Open-source real-time closed-loop elektrische drempeltracking voor translationeel pijnonderzoek

Summary

APTrack is een softwareplug-in die is ontwikkeld voor het Open Ephys-platform en die real-time datavisualisatie en het closed-loop van elektrische drempeltracking van neuronale actiepotentialen mogelijk maakt. We hebben dit met succes gebruikt in microneurografie voor menselijke C-fiber nociceptoren en muis C-fiber en Aδ-fiber nociceptoren.

Abstract

Nociceptoren zijn een klasse van primaire afferente neuronen die potentieel schadelijke schadelijke schadelijke stimuli signaleren. Een toename van de prikkelbaarheid van nociceptor treedt op bij acute en chronische pijnaandoeningen. Dit veroorzaakt abnormale voortdurende activiteit of verlaagde activeringsdrempels tot schadelijke stimuli. Het identificeren van de oorzaak van deze verhoogde prikkelbaarheid is vereist voor de ontwikkeling en validatie van op mechanismen gebaseerde behandelingen. Het volgen van elektrische drempels met één neuron kan de prikkelbaarheid van nociceptoren kwantificeren. Daarom hebben we een applicatie ontwikkeld om dergelijke metingen mogelijk te maken en het gebruik ervan bij mensen en knaagdieren aan te tonen. APTrack biedt real-time datavisualisatie en actiepotentiaalidentificatie met behulp van een temporele rasterplot. Algoritmen detecteren actiepotentialen door drempeloverschrijding en bewaken hun latentie na elektrische stimulatie. De plug-in moduleert vervolgens de amplitude van de elektrische stimulatie met behulp van een up-down-methode om de elektrische drempel van de nociceptoren te schatten. De software is gebouwd op het Open Ephys-systeem (V0.54) en gecodeerd in C ++ met behulp van het JUCE-framework. Het draait op Windows-, Linux- en Mac-besturingssystemen. De open-source code is beschikbaar (https://github.com/ Microneurography/APTrack). De elektrofysiologische opnames werden genomen van nociceptoren in zowel een huid-zenuwpreparaat van muizen met behulp van de geplaagde vezelmethode in de sapheneuze zenuw als bij gezonde menselijke vrijwilligers met behulp van microneurografie in de oppervlakkige peroneuszenuw. Nociceptoren werden geclassificeerd op basis van hun reactie op thermische en mechanische stimuli, evenals door het monitoren van de activiteitsafhankelijke vertraging van de geleidingssnelheid. De software vergemakkelijkte het experiment door de identificatie van het actiepotentiaal te vereenvoudigen via de temporele rasterplot. We demonstreren real-time closed-loop elektrische drempel tracking van single-neuron actiepotentialen tijdens in vivo menselijke microneurografie, voor de eerste keer, en tijdens ex vivo muis elektrofysiologische opnames van C-vezels en Aδ-vezels. We stellen proof of principle vast door aan te tonen dat de elektrische drempel van een menselijke warmtegevoelige C-vezelnociceptor wordt verlaagd door het receptieve veld te verwarmen. Deze plug-in maakt het mogelijk om de elektrische drempel te volgen van actiepotentialen van één neuron en maakt het kwantificeren van veranderingen in de prikkelbaarheid van nociceptoren mogelijk.

Introduction

Nociceptoren zijn primaire afferente neuronen in het perifere zenuwstelsel die worden geactiveerd door openlijke of potentieel weefselbeschadigende gebeurtenissen en een cruciale beschermende rol spelen bij acute pijn¹. Elektrofysiologische opnames van C-fiber en Aδ-fiber nociceptoren in diermodellen, gezonde menselijke vrijwilligers en patiënten hebben sensibilisatie en abnormale spontane activiteit aangetoond in een breed scala van pijnaandoeningen 2,3,4,5,6,7. Het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan deze veranderingen in de prikkelbaarheid van nociceptoren bij patiënten kan gerichte therapeutische interventies mogelijk maken⁸. Er zijn echter weinig hulpmiddelen om de prikkelbaarheid van nociceptoren direct te beoordelen, met name bij patiënten⁹, maar het potentieel voor het nut van dergelijke hulpmiddelen wordt goed erkend^10,11.

Whole-nerve elektrische drempel tracking kan worden gebruikt om axonale prikkelbaarheid bij mensen te onderzoeken¹². Omdat grote, gemyeliniseerde, perifere neuronen echter onevenredig bijdragen aan de amplitude van het sensorische samengestelde actiepotentiaal, maakt het volgen van de elektrische drempel van de hele zenuw de beoordeling van de C-vezelfunctie^{niet mogelijk 11,13}. Inderdaad, in een eerdere studie toonde het volgen van de elektrische drempel van de hele zenuw in chronische neuropathische pijncohorten met diabetische neuropathie en door chemotherapie geïnduceerde polyneuropathie geen verschillen in axonale prikkelbaarheid¹¹.

In een eerdere studie werd elektrische drempeltracking op het niveau van één neuron gebruikt om de prikkelbaarheid van C-vezelnociceptoren te onderzoeken tijdens geplaagde vezelopnamen in een ex vivo huid-zenuwpreparaat van ratten¹⁴. De auteurs toonden aan dat een verhoogde kaliumconcentratie, zure omstandigheden en bradykinine allemaal de prikkelbaarheid van C-fiber nociceptor verhoogden, zoals weerspiegeld door een verlaagde elektrische drempel voor het genereren van actiepotentiaal. Bovendien verlaagde het verwarmen van het receptieve veld van de warmtegevoelige nociceptoren hun elektrische drempel, terwijl warmte-ongevoelige nociceptoren een toename van hun elektrische drempel^{vertoonden 14}. Dit levert belangrijk bewijs dat het volgen van elektrische drempels met één neuron mogelijk is en van nut kan zijn, maar er zijn momenteel geen software- en / of hardwareoplossingen beschikbaar om dergelijk onderzoek mogelijk te maken, met name voor menselijke studies.

Bij mensen is microneurografie de enige beschikbare methode om de elektrofysiologische eigenschappen van C-vezels direct te beoordelen¹⁵. Deze benadering is gebruikt om nociceptordisfunctie aan te tonen bij patiënten met chronische pijn 2,3,4,5,6,7. Microneurografie kan actiepotentialen van één neuron detecteren; vanwege de lage signaal-ruisverhoudingen gebruiken onderzoekers echter de markeringstechniek om C-vezelactiviteit¹⁶ te karakteriseren. In de markeertechniek wordt suprathreshold elektrische stimulatie toegepast op C-vezel receptieve velden in de huid. Deze elektrische stimulatie genereert een actiepotentiaal die optreedt bij een constante latentie, die wordt bepaald door de geleidingssnelheid van de C-vezel. C-vezels vertonen activiteitsafhankelijke vertraging, waarbij hun geleidingssnelheid afneemt en daarom hun geleidingslatentie toeneemt tijdens perioden van actiepotentiaalontlading¹⁷. Onder basale omstandigheden genereren C-vezels normaal gesproken geen actiepotentialen in afwezigheid van schadelijke stimuli, en daarom is hun geleidingslatentie als reactie op laagfrequente elektrische stimulatie constant. Mechanische, thermische of farmacologische stimuli, die vuren oproepen, induceren activiteitsafhankelijke vertraging, die de latentie van de actiepotentialen verhoogt die worden opgeroepen door gelijktijdige laagfrequente elektrische stimulatie. Dit maakt de objectieve identificatie mogelijk van reacties op de toegepaste niet-elektrische stimuli in de context van een lage signaal-ruisverhouding. Daarom kan activiteitsafhankelijke vertraging worden gebruikt om C-vezels¹⁶ functioneel te karakteriseren. Inderdaad, verschillende functionele klassen van C-vezels vertonen onderscheidende patronen van activiteitsafhankelijke vertraging in elektrische stimulatieparadigma's waarbij de stimulatiefrequentie wordt gevarieerd^18,19. Deze variabiliteit in de latentie van C-fiber actiepotentialen vormt een uitdaging voor algoritmen die zijn ontworpen om ze te monitoren.

