Methodenartikel

Microvasculaire en macrovasculaire endotheliale celisolatie en zuivering van longmonsters

DOI:

10.3791/64885

⸱

3 februari 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical, Oral and Biotechnological Sciences, “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 2Center on Advanced Studies and Technology (CAST), “G. d’Annunzio” University of Chieti-Pescara, 3Department of Medicine and Aging Sciences, University “G. d’Annunzio” of Chieti-Pescara, 4U.O. di Chirurgia Toracica e dei Trapianti di Polmone, Fondazione IRCCS Ca’ Granda - Ospedale Maggiore Policlinico di Milano, 5Dipartimento di Fisiopatologia Medico-Chirurgica e dei Trapianti, Università degli Studi di Milano, 6Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano, 7Unit of Cell and Molecular Biology in Cardiovascular Diseases, Centro Cardiologico Monzino IRCCS

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De beschikbaarheid van cellen geïsoleerd uit gezonde en zieke weefsels en organen vormt een sleutelelement voor gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen. Hoewel biobanken een brede verzameling primaire en onsterfelijke cellen voor biomedisch onderzoek kunnen bieden, dekken deze niet alle experimentele behoeften, met name die met betrekking tot specifieke ziekten of genotypen. Vasculaire endotheelcellen (EC's) zijn belangrijke componenten van de immuunontstekingsreactie en spelen dus een centrale rol in de pathogenese van een verscheidenheid aan aandoeningen. Met name EC's van verschillende locaties vertonen verschillende biochemische en functionele eigenschappen, waardoor de beschikbaarheid van specifieke EC-typen (d.w.z. macrovasculair, microvasculair, arterieel en veneus) essentieel is voor het ontwerpen van betrouwbare experimenten. Hier worden eenvoudige procedures voor het verkrijgen van hoogrenderende, vrijwel zuivere menselijke macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen uit de longslagader en longparenchym in detail geïllustreerd. Deze methode kan gemakkelijk worden gereproduceerd tegen relatief lage kosten door elk laboratorium om onafhankelijk te worden van commerciële bronnen en EC-fenotypen / genotypen te verkrijgen die nog niet beschikbaar zijn.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vasculaire endotheel bekleedt het binnenoppervlak van de bloedvaten. Het speelt een sleutelrol bij het reguleren van bloedstolling, vasculaire tonus en immuun-inflammatoire reacties 1,2,3,4. Hoewel de kweek van endotheelcellen (EC's) geïsoleerd uit menselijke specimens essentieel is voor onderzoeksdoeleinden, moet worden opgemerkt dat de EC's uit verschillende bloedvaten (slagaders, aderen, haarvaten) specifieke functies hebben. Deze kunnen niet volledig worden samengevat door humane navelstreng-endotheelcellen (HUVEC), die gemakkelijk verkrijgbaar zijn en op grote schaal worden gebruikt in studies naar vasculaire endotheelpathofysiologie 5,6. Menselijke longmicrovasculaire endotheelcellen (HLMVECs) spelen bijvoorbeeld een sleutelrol bij longontsteking door de rekrutering en accumulatie van leukocyten te beheersen 4,7. Een experimentele setting gericht op het reproduceren van longontsteking met hoge getrouwheid zou dus HLMVEC's moeten omvatten. Aan de andere kant kan EC-disfunctie worden waargenomen in verschillende pathologieën; daarom zijn EC's van de patiënt van fundamenteel belang voor het bouwen van een betrouwbaar in vitro model van de ziekte. Bijvoorbeeld, de isolatie van fragmenten van EC's uit de longslagader (HPAECs), ontleed uit de geëxplanteerde longen van mensen die getroffen zijn door cystic fibrosis (CF), hebben ons in staat gesteld om mechanismen van endotheeldisfunctie bij deze ziekte te ontdekken 8,9.

