nucleaire eiwitten als foci te evalueren. Beelden worden verzameld met behulp van z-stack imaging op confocale microscopie en geanalyseerd met behulp van geautomatiseerde foci-telsoftware. De beschreven methoden maken de analyse van temporele en speciale rekrutering van DNA-schadehersteleiwitten en colocalisatie van deze eiwitten met celcyclusmarkers mogelijk.
Inleiding
Eierstokkanker is de belangrijkste doodsoorzaak als gevolg van gynaecologische maligniteit. De meerderheid van de patiënten wordt behandeld met DNA-beschadigende geneesmiddelen zoals carboplatine, en degenen met homologe recombinatieherstel (HRR)-deficiënte tumoren kunnen poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) -remmers 1,2 krijgen. De meeste patiënten ontwikkelen echter resistentie tegen deze therapieën en sterven binnen 5 jaar na de diagnose. Ontregeling van de DNA-schaderespons (DDR) is in verband gebracht met de ontwikkeling van eierstokkanker en zowel chemotherapie als PARP-remmerresistentie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Tumorweefsel en ascites werden verkregen na het verkrijgen van toestemming van de patiënt als onderdeel van een gynaecologische oncologische biorepository die werd goedgekeurd door de Washington University in St. Louis Institutional Review Board (IRB). Patiënten werden geïncludeerd als ze een vergevorderd stadium hadden van hooggradige sereuze eierstokkanker (HGSOC). Alle procedures werden uitgevoerd bij kamertemperatuur op de bank, tenzij anders aangegeven. Alle reagentia werden bereid bij kamertemperatuur (tenzij anders aangegeven) en bewaard bij 4 °C.
1. Organoïde generatie
- Genereer de organoïden volgens het ee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het gepresenteerde protocol kan met succes nucleaire DNA-schadehersteleiwitten in organoïden kleuren, visualiseren en kwantificeren. Deze techniek werd gebruikt om BOB's zowel voor als na de bestraling te kleuren en te evalueren. BOB's werden blootgesteld aan 10 Gy straling en geëvalueerd op de volgende biomarkers: ɣ-H2AX (figuur 1), een marker van DNA-schade; RAD51 (figuur 2), een marker voor HRR; 53BP1, een marker van NHEJ; RPA, een marker van replicatiestress.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De DNA-schaderespons speelt een integrale rol bij zowel de ontwikkeling van eierstokkanker als chemotherapieresistentie. Daarom is een grondig begrip van DNA-reparatiemechanismen noodzakelijk. Hier wordt een methodologie gepresenteerd om DNA-schadehersteleiwitten in 3D, intacte organoïden te bestuderen. Een reproduceerbaar, betrouwbaar protocol wordt ontwikkeld met behulp van kenmerkende antilichamen om DNA-schade, homologe recombinatie, niet-homologe eindverbinding en replicatiestress te evalueren. Belangrijk is dat dez.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
We zijn dankbaar voor de begeleiding van Pavel Lobatsjevski, PhD bij het opstellen van dit protocol. We willen ook de Washington University's School of Medicine in St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology en Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation en het Reproductive Scientist Development Program bedanken voor hun steun aan dit project.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | verdund tot 1:500 in kleuringsbuffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | verdund tot 1:200 in kleuringsbuffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | verdund tot 1:400 in kleuringsbuffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | verdund tot 1:1000 in kleuringsbuffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | verdund tot 1:500 in kleuringsbuffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | verdund tot 1:200 in kleuringsbuffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Elke heldere nagellak is voldoende | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Zou waarschijnlijk Matrigel of andere BME Matrix kunnen gebruiken |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagens, Verdund in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | Voor toegang tot de software, E-mail: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Verdun tot 4% PFA in PBS++ om 2% PFA te verkrijgen |
| Permeabilisatie Buffer | Gemaakt in Lab | 0,2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Kleuringsbuffer | Gemaakt in Lab | 0,5% BSA, 0,15% Glycine, 0,1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0,4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | vrij van dierlijke oorsprong, recombinant enzym |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
Referenties
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