Voortdurende activiteit in een nociceptor leidt tot verhoogde variabiliteit in de latentie tijdens laagfrequente elektrische stimulatie, en dit is opnieuw te wijten aan activiteitsafhankelijke vertraging. Deze verhoogde variabiliteit, of jitter, is een kwantificeerbare proxymaat voor prikkelbaarheid². Verdere oorzaken van variabiliteit in actiepotentiaallatentie zijn flip-flop, waarbij alternatieve terminale takken van een enkel neuron worden gestimuleerd, waardoor het opgeroepen actiepotentiaal twee (of meer) basislijnlatenties heeft die elkaar uitsluiten²⁰. Ten slotte veroorzaken veranderingen in de temperatuur van de terminale takken van een perifeer neuron ook actiepotentiaallatentieveranderingen op een thermodynamische manier, waarbij opwarming de geleidingssnelheid verhoogt en afkoeling de geleidingssnelheid vertraagt¹⁹. Dus elke software die closed-loop elektrische drempeltracking van nociceptieve C-vezels wil uitvoeren, moet rekening houden met veranderingen in latentie in elektrisch opgewekte actiepotentialen.

Om ons doel van cross-species elektrische drempeltracking van C-fiber nociceptoren te bereiken, hebben we APTrack ontwikkeld, een open-source softwareplug-in voor het Open Ephys-platform²¹, om real-time, closed-loop, elektrische drempeltracking en latentietracking mogelijk te maken. We leveren proof-of-concept gegevens die aantonen dat het volgen van de elektrische drempel van C-fiber nociceptor tijdens menselijke microneurografie mogelijk is. Bovendien laten we zien dat dit hulpmiddel kan worden gebruikt in knaagdier ex vivo geplaagde vezelelektrofysiologie, waardoor translationele studies tussen mensen en knaagdieren mogelijk worden. Hier zullen we in detail beschrijven hoe onderzoekers deze tool kunnen implementeren en gebruiken om hun studie van de nociceptorfunctie en prikkelbaarheid te ondersteunen.

Protocol

De menselijke microneurografie-experimenten werden goedgekeurd door de Faculty of Life Sciences Research Ethics Committee van de Universiteit van Bristol (referentienummer: 51882). Alle deelnemers aan het onderzoek gaven schriftelijke geïnformeerde toestemming. De dierproeven werden uitgevoerd aan de Universiteit van Bristol in overeenstemming met de UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 na goedkeuring door de University of Bristol Animal Welfare and ethical review board en werden gedekt door een projectlicentie.

1. De Open Ephys GUI en APTrack installeren

1. Raadpleeg de softwaredocumentatie om de meest recente versie van de grafische gebruikersinterface (GUI) van Open Ephys te vinden die wordt ondersteund (https://github.com/Microneurography/APTrack#readme) en download en installeer vervolgens de GUI.
2. Installeer een compatibele versie van de GUI vanaf de volgende URL: https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases.
3. Download de nieuwste versie van GitHub: https://github.com/Microneurography/APTrack/releases. Voor een Windows-computer kopieert u het .dll-bestand naar de map plug-ins, die meestal te vinden is op C:\Program Files\Open Ephys\plugins. Voor een MacOS-computer kopieert u het .bundle-bestand naar de map Contents/PlugIns van het pakket.