Protocollen gericht op het optimaliseren van de isolatie van EC's uit verschillende bronnen / organen, ook in ziektetoestanden, zijn dus essentieel om onderzoekers waardevolle onderzoeksinstrumenten te bieden, vooral wanneer deze hulpmiddelen niet commercieel beschikbaar zijn. HLMVEC- en HPAEC-isolatieprotocollen zijn eerder gemeld 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. In alle gevallen resulteerde de enzymatische vertering van de longmonsters in gemengde celpopulaties, die werden gezuiverd met behulp van ad hoc selectieve media en magnetische kralen- of cytometrische celsortering. Verdere optimalisaties van deze protocollen moeten twee belangrijke problemen in EG-isolatie aanpakken: (1) cel- en weefselverontreiniging, die zo snel mogelijk moet worden opgelost om EG-replicatieve senescentie te minimaliseren20; en (2) de lage opbrengst van primaire EC-isolaten.

Deze studie beschrijft een nieuw protocol voor de high-yield, high-purity isolatie van HLMVECs en HPAECs. Deze procedure kan eenvoudig toepasbaar zijn en geeft in een paar stappen vrijwel zuivere macrovasculaire en microvasculaire EC's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd goedgekeurd en het protocol volgde de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de Universiteit van Chieti-Pescara (# 237_2018bis). Figuur 1 illustreert de isolatie van endotheelcellen uit segmenten (1-3 cm lang) van longparenchym of longslagader van niet-geïdentificeerde menselijke proefpersonen (met schriftelijke toestemming) die om verschillende redenen thoracale chirurgie ondergaan, zoals pneumothorax of lobectomie. In dit laatste geval verzamelden de chirurgen ook een longslagadersegment. Met name de chirurgen werden nauwkeurig geïnstrueerd om kankervrije monsters te verzamelen. Het gepresenteerde protocol werd geoptimaliseerd om een zo groot mogelijke opbrengst en zuiverheid te verkrijgen.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Collagenase reconstitutie
    1. Los collagenasepoeder op in fosfaatgebufferde zoutoplossing zonder CaCl 2 en MgCl 2 (PBS−−, zie materiaaltabel) bij een concentratie van2 mg/ml en filter de oplossing met een poriënfilter van 0,22 μm.
    2. Bereid 5 ml aliquots en bewaar ze bij −20 °C. Ontdooi en verwarm de aliquots voor gebruik voor op 37 °C.
  2. Plaatcoating
    1. Voor plaatcoating, pipetteer 1,5% gelatine-oplossing of 50 μg/ml fibronectine (zie tabel met materialen) in de kweekplaat (500 μL is voldoende om het oppervlak van elke put van een 6-putplaat te bedekken) en incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Verwijder na incubatie de overtollige gelatine en was de putjes met PBS−−. Zuig de PBS−− aan en laat de plaat drogen in een steriele kap.
      OPMERKING: Voor gelatinereconstitutie, los het poeder op in water om een 1,5% -oplossing te maken, autoclaaf het vervolgens en bewaar het bij 4 °C. Gelatine van 1,5% is niet vloeibaar bij 4 °C; daarom moet het worden opgewarmd voordat het wordt gecoat. Als alternatief kan elke commerciële gelatine-oplossing die geschikt is voor celculturen worden gebruikt voor de plaatcoating.

2. Monstervoorbereiding

  1. Longparenchym
    1. Was de verzamelde monsters door ze onder te dompelen in een buis van 50 ml met PBS−−.
    2. Breng de monsters over in een steriele petrischaal en hak het monster handmatig met een chirurgische schaar (optimale grootte: >2 cm) in kleine fragmenten van elk ongeveer 3-4 mm.
  2. Slagadersegment(en)
    1. Was de verzamelde monsters door ze onder te dompelen in een buis van 50 ml met PBS−−.
    2. Breng het over in een steriele petrischaal zonder te hakken, omdat fragmentatie het oppervlak van de doorsnede van het slagadersegment zal vergroten, waardoor de mogelijkheid om niet-EC's te isoleren toeneemt.

3. Enzymatische spijsvertering

  1. Was het in blokjes gesneden longparenchym of het longslagadersegment(en) tweemaal met PBS−−. Deze stap verwijdert een groot deel van het resterende bloed.
  2. Plaats de monsters in buisjes van 15 ml en incubeer met 5 ml collagenase type 2 (zie materiaaltabel) gedurende 10 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Tijdens deze incubatie geeft de afbraak van de extracellulaire matrix afzonderlijke cellen en celaggregaten vrij.

