Hoewel uitdagend, is de isolatie van pulmonale endotheelcellen essentieel voor studies naar longontsteking. Dit protocol beschrijft een procedure voor de hoogproductieve, zeer zuivere isolatie van macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Microvasculaire en macrovasculaire endotheliale celisolatie en zuivering van longmonsters
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De beschikbaarheid van cellen geïsoleerd uit gezonde en zieke weefsels en organen vormt een sleutelelement voor gepersonaliseerde geneeskundebenaderingen. Hoewel biobanken een brede verzameling primaire en onsterfelijke cellen voor biomedisch onderzoek kunnen bieden, dekken deze niet alle experimentele behoeften, met name die met betrekking tot specifieke ziekten of genotypen. Vasculaire endotheelcellen (EC's) zijn belangrijke componenten van de immuunontstekingsreactie en spelen dus een centrale rol in de pathogenese van een verscheidenheid aan aandoeningen. Met name EC's van verschillende locaties vertonen verschillende biochemische en functionele eigenschappen, waardoor de beschikbaarheid van specifieke EC-typen (d.w.z. macrovasculair, microvasculair, arterieel en veneus) essentieel is voor het ontwerpen van betrouwbare experimenten. Hier worden eenvoudige procedures voor het verkrijgen van hoogrenderende, vrijwel zuivere menselijke macrovasculaire en microvasculaire endotheelcellen uit de longslagader en longparenchym in detail geïllustreerd. Deze methode kan gemakkelijk worden gereproduceerd tegen relatief lage kosten door elk laboratorium om onafhankelijk te worden van commerciële bronnen en EC-fenotypen / genotypen te verkrijgen die nog niet beschikbaar zijn.
Inleiding
Het vasculaire endotheel bekleedt het binnenoppervlak van de bloedvaten. Het speelt een sleutelrol bij het reguleren van bloedstolling, vasculaire tonus en immuun-inflammatoire reacties 1,2,3,4. Hoewel de kweek van endotheelcellen (EC's) geïsoleerd uit menselijke specimens essentieel is voor onderzoeksdoeleinden, moet worden opgemerkt dat de EC's uit verschillende bloedvaten (slagaders, aderen, haarvaten) specifieke functies hebben. Deze kunnen niet volledig worden samengevat door humane navelstreng-endotheelcellen (HUVEC), die gemakkelijk v....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd en het protocol volgde de richtlijnen van de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de Universiteit van Chieti-Pescara (# 237_2018bis). Figuur 1 illustreert de isolatie van endotheelcellen uit segmenten (1-3 cm lang) van longparenchym of longslagader van niet-geïdentificeerde menselijke proefpersonen (met schriftelijke toestemming) die om verschillende redenen thoracale chirurgie ondergaan, zoals pneumothorax of lobectomie. In dit laatste geval verzamelden de chirurgen ook een longslagadersegment. Met name de chirurgen werden nauwkeurig geïnstrueerd om kankervrije monsters te verzamelen. Het gepresent....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
HLMEC isolatie
Het grootste probleem tijdens de isolatie van HLMVECs is de aanwezigheid van verontreinigende cellen, omdat de microscopische haarvaten niet gemakkelijk van het stromale weefsel kunnen worden gescheiden. Daarom is het bereiken van de hoogst mogelijke zuiverheid in de vroegste stadia van het isolatieproces cruciaal om de kweekpassages en dus de celveroudering te verminderen. Evenzo moet een optimaal isolatieprotocol de hoogst mogelijke opbrengst van zuivere HLMVEC's geven. Om deze doelen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De vele rollen die vasculaire endotheelcellen spelen in de menselijke pathofysiologie maken deze cellen een onmisbaar hulpmiddel voor in vitro pathogenetische en farmacologische studies. Aangezien EC's van verschillende vasculaire locaties / organen eigenaardige kenmerken en functies vertonen, zou de beschikbaarheid van gezonde en zieke EC's van het orgaan van belang ideaal zijn voor onderzoeksdoeleinden. HLMVECs zijn bijvoorbeeld essentieel voor studies naar longontsteking; Daarom zal een methodologie voor de h.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd zonder enige commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door fondsen van het Italiaanse ministerie van de Universiteit en Onderzoek (ex 60% 2021 en 2022) aan R. P. en door subsidies van de Italiaanse Cystic Fibrosis Foundation (FFC # 23/2014) en van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid (L548/93) aan M. R.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Gebruikt om cellen los te maken van de kweekplaten |
| Anti CD31 Antilichaam, clone WM59 | Dako | M0823 | Gebruikt voor CD-31 kleuring in immunocytochemie. Verdunning gebruikt: 1:50 |
| Anti vWF Antilichaam | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Gebruikt voor von Willebrand factor kleuring in immunocytochemie. Werkconcentratie: 1:100 |
| Autoclaveerbare chirurgische schaar | Elk | Gebruikt voor het hakken van specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Gebruikt tijdens de tweede filtratie |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Gebruik tijdens de eerste filtratie |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase gebruikt voor enzymatische vertering. Werkconcentratie: 2 mg/mL |
| Geconjugeerd anti CD31 Antilichaam | BD Biosciences | 555445 | Gebruikt voor celsortering (1:20 verdunning) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) met CaCl2 en MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Gebruikt voor celwassing voordat het medium wordt ververst |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) zonder CaCl2 en MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Gebruikt voor het wassen van chirurgische specimens en cellen voorafgaand aan trypsinisatie |
| Endotheelcel Groeimedium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC groeimedium |
| Fibronectine | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectine uit menselijk plasma gebruikt voor plaatcoating. Werkconcentratie: 50 µg/mL |
| Gelatine uit varkenshuid, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Gebruikt voor plaatcoating |
| Type A gelatine | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatine uit varkenshuid gebruikt voor plaatcoating. Werkconcentratie: 1,5% |
Referenties
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