2. Montage van het opname- en stimuleringsapparaat

1. Sluit het acquisitiebord aan op de computer met behulp van de door de fabrikant meegeleverde kabel en schakel deze in.
   OPMERKING: Voor menselijke microneurografie werd een USB 3.0-isolator gebruikt om de deelnemer elektrisch te isoleren van de computer, en het acquisitiebord werd gevoed door een draagbare batterij in tegenstelling tot de netspanningsvoeding die werd gebruikt voor knaagdierstudies. Alle USB-aansluitingen, met uitzondering van de besturingskaart van de stappenmotor, werden tijdens de menselijke studies door de USB-isolator geleid.
2. Sluit het I/O-bord aan op de analoge in-poort op het acquisitiebord. Sluit een Intan RHD-opnameheadstage aan op het acquisitiebord met behulp van een SPI-kabel (Serial-peripheral Interface).
   OPMERKING: De Intan 16-kanaals bipolaire headstage werd hier gebruikt, maar andere monopolaire RHD2000-serie headstages kunnen worden gebruikt.
3. Sluit de PulsePal aan op de computer²². Voor montage met een analoge spanningsgestuurde stimulator (bijv. een DS4) met behulp van een PulsePal, zoals bij de muizen geplaagde vezelopnamen, volgt u de stappen 2.5.1-2.5.3; voor montage met een op roterende encoder gebaseerde stimulator (bijv. een DS7) met behulp van een stappenmotor, zoals bij de menselijke microneurografie-opnames, volgt u de stappen 2.6.1-2.6.8 (figuur 1).
4. Bouw de signaalketen in de GUI zoals hieronder beschreven.
   1. Plaats de Rhythm FPGA-plug-in in de signaalketen door met de linkermuisknop te klikken en deze naar de signaalketen te slepen; dit verbindt de GUI met het acquisitiebord. Zorg ervoor dat op de ADC-knop is geklikt om de opname van de ADC-kanalen vanaf het I/O-bord te starten. De ADC-knop licht oranje op wanneer deze is ingeschakeld.
      OPMERKING: Als u eerder opgenomen experimentele gegevens wilt afspelen, kunt u de plug-in Bestandslezer aan het begin gebruiken in plaats van Rhythm FPGA. Door dit in combinatie met APTrack te gebruiken, kunnen de actiepotentialen in eerdere experimenten worden gevisualiseerd en latentie worden gevolgd.
   2. Plaats een bandpass-filter in de signaalketen; de standaardinstellingen van 300-6.000 Hz zijn geschikt voor zowel menselijke als muisopnamen. Plaats er bovendien een splitter achter.
   3. Plaats de APTrack-plug-in in de signaalketen aan de ene kant van de splitter en LFP Viewer aan de andere kant. LFP Viewer biedt een traditionele oscilloscoop-achtige spanningsspoorweergave, die nuttig is tijdens experimenten.
   4. Plaats een recordknooppunt na de plug-in. Wijzig in het vervolgkeuzemenu de indeling voor het opslaan van gegevens van binair naar Open Ephys. Hiermee wordt een eenvoudige signaalketen voltooid die goed werkt (figuur 2); Er kunnen echter extra componenten worden toegevoegd zoals bepaald door experimentele vereisten.
      OPMERKING: Als het recordknooppunt vóór de plug-in in de signaalketen wordt geplaatst, wordt de actiepotentiële trackinginformatie niet opgeslagen.
   5. Klik rechtsboven in de GUI op de afspeelknop om te beginnen met het verzenden van gegevens van het acquisitiebord en deze te visualiseren. Om te beginnen met opnemen, klikt u op de ronde opnameknop naast de afspeelknop.
      OPMERKING: Het is gemakkelijk om te vergeten om op record te klikken; We registreren gegevens vanaf het moment dat we beginnen met het verkrijgen om dit te voorkomen.
5. Voor montage met een analoge spanningsgestuurde stimulator volgt u de onderstaande stappen.
   1. Schakel een constante stroomstimulator in waarvan de stimulatieamplitude wordt geregeld door een analoge spanningsingang. In dit geval werd een DS4 gebruikt (figuur 1).
   2. Het PulsePal-uitgangskanaal 1 is voor het analoge spanningscommando. Splits dit signaal met behulp van een BNC T-splitter en sluit het vervolgens aan op de ingang van de constante stroomstimulator en het I/O-bord, zodat de opdrachtspanning wordt geregistreerd.
   3. Het PulsePal-uitgangskanaal 2 is voor de TTL-gebeurtenismarker voor elektrische stimulatie. Sluit dit aan op het I/O-bord zodat de TTL-gebeurtenismarkeringen voor stimulatie worden vastgelegd voor de plug-in om te gebruiken en voor de post-hocanalyse.
6. Voor montage met een analoge spanningsgestuurde stimulator volgt u de onderstaande stappen.
   1. Schakel een constante stroomstimulator in waarvan de stimulatieamplitude wordt geregeld door een draaiknop. In dit geval werd een DS7 gebruikt (figuur 1).
   2. Sluit de besturingskaart van de stappenmotor aan op de stappenmotor met behulp van de door de fabrikant meegeleverde kabel en magnetische houder.
   3. Sluit de besturingskaart rechtstreeks aan op de computer met behulp van een standaard USB A-naar-USB micro-B-kabel. Sluit de besturingskaart niet aan aan de deelnemerszijde van de USB-isolator, omdat deze ook is aangesloten op een 12 V-netvoeding.
   4. Als het de eerste keer is dat u de besturingskaart gebruikt, uploadt u het script van de stappenmotor van GitHub naar de besturingskaart; Dit hoeft slechts één keer te worden gedaan, of als er software-updates voor het stappenmotorscript worden vrijgegeven.
   5. Stel de stimulatieamplitudeknop op de constante stroomstimulator in op 0 mA. Gebruik een aangepaste montagebeugel om de stappenmotor en de stimulatieamplitudeknop te koppelen. Deze kunnen 3D-geprint worden, wat goedkope, snelle en aanpasbare montageoplossingen mogelijk maakt. Raadpleeg GitHub om te zien of er al een houder is ontworpen voor de stimulator van keuze.
   6. Gebruik een aangepaste loopadapter om de loop van de stappenmotor aan te sluiten op de bedieningsknop voor de stimulatieamplitude. Deze adapters moeten om redenen van sterkte en duurzaamheid van metaal zijn gemaakt; 3D-geprinte onderdelen zouden echter ook geschikt zijn, hoewel ze mogelijk regelmatig moeten worden vervangen. Raadpleeg GitHub om te zien of er al een vatadapter is ontworpen voor de stimulator van keuze.
   7. Bevestig het besturingsbord/stappenmotorapparaat losjes aan de stimulatorbedieningsknop met behulp van een aangepaste houder en loopadapter.
      OPMERKING: De houder en de loopadapter worden later aangedraaid zodra de software is gestart en de stappenmotor automatisch op nul wordt gezet.
   8. Sluit de PulsePal aan zoals beschreven in protocolstappen 2.5.2-2.5.3 (minus het aansluiten van uitgangskanaal 1 op een stimulator), omdat het genereren van TTL-gebeurtenismarkeringen nog steeds vereist is voor analyse en om de plug-in te laten functioneren. Sluit bovendien uitgangskanaal 2 aan op de DS7-stimulator om deze te activeren.
7. Bereid het huid-zenuwpreparaat van de muis voor zoals hieronder beschreven.
   1. Voorzie C57BL/6J muizen (Charles River Laboratories, UK, in deze studie) van 2-4 maanden oud en van beide geslachten ad libitum van voedsel en water.
   2. Na ruiming door anesthetische overdosis door middel van een intraperitoneale injectie van natriumpentobarbital (≥200 mg / kg) en het bevestigen van de stopzetting van de bloedsomloop, ontleedt u de huid van het dorsale aspect van de achterpoot van de muis en de sapheneuze zenuw, die dit gebied innerveert, met behulp van de methoden beschreven door Zimmermann et ^al.23.
   3. Houd het huid-zenuwpreparaat in gecarbodaneerde synthetische interstitiële vloeistof (tabel 1) op 30-32 °C in de helft van een op maat gemaakt acrylbad met twee kamers (15 ml / min perfusiesnelheid, 30 ml volume). Rijg de zenuw door een klein gaatje in de met minerale olie gevulde kamer en sluit af met vaseline. De olie zorgt voor een geïsoleerde opnameomgeving.
   4. Plaag twee fijne filamenten uit de romp van de zenuw met behulp van een superfijne tang en hang er een aan elke kant van een bipolaire zilver / zilverchloride-opname-elektrode.
   5. Digitaliseer en versterk het neurale signaal met behulp van een RHD2216 16-kanaals bipolaire headstage en verwerk het met behulp van het acquisitiebord. Sample het signaal op 30 kHz, met een bandpass filter van 300-6.000 Hz, en visualiseer het met behulp van de GUI.
   6. Gebruik een stompe glazen staaf om de huid van het preparaat te strelen. Gebruik de massaactiviteit met lage amplitude om te bevestigen dat het preparaat leeft.
8. Voer menselijke C-fiber microneurografie uit zoals hieronder beschreven.
   1. Voer microneurografie uit met deelnemers die schriftelijke geïnformeerde toestemming hebben gegeven, zoals eerder beschreven²⁴.
   2. Terwijl de deelnemer comfortabel achterover leunt op een bed en wordt ondersteund met kussens, identificeert u de oppervlakkige peroneuszenuw met behulp van een ultrasone scanner en markeert u een doelgebied van ongeveer 5-10 cm proximaal ten opzichte van de laterale malleolus, rond het middenscheenbeenniveau.
   3. Steriliseer de huid rond het doelgebied met behulp van een 2% chloorhexidine in 70% alcoholdoekje en plaats een steriele referentie-elektrode subcutaan in de buurt van de beoogde opnameplaats op het middelste scheenbeenniveau.
   4. Plaats een steriele opname-elektrode in de oppervlakkige peroneuszenuw onder echografische begeleiding binnen het doelgebied.
   5. Digitaliseer en versterk het neurale signaal met behulp van een RHD2216 16-kanaals bipolaire headstage en verwerk het met behulp van het acquisitiebord. Sample het signaal op 30 kHz, met een bandpass filter van 300-6.000 Hz, en visualiseer het met behulp van de GUI.
      OPMERKING: De acquisitieapparatuur werd elektrisch geïsoleerd van de laptop door een USB 3.0-isolator met 5 kV RMS-isolatie en gevoed via een op maat gemaakte 12 V-batterijvoeding.
   6. Bevestig succesvolle intraneurale positionering door de huid zachtjes te strelen om mechanisch opgewekte massaactiviteit te onthullen. Bovendien melden deelnemers meestal paresthesie in het dorsolaterale aspect van de voet bij succesvolle intraneurale positionering.