4. Herstel van de verteerde cellen

  1. Plaats een steriele staal/metalen zeef (d.w.z. een theezeef met een maaswijdte van ~1 mm) op de bovenkant van een opvangbuis van 50 ml.
  2. Giet de volledige inhoud van de buis van 15 ml op de zeef, masseer het verteerde weefsel voorzichtig met een spatel en spoel het monster af met PBS−− totdat de opvangbuis is gevuld.
    OPMERKING: Deze stap elimineert grote weefselfragmenten op de millimeterschaal, waardoor een grotere efficiëntie van de volgende filtratiestappen wordt gegarandeerd.

5. Niet-EG-verwijdering door filtratie

  1. Filter de uitstroom die in stap 4.2 is verzameld met behulp van een celzeef met een maaswijdte van 70 μm en vang de uitstroom op in een verse buis van 50 ml.
  2. Gebruik vervolgens een celzeef met een maaswijdte van 40 μm en verzamel de uitstroom in een verse buis van 50 ml. Label deze buis als "tube 1".
    OPMERKING: Deze filtraties in stap 5.1 en stap 5.2 verwijderen grote celaggregaten, die vaak zijn samengesteld uit gemengde celpopulaties.

6. Sedimentatie van celclusters en celzaaien

  1. Centrifugeer de monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 30 x g om de celclusters te bezinken.
  2. Verwijder het supernatant voorzichtig met behulp van een steriele pipet (niet gieten) en plaats het in een verse buis van 50 ml ("tube 2").
  3. Suspensie de pellet in "buis 1" en vul de buis tot 50 ml met PBS−−. Vul "tube 2" tot 50 ml met PBS−−.
    OPMERKING: Vanaf deze stap worden beide buizen op dezelfde manier behandeld.
  4. Centrifugeer de monsters op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  5. Suspensie de pellets met 2 ml groeimedium (zie materiaaltabel) en zaai de suspensie in twee afzonderlijke putjes van een voorgecoate 6-putplaat (stap 1.2).
    OPMERKING: Vanaf deze stap voedt u de cellen om de 2 dagen met het groeimedium totdat ze confluentie bereiken (ongeveer 1 week, afhankelijk van de steekproefgrootte) om een redelijk aantal cellen te verkrijgen om te sorteren.

7. Celuitbreiding

  1. Was de cellen met 2 ml PBS met CaCl 2 en MgCl2 (PBS++, zie materiaaltabel) om de resterende bloedcellen te verwijderen (het gebruik van PBS++ is belangrijk om celloslating te voorkomen).
  2. Verwijder de PBS++ en voeg vers kweekmedium toe.
  3. Herhaal stap 7.1 en stap 7.2 totdat de cellen confluentie bereiken (ongeveer 1 week, afhankelijk van de steekproefgrootte).

8. Celsortering

  1. Maak de cellen los met behulp van 500 μL trypsine-EDTA (0,05%, zie tabel met materialen), centrifugeer en resuspensie van de pellet met 190 μL PBS−−.
  2. Voeg 10 μL van een fluorescerend geconjugeerd anti-humaan CD31-FITC-antilichaam toe (1:20 verdunning, zie tabel met materialen) en incubeer de celsuspensie bij 4 °C gedurende 30 minuten.
  3. Was de cellen met 10 ml PBS−−, centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g bij kamertemperatuur en resuspensie van de pellet in 300 μL PBS−−.
  4. Isoleer en verzamel CD31-positieve (CD31+) cellen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS), met behulp van een 100 μm mondstuk, en verzamel ze in een buis.
    1. Volgens de gating-strategie definieert u eerst de celmorfologie met behulp van de parameters van het zijverstrooiingsgebied, SSC-A en FSC-A. Selecteer vervolgens afzonderlijke cellen met behulp van een FSC-Area/FSC-Height of SSC-Area/SSC-Height dot plot, definieer de positieve cellen in het gemarkeerde monster versus het niet-gekleurde controlemonster en leid de fluorescerende cellen naar de verzamelbuis21.
  5. Centrifugeer de celsuspensie op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en suspensie de pellet in 2 ml groeimedium voor zaaien in de voorgecoate putten van een 6-putplaat.