3. Software-instelling en identificatie en fenotypering van perifere neuronen

1. Stel de software in zoals hieronder beschreven.
   1. Open de GUI (afbeelding 3). Als de besturingskaart van de stappenmotor op uw pc is aangesloten, wordt deze gedetecteerd en ingesteld op positie nul. Draai de aangepaste houder en loopadapter vast die worden beschreven in stap 2.6.5-2.6.7, omdat de stimulatieamplitudeknop en de stappenmotor beide op nul zijn ingesteld.
      OPMERKING: Als de stappenmotor en de stimulatieamplitudeknop niet beide "op nul" staan, kan dit ertoe leiden dat de stappenmotor probeert de bedieningsknop buiten zijn bereik te draaien, wat schade kan veroorzaken.
   2. Selecteer in het optiemenu het triggerkanaal. Kies het ADC-kanaal met de TTL-marker voor elektrische stimulatie uit het PulsePal-uitgangskanaal 2.
   3. Selecteer in het optiemenu het gegevenskanaal en kies het kanaal met de elektrofysiologische gegevens.
   4. Definieer in het bedieningspaneel voor stimulatie de initiële, minimale en maximale stimulatieamplitudes met behulp van de schuifregelaar. Zorg ervoor dat de huidige stimulatie boven 0 is ingesteld, zodat TTL-markers worden gegenereerd.
      OPMERKING: Sommige stimulatoren hebben een input-to-output schaalverhouding die niet 1:1 is; Houd hier rekening mee bij het selecteren van een geschikte stimulatieamplitude. Op sommige stimulatiesystemen kan bijvoorbeeld een uitgangsverhouding van 1:10 worden geselecteerd om een hogere output van de constante stroomstimulator te bereiken.
   5. Klik in het stimulatiecontrolepaneel op F om een bestand met de stimulatie-instructies te laden. Elektrische stimulatieprotocollen worden opgeslagen als CSV-bestanden (comma-separated value) die zijn samengesteld uit de gewenste stimulatiefrequenties en -duur, waardoor gebruikers complexe stimulatieparadigma's voor hun experimenten kunnen maken. Een voorbeeldsjabloon is hier beschikbaar: https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
   6. Klik in het configuratiescherm voor stimulatie op > om het geladen stimulatieparadigma te starten. Standaard vraagt APTrack de PulsePal om positieve blokgolfpulsen met een duur van 0,5 ms van verschillende amplitudes te genereren om de stimulatieamplitude van de constante stroomstimulator te regelen.
   7. De temporele rasterplot begint te updaten met de reactie op elektrische stimulatie, waarbij elke nieuwe stimulatierespons wordt weergegeven als een nieuwe kolom aan de rechterkant.
2. Visualiseer en identificeer actiepotentialen van één neuron.
   1. Voor de succesvolle detectie van single-neuron actiepotentialen is het belangrijk om geschikte beelddrempels in te stellen. Pas in het deelvenster tijdelijke rasterplot de waarden laag, detectie en hoge afbeeldingsdrempelwaarden aan.
      1. Selecteer een kleurenschema in het optiemenu. In de WHOT-modus (White Hot) (standaard) worden spanningen onder de lage beelddrempel in zwart gecodeerd. Spanningen tussen de lage beeld- en detectiedrempels worden gecodeerd in grijswaarden. Spanningen boven de detectiedrempel worden groen gecodeerd en spanningen boven de hoge beelddrempel worden rood gecodeerd.
   2. Perifere neuronen vertonen constante latentieresponsen bij lage stimulatiefrequenties (<0,25 Hz) en deze reacties worden bepaald door hun geleidingssnelheid en de afstand tussen de stimulatie- en opnameplaatsen. Als er geschikte beelddrempels zijn ingesteld, worden de drempelovergangen die door de algoritmen worden gedetecteerd, groen gecodeerd (figuur 4).
   3. Beweeg de stimulerende elektrode systematisch rond het huidgebied dat wordt geïnnerveerd door de zenuw die wordt geregistreerd, waardoor minimaal drie stimulatiegebeurtenissen op elke plaats mogelijk zijn. Controleer de temporele rasterplot op drempelovergangsgebeurtenissen (groen gemarkeerd) die op hetzelfde tijdstip na elke elektrische stimulatiegebeurtenis plaatsvinden.
      OPMERKING: Bij muizen werd een zoekprikkel van 5 mA gebruikt. Bij mensen werd de amplitude van de transcutane elektrische zoekprikkel getitreerd tot een verbale pijnbeoordeling zodanig dat deze nooit hoger was dan 7/10.
   4. Controleer op drie drempelovergangsgebeurtenissen (groene balken) die in een rij worden weergegeven met dezelfde latentie en in dezelfde stimulatiepositie; Dit duidt op de identificatie van een perifeer neuron actiepotentiaal.
   5. Optimaliseer de positie van de stimulerende elektrode door het meest elektrisch gevoelige punt van het receptieve veld van het doelneuron te identificeren en vervolgens de elektrode op zijn plaats te fixeren. Op dit punt in de menselijke microneurografie, schakel over op het gebruik van intradermale elektroacupunctuurnaalden (0,2 mm diameter) voor bipolaire elektrische stimulatie, bij muizen wordt een aangepaste transcutane stimulerende sonde gebruikt, zodat de stimulatiepositie constant is.
3. Voer classificatie en sensorische fenotypering van de perifere neuronen uit.
   1. Schat de elektrische drempel van de doelactiepotentiaal door de simulatieamplitude handmatig aan te passen of door indien gewenst APTrack te gebruiken (beschreven in stap 4.1-4.2).
   2. Stimuleer het receptieve veld bij 2x de geschatte elektrische drempel bij een frequentie van 0,25 Hz gedurende het sensorische fenotyperingsprotocol.
   3. Bereken de geleidingssnelheid van het neuron door de geleidingsafstand te delen door de geleidingslatentie. C-vezels zijn te herkennen aan een geleidingssnelheid van ≤2 m/s.
   4. Stimuleer mechanisch het receptieve veld met behulp van von Frey-filamenten om de mechanische drempel voor activering te bepalen. Mechanosensatie kan worden geïdentificeerd door opgeroepen actiepotentialen die zichtbaar zijn op het spanningsspoor en een toename van de latentie van het neuron, als het een C-vezel is, bij voldoende kracht.
   5. Verwarm het receptieve veld van het neuron, let opnieuw op actiepotentialen die zichtbaar zijn op het spanningsspoor en een toename van de latentie van het neuron, als het een C-vezel is, bij voldoende warmtetoepassing. Warmte-ongevoelige neuronen zullen een afname van de latentie vertonen als gevolg van het thermodynamische effect op axonale voortplanting.
      OPMERKING: Gebruik bij menselijke microneurografie een TSC-II voor snelle en nauwkeurige thermische controle. Voeg bij de muisbereiding verwarmde of gekoelde synthetische interstitiële vloeistof toe aan een aluminium isolatiekamer die over het receptieve veld is geplaatst om toegang tot de neuronterminals mogelijk te maken en tegelijkertijd de snelle warmteafvoer naar de omringende vloeistof te beperken. Noteer de temperatuur met behulp van een thermokoppel.
   6. Koel het receptieve veld, let opnieuw op actiepotentialen die zichtbaar zijn op het spanningsspoor en een duidelijke toename van de latentie van het neuron, als het een C-vezel is, bij voldoende koude toepassing. Alle neuronen zullen een toename van de latentie vertonen als gevolg van het thermodynamische effect op axonale voortplanting, dus wees voorzichtig bij het labelen van neuronen als koudegevoelig op basis van een latentietoename alleen.

4. Latentie en elektrische drempel volgen

1. Voer latentietracking uit zoals hieronder beschreven.
   1. Na de identificatie van actiepotentiaal(en) van één neuron op de temporele rasterplot, verplaatst u de grijze lineaire schuifregelaar aan de rechterkant van de temporele rasterplot om de positie van het zoekvak aan te passen.
   2. Stel onder de tijdelijke rasterplot de draaischuifregelaar voor de breedte van het zoekvak in op een geschikte breedte. Maak de breedte van het zoekvak smal om de kans te verkleinen dat tijdelijke ruispieken, spontaan afvurende actiepotentialen of andere actiepotentialen met constante latentie in de buurt ten onrechte worden geïdentificeerd als het actiepotentieel van belang.
   3. Om te beginnen met het bijhouden van het beoogde actiepotentieel, klikt u op de + onder de trackingtabel met meerdere eenheden. Er wordt een nieuwe rij aan de tabel toegevoegd met details over het doelactiepotentieel, waaronder de latentielocatie, het percentage dat over 2-10 stimuli wordt afgevuurd (aangepast in het optiemenu) en de gedetecteerde piekamplitude.
   4. Zodra een actiepotentiaal is toegevoegd aan de trackingtabel met meerdere eenheden, wordt het algoritme voor het volgen van latentie (figuur 5) er automatisch op uitgevoerd bij elke volgende elektrische stimulatie.
   5. Als er meerdere afzonderlijke actiepotentialen zichtbaar zijn in de temporele rasterplot, voegt u deze toe aan de trackingtabel met meerdere eenheden zoals hierboven beschreven. Het theoretische maximale aantal actiepotentialen dat aan de tabel kan worden toegevoegd voor het bijhouden van gelijktijdige latentie is de maximale gehele waarde van 32 bits.
   6. Schakel het selectievakje Spike bijhouden in de trackingtabel met meerdere eenheden in om het zoekvak naar de juiste positie voor die specifieke actiepotentiaal te verplaatsen, zoals bepaald door het algoritme voor het bijhouden van latentie. Dit maakt het mogelijk om de latentietracking in realtime te bewaken en ervoor te zorgen dat de tracking het actiepotentieel volgt zoals verwacht. Het bijhouden van de latentie van andere pieken gaat gewoon door op de achtergrond.
   7. Verwijder bijgehouden actiepotentialen uit de trackingtabel met meerdere eenheden met de verwijderknop aan het einde van elke rij.
2. Voer elektrische drempeltracking uit zoals hieronder beschreven.
   1. Pas de toename- en afnamesnelheden in het stimulatiebedieningspaneel aan tussen 0,1 V en 0,5 V. Houd deze waarden gelijk en pas ze tijdens het experiment niet aan, tenzij dit deel uitmaakt van het experimentele paradigma.
   2. Zorg ervoor dat de stimulatiefrequentie is ingesteld op een geschikte snelheid, meestal 0,25-0,5 Hz, tenzij modulatie van de stimulatiefrequentie deel uitmaakt van het experimentele paradigma. Het verhogen van de vuursnelheid van de nociceptor kan de elektrische drempel van de nociceptor veranderen.
   3. Zodra een actiepotentiaal met succes wordt bijgehouden, vinkt u het selectievakje Spoordrempel aan in de trackingtabel met meerdere eenheden, waarmee het algoritme voor het volgen van elektrische drempels wordt gestart (afbeelding 6).
      OPMERKING: Het volgen van elektrische drempels wordt alleen uitgevoerd op het beoogde actiepotentiaal; Inderdaad, de afvuursnelheden van andere actiepotentialen in de trackingtabel met meerdere eenheden zullen dienovereenkomstig worden bijgewerkt naarmate de stimulatieamplitude verandert.
   4. Pas de stimulatieamplitude handmatig aan de schatting van de elektrische drempel aan; Dit vermindert de wachttijd om de elektrische drempel te bepalen. De tijd die nodig is om een betrouwbare elektrische drempel vast te stellen, is afhankelijk van de stimulatiefrequentie, de toename- en afnamesnelheden en het verschil in stimulatieamplitude van de initiële stimulatie tot de elektrische drempel van het neuron.
   5. De software maakt gebruik van een up-down methode voor de schatting van de elektrische drempel van de neuronen. In de trackingtabel met meerdere eenheden wordt de vuursnelheid bepaald over 2-10 eerdere stimulaties (geselecteerd in het optiemenu). Selecteer het aantal stimulatiegebeurtenissen dat moet worden overwogen; Een hoger aantal verhoogt de betrouwbaarheid van de drempelschatting, maar zal langer duren om te bereiken.
   6. Tijdens menselijke microneurografie is het belangrijk om de pijn van elektrische stimuli te controleren om overmatig ongemak van de deelnemer te voorkomen; enig ongemak is onvermijdelijk tijdens de studie van nociceptoren, met name van stille / slapende C-vezels. Vraag regelmatig om pijnbeoordelingen terwijl de stimulatieamplitude toeneemt tijdens het volgen van de elektrische drempel en blijf in de buurt van de constante stroomstimulator om deze op verzoek van de deelnemer uit te schakelen.
      OPMERKING: Als alternatief kan de elektrische stimulatie worden ontkoppeld via de gebruikersinterface door op de knop [ ] in het bedieningspaneel voor stimulatie te klikken.
   7. Een stooksnelheid van 50% geeft aan dat de geschatte elektrische drempel is bepaald.
   8. Pas tijdens het volgen van de elektrische drempel een experimentele manipulatie toe op het receptieve veld, zoals temperatuur- of medicijnmanipulaties. De effecten van deze manipulaties op de elektrische drempel van de nociceptor zullen worden gevolgd.
      OPMERKING: Geef voldoende tijd om een nieuwe nociceptordrempel te identificeren na de experimentele manipulatie.

Results

Een representatief voorbeeld van de software die werkt om een experiment te besturen, is weergegeven in figuur 7. Het past iteratief de stimulatieamplitude aan met behulp van een up-down methode om effectief de elektrische drempel van enkele nociceptoren te vinden. Voor het eerst tonen we de haalbaarheid aan van real-time single-neuron elektrische drempel tracking bij mensen tijdens microneurografie (figuur 7A). Daarnaast tonen we elektrische drempeltracking in een Aδ-vezel van een muis (figuur 7B). De identificatie van actiepotentialen door drempelovergang, zoals hier gebruikt, is voldoende om elektrische drempels in de loop van de tijd te volgen. We raden gebruikers aan stappen te ondernemen om elektrische ruis tijdens hun opnames te minimaliseren, bijvoorbeeld door een kooi van Faraday en bandpass-filters te gebruiken om de signaal-ruisverhouding te verbeteren.