9. Uitbreiding na sortering

  1. Vervang twee dagen na het sorteren van de cellen het geconditioneerde medium door vers groeimedium.
  2. Herhaal stap 7.1 en stap 7.2 elke 2 dagen voor celuitbreiding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HLMEC isolatie
Het grootste probleem tijdens de isolatie van HLMVECs is de aanwezigheid van verontreinigende cellen, omdat de microscopische haarvaten niet gemakkelijk van het stromale weefsel kunnen worden gescheiden. Daarom is het bereiken van de hoogst mogelijke zuiverheid in de vroegste stadia van het isolatieproces cruciaal om de kweekpassages en dus de celveroudering te verminderen. Evenzo moet een optimaal isolatieprotocol de hoogst mogelijke opbrengst van zuivere HLMVEC's geven. Om deze doelen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De vele rollen die vasculaire endotheelcellen spelen in de menselijke pathofysiologie maken deze cellen een onmisbaar hulpmiddel voor in vitro pathogenetische en farmacologische studies. Aangezien EC's van verschillende vasculaire locaties / organen eigenaardige kenmerken en functies vertonen, zou de beschikbaarheid van gezonde en zieke EC's van het orgaan van belang ideaal zijn voor onderzoeksdoeleinden. HLMVECs zijn bijvoorbeeld essentieel voor studies naar longontsteking; Daarom zal een methodologie voor de h...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door fondsen van het Italiaanse ministerie van de Universiteit en Onderzoek (ex 60% 2021 en 2022) aan R. P. en door subsidies van de Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation (FFC # 23/2014) en van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (L548/93) aan M. R.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% trypsin-EDTA 1XGIBCO25300-054Gebruikt om cellen los te maken van de kweekplaten
Anti CD31 Antilichaam, clone WM59DakoM0823Gebruikt voor CD-31 kleuring in immunocytochemie. Verdunning gebruikt: 1:50
Anti vWF AntilichaamThermo Fisher ScientificMA5-14029Gebruikt voor von Willebrand factor kleuring in immunocytochemie. Werkconcentratie: 1:100
Autoclaveerbare chirurgische schaarElkGebruikt voor het hakken van specimens
Cell strainers 40 µmCorning431750Gebruikt tijdens de tweede filtratie
Cell strainers 70 µmCorning431751Gebruik tijdens de eerste filtratie
Collagenase, Type 2WorthingtonLS004177Type 2 Collagenase gebruikt voor enzymatische vertering. Werkconcentratie: 2 mg/mL
Geconjugeerd anti CD31 AntilichaamBD Biosciences555445Gebruikt voor celsortering (1:20 verdunning)
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) met  CaCl2 en MgCl2Sigma-AldrichD8662Gebruikt voor celwassing voordat het medium wordt ververst
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) zonder CaCl2 en MgCl2Sigma-AldrichD8537Gebruikt voor het wassen van chirurgische specimens en cellen voorafgaand aan trypsinisatie
Endotheelcel Groeimedium MVPromoCellC-22020HLMVEC groeimedium
FibronectineSigma-AldrichF0895Fibronectine uit menselijk plasma gebruikt voor plaatcoating. Werkconcentratie: 50 µg/mL
Gelatine uit varkenshuid, type ASigma-AldrichG2500Gebruikt voor plaatcoating
Type A gelatineSigma-Aldrichg-2500Gelatine uit varkenshuid gebruikt voor plaatcoating. Werkconcentratie: 1,5%

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
  2. Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
  3. Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
  4. Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
  5. Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183(2007).
  6. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032(2012).
  7. Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
  8. Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
  9. Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
  10. Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
  11. Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61(2016).
  12. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  13. Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
  14. Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
  15. Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23(2013).
  16. Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313(2020).
  17. Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458(2019).
  18. Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253(2021).
  19. Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
  20. Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501(2017).
  21. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).
  22. Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310(2020).
  23. Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
  24. Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
  25. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Longendotheliale cellenmicrovasculaire endotheliale cellenmacrovasculaire endotheliale cellenlongslagadercellencollagenaseverteringcelzuiveringcelzeeffiltratiecentrifugatiemethodeendotheelcelmarkers

Gerelateerde artikelen