Om aan te tonen dat het volgen van elektrische drempels kan worden gebruikt als een maat voor veranderingen in de prikkelbaarheid van nociceptoren bij mensen, werd het volgen van de elektrische drempel tijdens een getrapt verwarmingsparadigma uitgevoerd (figuur 8). Het verhogen van de temperatuur van de nociceptoraansluitingen verminderde de elektrische stimulatiestroom die nodig is om een actiepotentiaal op te wekken, wat een toename van de prikkelbaarheid van de nociceptor weerspiegelt (figuur 8C). Dit werd waarschijnlijk veroorzaakt door het genereren van receptorpotentialen door de warmtegevoelige ionkanalen uitgedrukt in de C-vezel nociceptor¹⁴. Bij de hoogste temperatuurstap, 44 °C, werden thermisch opgewekte actiepotentialen opgewekt (figuur 8A, stimulusnummer 86-96). Dit veroorzaakt een toename van de elektrische drempel omdat de nociceptor zich in een vuurvaste toestand kan bevinden na hoogfrequente ontlading. Zoals verwacht nam de latentie van het gevolgde actiepotentiaal af naarmate de temperatuur steeg. Men denkt dat dit gebeurt als gevolg van een thermodynamisch effect op de geleidingsmachines, waardoor de geleidingssnelheid van de C-vezel toeneemt. Deze C-vezel kan ook flip-flop vertonen (figuur 8B, stimulusnummer 47-54), wat ertoe kan leiden dat de volgende elektrische stimulatie ten onrechte in amplitude wordt verhoogd als het actiepotentiaal buiten het zoekvenster van het algoritme valt.

Figuur 1: Een schema van de apparatuuropstelling en kabelverbindingen die nodig zijn voor het volgen van de elektrische drempel van nociceptor met APTrack bij knaagdieren en mensen. Let op de twee verschillende methoden voor stimulatieamplituderegelingen: een stappenmotor voor handmatig aangepaste stimulatoren in onze menselijke opstelling en een PulsePal voor ingangsspanningsgestuurde stimulatoren in onze knaagdieropstelling. (1) Een pc (Windows, Mac of Linux) waarop de plug-in voor het Open Ephys-platform wordt uitgevoerd. (2) Een stappenmotor die de stimulatieamplitudeknop op de DS7 bedient. (3) Een constante stroomstimulator die is goedgekeurd voor gebruik bij de mens; hier gebruikten we een DS7. (4) Een USB 3.0-optoisolator, die de menselijke deelnemer isoleert van de pc (optioneel, alleen vereist voor menselijk onderzoek). (5) Een PulsePal V2 Pulse Generator, die TTL-tijdstempels (uitgangskanaal 2) en spanningsstappen genereert die overeenkomen met de gevraagde stimulatieamplitude (uitgangskanaal 1). (6) Een constante stroomstimulator voor gebruik bij dieren; hier gebruikten we een DS4. (7) Een DC-voeding voor het systeem (gelijkstroomvoeding die wordt gebruikt voor de knaagdieropstelling en batterij-DC-voeding die wordt gebruikt voor de menselijke installatie). (8) Een overnamebord. (9) Een I/O-kaart voor het aansluiten van de BNC-coaxkabels die de op te nemen signalen dragen, zoals de thermokoppeluitgangen en TTL-markers. (10) Het huid-zenuwpreparaat van muizen ondergaat elektrofysiologische opnamen van nociceptor. (11) Een menselijke deelnemer die microneurografie-opname ondergaat van C-vezels in de oppervlakkige peroneuszenuw. (12) Een Intan RHD2216 headstage voor de acquisitie en digitalisering van de opnames. (13) Een Intan Electrode Adapter Board, waarop de opname-elektroden zijn aangesloten en waarmee het signaal kan worden doorgegeven aan de RHD2216 headstage. (14) Een thermisch stimulatiesysteem dat de temperatuur kan uitvoeren via een BNC-coaxverbinding. (15) Een 3,3 V knop/voetpedaal op batterijen dat wordt gebruikt voor het markeren van mechanische stimulatiegebeurtenissen en medicijntoepassingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Template signaalketen. De rode pijl wijst naar de knop voor het inschakelen van de ADC-ingang van het I/O-bord. De gele pijl geeft het vervolgkeuzemenu aan voor het selecteren van de Open Ephys-bestandsindeling. De groene pijl geeft de knoppen Afspelen en Opnemen aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Grafische gebruikersinterface. De GUI bestaat uit vier hoofdcomponenten. (1) Tijdelijk rasterplotpaneel (groen) voor gegevensvisualisatie en de instellingen die zijn gekoppeld aan het besturen van de plot. Een constante latentierespons die geleidelijke activiteitsafhankelijke vertraging laat zien, wordt aangegeven door de groene pijl. (2) Stimulatie Controlepaneel (geel) voor het instellen van de stimulatieamplitudeparameters en het laden van de stimulatieparadigmascripts. (3) Multi-Unit Tracking Table (blauw) voor het toevoegen van de actiepotentialen voor het volgen en activeren van de latentie en elektrische drempeltracking. (4) Optiemenu voor het selecteren van de kleurstijlen en het invoerkanaal voor de gegevens- en TTL-triggers. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Facilitering van de identificatie van actiepotentialen met constante latentie door middel van real-time datavisualisatie op een temporele rasterplot met behulp van APTrack. Dit is een voorbeeld van een hoge signaal-ruisverhouding. De gegevens in de temporele rasterplot zijn afkomstig van een menselijke C-vezelopname van de oppervlakkige peroneuszenuw tijdens microneurografie. Voltage Trace is de oscilloscoop-achtige LFP Viewer plugin binnen Open Ephys. De APTrack User Interface is de grafische gebruikersinterface van de plugin. De bijgehouden actiepotentiaal wordt aangegeven met groene pijlen en de cirkelvormige schuifregelaar op de rand van de temporele rasterplot is voor het regelen van de positie van het zoekvak waar de algoritmen zoeken naar drempelovergangsgebeurtenissen. Het elektrische stimulatieartefact is blauw gemarkeerd op het spanningsspoor. De stimulatieamplitude van het analoge spanningscommando wordt in rood aangegeven; Merk op dat dit mogelijk niet hetzelfde is als de amplitude van de stimulatiestroom, afhankelijk van de schaalfactor die op de stimulator is ingesteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Grafische weergave van het algoritme voor het bijhouden van latentie. In eenvoudige bewoordingen, als een actiepotentiaal wordt gedetecteerd door drempeloverschrijding, zal het zoekvak zijn positie aanpassen om zichzelf te centreren op het moment van de piekspanning. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Grafische weergave van het algoritme voor het volgen van elektrische drempels. In eenvoudige bewoordingen, als een actiepotentiaal wordt gedetecteerd door drempeloverschrijding, zal de stimulatieamplitude worden verminderd met de afnamesnelheid. Als er geen actiepotentiaal wordt gedetecteerd, wordt de stimulatieamplitude verhoogd met de incrementele snelheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Geautomatiseerde elektrische drempeltracking van actiepotentialen van één neuron bij een stimulatiefrequentie van 0,25 Hz . (A) Sequentiële sporen van een menselijke C-vezel van de oppervlakkige peroneuszenuw tijdens een microneurografie-experiment. (B) Opeenvolgende sporen van een muis Aδ-vezel van de sapheneuze zenuw tijdens huid-zenuwvoorbereiding geplaagde vezelelektrofysiologie. De sporen waren rood gekleurd wanneer een actiepotentiaal werd geïdentificeerd, wat resulteerde in een afname van de stimulusamplitude. Het softwarealgoritme vindt effectief de stimulusamplitude die nodig is voor een kans van 50% om te vuren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Elektrische drempel volgen bij een 0,25 Hz stimulatiefrequentie tijdens de thermische stimulatie van een menselijke C-fiber nociceptor. De y-as codeert vanaf het begin van het paradigma voor het stimulatiegetal. (A) Spanningsspoor gedurende 4.000 ms na elektrische stimulatie, met drempelovergangsgebeurtenissen gemarkeerd in rood. (B) Spanningsspoor van A ingezoomd rond de bijgehouden actiepotentiaal. De sporen waren rood gekleurd toen de gevolgde actiepotentiaal werd gedetecteerd. De verticale blauwe lijn is de basislijnlatentie van de bijgehouden eenheid. (C) Stimulatiestroom onder bevel van APTrack. De verticale blauwe lijn is de elektrische drempel van de basislijn. (D) Receptief veld TCS-II thermische stimulerende sondetemperatuur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Verbinding	Concentratie
NaCl	107,8 mM
NaHCO3	26,2 mM
Kcl	3,5 mM
NaH2PO4	1,67 mM
CaCl2	1,53 mM
Mgso4	0,69 mM
Natriumgluconaat	9,64 mM
Sacharose	7,6 mM
Glucose	5,55 mM

Tabel 1: Inhoud van de synthetische interstitiële vloeistof voor het huid-zenuwpreparaat van de muis²³.

Discussion

APTrack is een software plugin voor gebruik met het Open Ephys platform. We hebben voor dit platform gekozen omdat het open-source, flexibel en goedkoop te implementeren is. Exclusief de kosten van de constante stroomstimulator, kan alle apparatuur die nodig is om de plug-in te gaan gebruiken op het moment van schrijven worden gekocht voor ongeveer $ 5.000 USD. We hopen dat dit onderzoekers in staat zal stellen om APTrack gemakkelijker te implementeren in hun perifere zenuwelektrofysiologische studies. Bovendien kunnen onderzoekers de software vrijelijk aanpassen aan hun experimentele behoeften. Belangrijk is dat deze tool voor het eerst de elektrische drempeltracking van enkele C-vezelnociceptoren bij mensen mogelijk heeft gemaakt.

Hoe hoger de signaal-ruisverhouding, hoe beter de algoritmes actiepotentialen kunnen identificeren. De signaal-ruisverhouding tijdens microneurografie was voldoende in de meeste van onze opnames, maar gebruikers moeten alert zijn op het risico van signaaldegradatie in de loop van de tijd. Dit is vooral belangrijk voor langere experimentele protocollen, omdat als de amplitude van de gevolgde actiepotentiaal onder de detectiedrempel daalt, de stimulatieamplitude ten onrechte wordt verhoogd; Dit kan worden verzacht door experimentatoren die de plug-in controleren en vervolgens de instellingen indien nodig aanpassen. De signaal-ruisverhouding is verbeterd met bandpass-filtering, maar grotere transiënten kunnen nog steeds verkeerd worden geïdentificeerd als actiepotentialen als ze aankomen tijdens het tijdvenster van het zoekvak. Het risico van het verkeerd identificeren van voorbijgaande ruis als actiepotentiaal kan worden verminderd door het tijdsvenster waarin de plug-in naar actiepotentialen zoekt te verkleinen en door de drempelinstellingen te optimaliseren. Er zijn echter nog steeds situaties die men kan tegenkomen die de prestaties van de plug-in belemmeren. Spontane activiteit kan problemen veroorzaken als actiepotentialen met een grotere amplitude binnen het zoekvakvenster van het algoritme vallen, omdat ze verkeerd worden geïdentificeerd als het doelactiepotentiaal. Bovendien kan spontane activiteit in het neuron van belang betekenen dat de elektrische stimulatie daalt tijdens de refractaire periode, waardoor het niet lukt om een actiepotentiaal te genereren. Problemen met het gebruik van de software kunnen ook optreden wanneer primaire afferente neuronen flip-flop vertonen, waarbij alternatieve terminale takken van een enkel neuron worden gestimuleerd, waardoor het opgeroepen actiepotentiaal twee (of meer) basislijnlatenties heeft die elkaar uitsluiten²⁰. Tijdens opnames van neuronen die flip-flop vertoonden met hoge signaal-ruisverhoudingen, hebben we met succes latentie- en elektrische drempeltracking uitgevoerd door de breedte van het zoekvak te vergroten om alle potentiële geleidingssnelheden in te kapselen die het neuron vertoonde. De elektrische drempel kan echter variëren afhankelijk van de terminale tak van het neuron dat wordt geëxciteerd, wat waarschijnlijk gedeeltelijk te wijten is aan verschillen in de afstand van de plaats van de elektrische stimulatie tot de alternatieve nociceptorterminals. Extra werk aan het actiepotentiaalidentificatieproces om bijvoorbeeld sjabloonmatching op te nemen, is haalbaar en kan in deze software worden geïntegreerd. De GUI-plug-ins voor band-stop of adaptieve ruisfiltratie kunnen ook vóór APTrack in de signaalketen worden gebruikt als ze worden ontwikkeld.

We beschouwen de elektrische drempel bepaald als de stroom die nodig is om 50% van de tijd een actiepotentiaal uit te lokken, over een door de gebruiker gedefinieerd aantal elektrische stimuli, meestal 2-10. De morfologie van elektrische stimulatie is 0,5 ms en positieve, blokgolfpulsen. Dit is niet hetzelfde als het bepalen van de rheobase, een veelgebruikte maat voor neuronale prikkelbaarheid. De plug-in kan worden aangepast om de rheobase te bepalen. We streefden echter naar een eenvoudigere maat, omdat dynamische veranderingen in prikkelbaarheid, zoals die verondersteld worden op te treden tijdens verwarming, moeilijker te kwantificeren zouden zijn geweest met rheobase-veranderingen dan onze elektrische drempelschatting.

Deze software kan worden gebruikt in zowel menselijke als knaagdierexperimenten. Dit wordt mogelijk gemaakt door flexibele ondersteuning van de elektrische stimulatiesystemen. De software werkt met elke stimulator die een analoge opdrachtspanning accepteert of handmatig kan worden gekoppeld aan een stappenmotor. Voor microneurografie gebruikten we het met een CE-gemarkeerde constante stroomstimulator die was ontworpen voor gebruik in menselijk onderzoek en waarvan de stimulatie werd geregeld door een wijzerplaat. Stimulatoren die analoge spanningscommando's accepteren, kunnen luidruchtig zijn omdat ze het circuit tussen stimuli niet loskoppelen, wat betekent dat elke 50/60 Hz-brom of ruis op de analoge ingang naar de opname wordt verzonden. Een stimulator die een extra TLL-triggersignaal nodig heeft om het circuit aan te sluiten, waardoor een stimulus kan worden gegenereerd bij een stroom analoog aan de analoge spanningsingang, is ideaal voor gebruik met de plug-in. Dit voorkomt dat de ruis tussen de prikkels door wordt doorgegeven aan de opname.

De software maakt gebruik van een eenvoudige up-down methode om de elektrische drempel te schatten. Dit wordt al vele decennia gebruikt in psychofysische tests²⁵. In lijn met de up-down-methode houdt het algoritme voor het volgen van elektrische drempels voor het moduleren van de stimulatieamplitude alleen rekening met de amplitude en respons van de vorige stimulatie bij het berekenen van de amplitude van de volgende stimulatie. Dit betekent dat de stimulatieamplitude rond de werkelijke elektrische drempel zal oscilleren, waardoor een ontstekingssnelheid van 50% wordt geproduceerd, ervan uitgaande dat de drempel stabiel is. De minimale grootte van een toename of afname is 0,01 V; dit komt overeen met 0,01 mA, ervan uitgaande dat de stimulator een input-to-output-verhouding van 1 V: 1 mA heeft en voldoende resolutie om stapveranderingen zo klein te bereiken. De plug-in zal de live schatting van de elektrische drempel van het doelactiepotentieel bijwerken telkens wanneer deze een vuursnelheid van 50% bereikt ten opzichte van een door de gebruiker gedefinieerd aantal eerdere stimuli (2-10). Post hoc raden we aan om een voortschrijdend gemiddelde van de stimulatieamplitude over de laatste 2-10 stimuli te gebruiken om de elektrische drempel te schatten, en opgemerkt moet worden dat deze schatting alleen nauwkeurig zal zijn wanneer de vuursnelheid relatief stabiel is op 50%. In zowel de live als post hoc schattingen van de elektrische drempel, is er een balans tussen resolutie, betrouwbaarheid en tijd om te overwegen. Het gebruik van kleinere stap- en afnamestappen zal de nauwkeurigheid van de schatting van de elektrische drempel verhogen, maar zal de tijd die nodig is om de nieuwe elektrische drempel in eerste instantie en na verstoring te vinden, verlengen. Het berekenen van de elektrische drempel over een groter aantal eerdere stimuli zal een betere betrouwbaarheid bieden, maar zal de tijd die nodig is om tot een nauwkeurige schatting te komen, verlengen.

APTrack is ontworpen voor gebruik in perifere zenuwopnamen, specifiek om de elektrische drempels van C-vezels te volgen tijdens experimentele en pathologische verstoringen gedurende perioden waarin de actiepotentiaallatentie kan variëren afhankelijk van de onderliggende neuronale activiteit. Deze methode maakt het mogelijk om niet alleen axonale prikkelbaarheid, maar ook van nociceptorgeneratorpotentialen bij gezonde vrijwilligers en patiënten te onderzoeken. We verwachten dat andere gebieden van de elektrofysiologie deze tool kunnen overnemen en aanpassen voor gebruik in elk experiment dat de elektrische drempeltracking van een stimulus-vergrendelde activiteit vereist. Dit kan bijvoorbeeld net zo goed worden aangepast voor optogenetische stimulatie met lichtpulsen aangedreven door APTrack. De plug-in is open-source en beschikbaar voor onderzoekers onder een GPLv3-licentie. Het is gebouwd op het Open Ephys-platform, een aanpasbaar, goedkoop, open-source data-acquisitiesysteem. De plug-in biedt extra haken voor downstream-plug-ins om de actiepotentiaalinformatie te extraheren en extra gebruikersinterfaces of adaptieve paradigma's te bieden. De plug-in biedt een eenvoudige gebruikersinterface voor de visualisatie en latentietracking van actiepotentialen in realtime. Het kan ook eerdere gegevens afspelen en visualiseren met behulp van de tijdelijke rasterplot. Bovendien kan het ook latentietracking uitvoeren tijdens het afspelen van eerdere gegevens. Hoewel er andere softwarepakketten beschikbaar zijn voor real-time latentietracking, zijn ze niet open-source en kunnen ze geen elektrische drempeltracking^{uitvoeren 26,27}. APTrack heeft een voordeel ten opzichte van traditionele methoden voor het identificeren van actiepotentialen met constante latentie uit spanningssporen, omdat het een tijdelijke rasterplot gebruikt voor de gegevensvisualisatie. Bovendien hebben onze ervaringen met het gebruik ervan in experimenten met lage signaal-ruisverhoudingen aangetoond dat de visualisatiemethode voor temporele rasterplots de identificatie mogelijk maakt van actiepotentialen met constante latentie die anders misschien waren gemist.

Het volgen van de hele zenuwdrempel is een veelgebruikte methode voor het beoordelen van axonale prikkelbaarheid¹³. Single-neuron elektrische drempel tracking in knaagdier C-vezels is eerder gebruikt om nociceptor excitability¹⁴ te kwantificeren, en het nut ervan bij mensen wordt erkend^10,11; Tot nu toe was dit echter niet mogelijk. We bieden een nieuwe, open-source tool om de prikkelbaarheid van enkele nociceptor direct te meten in elektrofysiologische studies van zowel knaagdieren als menselijke perifere zenuwen. APTrack maakt voor het eerst de real-time, open-source, elektrische drempeltracking van actiepotentialen met één neuron bij mensen mogelijk. We verwachten dat het translationele studies van nociceptoren tussen knaagdieren en mensen zal vergemakkelijken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
12V DC Power Supply	NA	NA	To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators.
36 Pin Electrode Adapter Board	Intan Technology	C3410	APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021.
APTrack Plugin	NA	NA	https://github.com/Microneurography/APTrack
Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode	Custom	NA	Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Concentric Stimulating Electrode	World Precision Instruments	SNE-100	For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent.
Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode	Custom	NA	For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography.
BNC T Splitter (1+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter.
BNC to BNC cables (3+)	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard BNC cables.
C6H11NaO7	Merck	S2054	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
CaCl2	Merck	C5670	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Digitimer DS4 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS4	Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022.
Digitimer DS7 Constant Current Stimulator	Digitimer	DS7A	Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022.
Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes	Harmony Medical	NA	For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography.
Glucose	Fisher Scientific	G/0450/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
HDMI Cable	NA	NA	APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board.
KCl	Merck	P9541	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
MgSO4	Acros Organics	213115000	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Mineral Oil	Merck	330779	Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent.
NaCl	Merck	S9888	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S6014	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
NaHCO3	Merck	S0751	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
Open Ephys Acquisition Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022.
Open Ephys Graphical User Interface	Open Ephys	NA	https://github.com/open-ephys/plugin-GUI
Open Ephys I/O Board	Open Ephys	NA	APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022.
PulsePal V2	Sanworks	1102	APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly.
RHD 6ft SPI Cable	Intan Technology	C3206	APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021
RHD2216 16ch Bipolar Headstage	Intan Technology	C3313	APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage.
Sucrose	Fisher Scientific	S/8560/60	Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent.
TCS-II Thermal Stimulator	QST.Lab	NA	For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography.
Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference)	FHC	30085	For microneurography recordings. 35mm.
Ultrasound Scanner iQ+	Butterfly Network	NA	For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography.
USB 3.0 5kV RMS Isolation	Inota Technology	7055-D	For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022.
USB-A to micro USB-B cable (2)	NA	NA	APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing.
uStepper S-lite + NEMA17 motor	uStepper	NA	To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022.
Von Frey Filaments	Ugo Basile	37450-275	For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors.