Functionele karakterisering en visualisatie van slokdarmfibroblasten met behulp van organoïde coculturen

Samenvatting

Organoïde-fibroblast co-culturen bieden een model om de in vivo stamcelniche te bestuderen. Hier wordt een protocol voor slokdarmorganoïde-fibroblast co-culturen beschreven. Bovendien wordt beeldvorming van de hele montage gebruikt om de fibroblast-organoïde interactie te visualiseren.

Samenvatting

Epitheelstam- en voorlopercellen dragen bij aan de vorming en het onderhoud van de epitheelbarrière gedurende het hele leven. De meeste stam- en voorlopercelpopulaties zijn weggestopt op anatomisch verschillende locaties, waardoor exclusieve interacties mogelijk zijn met nichesignalen die de stam behouden. Hoewel de ontwikkeling van epitheliale organoïde culturen een krachtig hulpmiddel biedt voor het begrijpen van de rol van stam- en voorlopercellen in homeostase en ziekte, is de interactie binnen de niche-omgeving grotendeels afwezig, waardoor de identificatie van factoren die het gedrag van stamcellen beïnvloeden, wordt belemmerd. Fibroblasten spelen een sleutelrol bij het sturen van epitheliale stam en voorloper lot. Hier wordt een uitgebreid organoïde-fibroblast co-cultuurprotocol gepresenteerd dat de afbakening van fibroblastsubpopulaties in slokdarmvoorlopercelvernieuwing en -differentiatie mogelijk maakt. In dit protocol wordt een methode beschreven om zowel epitheelcellen als fibroblasten parallel aan de slokdarm te isoleren. Verschillende fluorescentie-geactiveerde celsorteerstrategieën om zowel de slokdarmvoorlopercellen als de fibroblastsubpopulaties te isoleren van transgene reporter- of wild-type muizen worden geschetst. Dit protocol biedt een veelzijdige aanpak die kan worden aangepast aan de isolatie van specifieke fibroblastsubpopulaties. Het vaststellen en doorgeven van slokdarmepitheelorganoïde monoculturen is opgenomen in dit protocol, waardoor een directe vergelijking met het cocultuursysteem mogelijk is. Daarnaast wordt een 3D-clearingbenadering beschreven die gedetailleerde beeldanalyse van epitheliale-fibroblastinteracties mogelijk maakt. Gezamenlijk beschrijft dit protocol een vergelijkende en relatief high-throughput methode voor het identificeren en begrijpen van slokdarmstamcelnichecomponenten in vitro.

Inleiding

Organoïden worden gebruikt als 3D in vitro assays om stam- en voorlopercellen te karakteriseren, evenals om de signaalsignalen te begrijpen die zijn afgeleid van de cellulaire componenten van de stamcelniche 1,2,3,4. Muisslokdarmorganoïden werden voor het eerst beschreven in 2014 en verschillende artikelen hebben groeifactoren geïdentificeerd, zoals R-Spondin (RSPO), NOGGIN en epidermale groeifactor (EGF), die nodig zijn om slokdarmorganoïden ^5,6,7 te behouden en te passeren^, met het argument dat vergelijkbare signaalsignalen nodig zijn voor in vivo voorlopercelvernieuwing. Groeifactoren worden echter vaak toegevoegd in niet-fysiologische concentraties, wat resulteert in organoïde groeiomstandigheden die niet noodzakelijkerwijs de in vivo signaleringsomgeving weerspiegelen.

Fibroblasten zijn heterogene stromale celpopulaties die voorloperceleigenschappen ondersteunen in veel stamcelniches⁸. Het combineren van epitheliale voorlopercellen en fibroblasten in dezelfde organoïde cultuur maakt organoïdevorming mogelijk in verminderde concentraties van exogeen aangevulde groeifactoren. Organoïde co-cultuursystemen van intestinale en hepatische epithelia worden beschreven, maar een protocol om slokdarmorganoïde-fibroblast co-culturen vast te stellen is nog steeds uitstekend 9,10,11.

In dit protocol worden twee fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) strategieën voor fibroblasten uit de slokdarm geschetst, met behulp van transgene Pdgfrα^{H2BeGFP-muizen 12} of wild-type muizen met klassieke antilichaamkleuring. Verschillende subpopulaties van fibroblasten kunnen worden geïsoleerd met behulp van celoppervlakmarkers naar keuze, waardoor het protocol flexibiliteit krijgt. Bovendien wordt een 3D-fluorescentiebeeldvormingstechniek met behoud van organoïde morfologie gebruikt om fibroblast-organoïde interacties te karakteriseren. Organoïde clearing biedt een snelle methode om de lichtpenetratiediepte in de organoïden te vergroten, de visualisatie van organoïde-fibroblastverbindingen te verbeteren en de recapitulatie van de organoïde structuur in zijn geheel mogelijk te maken. Dit protocol combineert slokdarm organoïde co-cultuur met een hele mount imaging strategie, waardoor functionele karakterisering van de fibroblast-organoïde interactie mogelijk is.

Protocol

Dierproeven voor deze studie werden goedgekeurd door Stockholms Norra djurförsöksetiska nämnd (ethische vergunning nr. 14051-2019). Dieren werden gehuisvest in pathogeenvrije omstandigheden volgens de aanbevelingen van de Federation of European Laboratory Animal Science Association.

1. Voorbereiding

1. Ontdooi de enzymatische stamoplossingen die worden gebruikt voor dissociatie (zie materiaaltabel) op ijs. Ontdooi een aliquot van groeifactor gereduceerde (GFR) keldermembraanmatrix (matrix) bij 4 °C.
2. Bereid het kweekmedium voor. Gebruik het in tabel 1 beschreven medium voor organoïde culturen en coculturen en bereid het voor voordat u met het protocol begint.

2. Dissectie en scheiding van het slokdarmepitheel en stroma

OPMERKING: Zorg ervoor dat alle instrumenten die worden gebruikt voor dissectie en weefselverwerking steriel zijn. Bereid 2 ml dissociatieoplossing (zie materiaaltabel) in Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) per drie slokdarms.

1. Gebruik een muizenstam naar keuze, zoals C57BL/6J-muizen. De ontwikkeling van de slokdarm bij muizen eindigt na postnatale dag (p) 70, dus het wordt aanbevolen om muizen te gebruiken die ouder zijn dan p70¹³. Gebruik vier of vijf muizen omdat ze voldoende materiaal leveren om 8-10 organoïde coculturen tot stand te brengen.
   OPMERKING: De organoïdevormende efficiëntie neemt af met de leeftijd van de muizen. Als specifieke fibroblastsubpopulaties van belang zijn, is het mogelijk dat de lage fibroblastopbrengst het aantal organoïde coculturen beperkt dat kan worden vastgesteld.
2. Gebruik genetisch gemodificeerde (bijv. Pdgfrα^H2BeGFP) of wild-type (WT) muizen voor de isolatie van fibroblastpopulaties. Wanneer u WT-muizen gebruikt, voert u antilichaamkleuring uit om specifieke fibroblastsubpopulaties via FACS uit het stroma te isoleren.
3. Euthanaseer de muizen door CO 2-verstikking. Ontleed de slokdarm met een tang en een dissectieschaar. Om de hele slokdarm te verwijderen, snijdt u het distale uiteinde van de slokdarm direct boven de maag en het proximale uiteinde aan het begin van de luchtpijp. Dompel de slokdarm onder in PBS en leg hem op ijs.
4. Verwijder de muscularis externa mechanisch met behulp van een dissectiemicroscoop (totaal vergrotingsbereik van 8x-40x) en een tang. Houd het distale uiteinde van de ontlede slokdarm vast met behulp van een tang en gebruik de andere tang om de spier van het distale naar het proximale uiteinde van de ontlede slokdarm te grijpen en te trekken. Verwijder en gooi de spierlaag weg.
5. Open de slokdarm in de lengterichting. Dit werkt het beste met behulp van een microdissectie veerschaar met een balpunt om weefselschade te voorkomen. Houd het ene uiteinde van de slokdarm vast om de bal van de veerschaar in het lumen van de slokdarm te steken en knip de slokdarm open terwijl u het uiteinde vasthoudt.
6. Plaats de slokdarm in een microcentrifugebuis van 1,5 ml of een plaat met 24 putten. Incubeer de geopende slokdarm in 0,5 mg/ml thermolysine in HBSS bij 37 °C op een rocker-shaker gedurende 15 minuten. Dompel de slokdarm volledig onder in thermolysine-oplossing.
   OPMERKING: Het volume van de gebruikte thermolysine-oplossing is afhankelijk van de put- of buisgrootte. Verschillende slokdarmen kunnen worden geplaatst en ondergedompeld in dezelfde put of buis.
7. Haal de slokdarm uit de thermolysine-oplossing. Gebruik een dissectiemicroscoop om het slokdarmepitheel zorgvuldig van het stroma te scheiden. Pak met een fijne tang zowel de epitheelzijde als de stromazijde van het weefsel vast en trek ze langzaam uit elkaar om de twee lagen te scheiden.
   OPMERKING: Het stroma is te herkennen aan zijn witte en ondoorzichtige uiterlijk, in tegenstelling tot het transparante epitheel. Het stroma bevat de lamina propria en submucosale laag.
8. Breng de epitheliale en stromale laag over in twee afzonderlijke microcentrifugebuizen van 1,5 ml met 200 μL dissociatieoplossing in HBSS. Op ijs gezet.

3. Isolatie van slokdarmvoorlopercellen

OPMERKING: De isolatie van slokdarmvoorlopercellen (stap 2) en fibroblasten (stap 3) kan tegelijkertijd worden uitgevoerd. Bereid een tube van 50 ml van 1% FBS in HBSS (1% FBS).

1. Breng het gescheiden slokdarmepitheel van de 1,5 ml microcentrifugebuis (stap 2.8) over in een schone petrischaal en gebruik een scherp scalpel om te hakken. Verzamel het gehakte weefsel uit de petrischaal met 200 μL dissociatieoplossing en breng het terug naar de 1,5 ml microcentrifugebuis.
   OPMERKING: Het epitheel wordt goed gehakt wanneer de stukjes terug in de 1,5 ml microcentrifugebuis kunnen worden geplaatst met behulp van een pipetpunt van 200 μL.
2. Voeg 800 μL verse dissociatieoplossing toe aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml tot een totaal volume van 1 ml.
   OPMERKING: Het is belangrijk om een voldoende volume dissociatie-oplossing toe te voegen. Per één tot drie slokdarmen wordt 1 ml oplossing aanbevolen. Schaal op wanneer er meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt.
3. Plaats de buis met de gehakte epitheellaag gedurende 60 minuten op een rocker-shaker bij 37 °C. Pipetteer de oplossing ongeveer 20 keer op en neer met een pipetpunt van 200 μL om de 15 minuten om de spijsvertering te verbeteren.
4. Na 60 minuten pipet u nog eens 20 keer op en neer met een pipetpunt van 200 μL. Laat de oplossing door een celzeef van 40 μm in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml lopen. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Maak de celzeef nat met 1% FBS voordat u de cellen zeeft om de hechting van de cellen aan het filter te minimaliseren. Het epitheel zal niet volledig worden verteerd en stukjes weefsel zullen nog steeds zichtbaar zijn. Langere incubatie zal echter de celoverleving verminderen en niet resulteren in een hogere opbrengst van levensvatbare cellen.
5. Gooi het supernatant weg door overtollige vloeistof te verwijderen met een pipet van 1 ml en resuspensie van de pellet in 1 ml 1% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   1. Bereid tijdens het centrifugeren het geconjugeerde antilichaammengsel voor op FACS van slokdarmvoorlopercellen.
   2. Meng 1 μL CD324-PE-Cy7 (ECADHERIN) en CD104-A647 (INTEGRIN-β4) in 200 μL van 1% FBS per miljoen cellen.
      OPMERKING: 1 μL antilichaam (200 μL eindvolume) is voldoende voor één of twee slokdarmen. Wanneer u meer slokdarm tegelijk verwerkt, verhoogt u het volume van de antilichaamkleuringsoplossing.
6. Resuspendie van de pellet in 200 μL antilichaammengsel en overbrenging naar een flowcytometriebuis. Na het toevoegen van fluorescerende antilichamen, houdt u de celsuspensies in het donker om bleken van het signaal te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C. Voeg 3 ml 1% FBS toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 300 x g en resuspensie de cellen vervolgens in minimaal 200 μl of 1% FBS.
   OPMERKING: 500 μL 1% FBS wordt gebruikt voor maximaal vier of vijf slokdarms. Verhoog het volume wanneer meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt, zodat een FACS-stroomsnelheid van 100-300 gebeurtenissen (s) kan worden bereikt. Meer gebeurtenissen zullen de sorteerefficiëntie verminderen en een toename van de stroomsnelheid zal de celoverleving verminderen.
7. Voeg dode cel kleurmarker toe tot een uiteindelijke concentratie van 1:10.000, 5 minuten voorafgaand aan FACS-sortering om levende cellen te isoleren. Sorteer de voorlopercellen met behulp van een FACS-machine (zie figuur 1 voor gatingstrategie). Verzamel de cellen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml gevuld met 200 μl basisch organoïde medium (tabel 1).

4. Isolatie van fibroblasten uit de stromale laag

1. Knip de stomale laag in fijne stukjes in een buis van 1,5 ml met 200 μL dissociatieoplossing (stap 2.8) met behulp van een dissectieschaar. Het weefsel wordt goed gehakt zodra de oplossing op en neer kan worden gepipetteerd met behulp van een pipetpunt van 200 μL.
2. Voeg 800 μL verse dissociatieoplossing toe aan de microcentrifugebuis van 1,5 ml tot een totaal volume van 1 ml.
   OPMERKING: Het is belangrijk om een voldoende volume dissociatie-oplossing toe te voegen. Per één tot drie slokdarmen wordt 1 ml oplossing aanbevolen. Schaal op wanneer er meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt.
3. Plaats de buis gedurende 30 minuten op een rocker-shaker bij 37 °C. Na 15 minuten pipet u de oplossing ongeveer 20 keer op en neer met behulp van een pipetpunt van 200 μL om de spijsvertering te verbeteren.
4. Na 30 minuten enzymatische vertering, pipet u nog eens 20 keer op en neer met behulp van een pipetpunt van 200 μL. Zeef de oplossing door een 70 μm celzeef in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Maak de celzeef nat met 1% FBS voordat u de cellen zeeft om de hechting van cellen aan het filter te minimaliseren.
5. Gooi het supernatant weg door overtollige vloeistof te verwijderen met een pipet van 1 ml en resuspensie van de pellet in 1 ml 1% FBS. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
   OPMERKING: Bij gebruik van een genetisch gemodificeerde muizenstam die flourescent-gelabelde fibroblasten bevat, zijn antilichaamkleuringen optioneel. Als antilichaamkleuringen niet nodig zijn, ga dan verder met stap 3.7 en breng het monster over naar een flowcytometriebuis.
   1. Bereid tijdens het centrifugeren het geconjugeerde antilichaammengsel voor op de FACS-isolatie van fibroblasten. Meng 1 μL CD26-APC (DPP4) in 200 μL van 1% FBS per miljoen cellen.
      OPMERKING: 1 μL antilichaam is voldoende voor een of twee slokdarms. Wanneer u meer slokdarm tegelijk verwerkt, verhoogt u het volume van de antilichaamkleuringsoplossing.
6. Resuspendeer de pellet in 200 μL geconjugeerd antilichaammengsel in 1% FBS en breng het over naar een flowcytometriebuis. Incubeer de cellen gedurende 30 minuten bij 4 °C.
7. Voeg 3 ml 1% FBS toe en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 300 x g . Resuspendeer de cellen in minimaal 200 μL of 1% FBS.
   OPMERKING: 500 μL 1% FBS wordt gebruikt voor maximaal vier of vijf slokdarms. Verhoog het volume wanneer meer slokdarm tegelijk wordt verwerkt, zodat een stroomsnelheid van 100-300 gebeurtenissen / s kan worden bereikt. Meer gebeurtenissen zullen de sorteerefficiëntie verminderen en het verhogen van de stroomsnelheid zal de celoverleving verminderen. Na het toevoegen van fluorescerende antilichamen moeten celsuspensies donker worden gehouden om bleken van het signaal te voorkomen.
8. Voeg dode cel kleurmarker toe tot een uiteindelijke concentratie van 1:10.000, 5 minuten voorafgaand aan FACS-sortering om levende cellen te isoleren. Sorteer de cellen met behulp van een FACS-machine (zie figuur 1 voor gating-strategie). Verzamel de cellen in microcentrifugebuizen van 1,5 ml gevuld met 200 μl basisch organoïde medium (tabel 1).

5. Oprichting en cultuur van slokdarmorganoïden

OPMERKING: Prewarm ER_low (organoïde co-cultuur), ENR (organoïde) medium (zie tabel 1 voor beschrijving) en een 48-well plaat bij 37 °C. Leg de ontdooide matrix (bereid in stap 1) aliquot op ijs. Het wordt aanbevolen om de matrix hier te gebruiken (zie tabel met materialen) voor de slokdarm organoïdecultuur van muizen, omdat andere merken matrix de efficiëntie van organoïdevorming negatief beïnvloeden.

1. Voor de organoïde co-cultuur, meng de gesorteerde epitheelcellen en fibroblasten in een verhouding van 1: 2 in een buis. Gebruik voor elke matrixkoepel 5.000 epitheelcellen en 10.000 fibroblasten. Voeg bij de voorbereiding op meer koepels een veelvoud van 5.000 epitheelcellen en 10.000 fibroblasten toe aan één buis. Gebruik voor organoïde culturen zonder fibroblasten 5.000 epitheelcellen per matrixkoepel.
2. Centrifugeer de gemengde celpopulatie op 300 x g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 μL.
3. Was de cellen eenmaal door de pellet opnieuw te suspenderen in koud basisch organoïde medium en centrifugeer gedurende 5 minuten op 300 x g . Plaats de cellen op ijs.
4. Bereid een mix bestaande uit 80% matrix en 20% koud basisch organoïde medium. Plaats alles op ijs terwijl de matrix stolt bij kamertemperatuur (RT).
5. Gooi het supernatant na centrifugeren weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 μL. Resuspendeer de cellen in 10 μL matrixmix/koepel en zet ze terug op ijs.
6. Neem de voorverwarmde 48-putplaat uit de 37 °C incubator en maak één matrixkoepel per put met behulp van een pipet van 20 μL. Elke koepel bevat 10 μL van 80% matrix, 5.000 epitheelcellen en 10.000 fibroblasten. Breng de plaat ondersteboven over naar een incubator en laat de koepels nog 20-30 minuten stollen bij 37 °C.
   OPMERKING: Een afname van het matrixkoepelvolume en/of een toename van het celaantal heeft invloed op de efficiëntie van de organoïdevorming.
7. Voeg 200 μl voorverwarmd ER_laag medium (tabel 1) toe aan de matrixkoepels met organoïde coculturen en ENR-medium (tabel 1) aan de respectieve matrixkoepels die alleen epitheelorganoïden bevatten en plaats de plaat in de incubator.
8. Kweek de organoïden bij 37 °C en 5% CO₂. Vul het medium de eerste 2 dagen aan met 10 μM Rock-remmer (Y-27623). Rotsremmer voorkomt stress-geïnduceerde celdood en verhoogt de kans op een succesvolle vestiging van organoïde culturen.
9. Ververs het medium elke 2-3 dagen. Zorg ervoor dat het medium warm is om de dissociatie van de temperatuurgevoelige matrix te voorkomen.
10. Voer analyses van het experiment uit 6 tot 8 dagen na het plateren. De organoïden kunnen tot 14 dagen in cultuur worden gehouden. Rond dag 14 wordt verlies van koepelintegriteit waargenomen.

6. Doorgeven van organoïden

OPMERKING: Het passeren van organoïden gekweekt in co-cultuur resulteert in het verlies van fibroblasten. Daarom wordt aanbevolen om ENR-medium te gebruiken voor alle organoïden wanneer ze worden gepasseerd. Voorwarme ENR, PBS en een plaat met 48 putten bij 37 °C.

1. Verwijder het medium en was de put met de matrixkoepel met voorverwarmde PBS. Voeg 200 μL koude 0,25% trypsine-oplossing toe en pipetteer op en neer om de matrixkoepel te breken.
   OPMERKING: Het gebruik van koude 0,25% trypsine wordt aanbevolen, omdat de matrix temperatuurgevoelig is en dit helpt bij het afbreken van de matrixkoepels.
2. Incubeer de organoïden met trypsine bij 37 °C gedurende ~20 min. Pipetteer op en neer na 10 minuten om de dissociatie van de organoïden te vergroten. Controleer het dissociatieproces elke 5-10 minuten met een microscoop. Aangezien trypsine de levensvatbaarheid van cellen vermindert, kan dit helpen om de ideale dissociatietijd te identificeren.
3. Na 20 minuten pipet u de organoïden op en neer met een pipet van 200 μL om de organoïden te dissociëren. Verzamel de cellen in een microcentrifugebuis van 1,5 ml, voeg 1 ml basisch organoïde medium toe en centrifugeer gedurende 5 minuten bij RT op 300 x g .
4. Optioneel: Om de beste organoïde groeiomstandigheden te garanderen en dat nieuwe organoïden zijn afgeleid van afzonderlijke cellen, zeeft u de cellen door een vooraf bevochtigde celzeef van 40 μm. Het filteren van de celsuspensie resulteert in het verwijderen van organoïde kernen en celklonten die moeilijk te dissociëren zijn.
5. Maak een matrixmix bestaande uit 80% matrix en 20% koud basisch organoïde medium. Zet alles op ijs, want de matrix stolt bij RT.
6. Gooi het supernatant weg door het voorzichtig te verwijderen met een pipet van 200 μL, resuspensie van de cellen in 10 μL matrixmix/koepel en leg het mengsel terug op ijs.
   OPMERKING: Organoïden kunnen worden gesplitst in een verhouding van 1:5 tot 1:10, afhankelijk van de koepeldichtheid. Epitheelcellen kunnen ook worden geteld en opnieuw worden geplateerd op 5.000 cellen / koepel.
7. Neem de voorverwarmde 48-well plaat uit de 37 °C incubator en maak één koepel per put. Breng de plaat ondersteboven over naar een incubator en laat de koepels nog 20-30 minuten stollen bij 37 °C.
8. Voeg 200 μL voorverwarmd ENR-medium toe aan de respectievelijke organoïde koepels. Vul het medium de eerste 2 dagen aan met 10 μM Rock-remmer (Y-27623).
9. Ververs het medium elke 2-3 dagen. Zorg ervoor dat het medium warm is om dissociatie van de temperatuurgevoelige matrix te voorkomen.

7. Organoïde verwerking voor hele mount kleuring

OPMERKING: Bedek de uiteinden en buizen voor gebruik met 10% FBS in PBS om te voorkomen dat organoïden zich aan kunststoffen hechten. Voor pipetpunten volstaat het om een of twee keer op en neer te pipetten in een 10% FBS/PBS-oplossing voordat u de punt gebruikt. Voor buizen, vul de buis met 10% FBS / PBS en verwijder vervolgens de oplossing.

1. Verwijder het organoïde medium en voeg 200 μL ijskoud PBS toe aan de matrixkoepels. Leg de plaat 5-10 minuten op ijs.
2. Pipetteer op en neer en breng de oplossing over in 0,6 ml microcentrifuge niet-hechtende buizen. Centrifugeer kort gedurende 30-60 s op 100 x g om de organoïden in de bodem te laten bezinken.
   OPMERKING: Overtollig pipetteren en lange centrifugatie breekt de organoïden en verstoort de fibroblast-organoïde interactie.
3. Verwijder overtollige vloeistof en voeg ijskoude PBS toe. Centrifugeer kort gedurende 30-60 s op 100 x g om de organoïden in de bodem te laten bezinken.
4. Verwijder overtollige vloeistof en fixeer de organoïde met 200 μL koude 4% formaldehyde in PBS-oplossing gedurende 30 minuten op ijs.
   LET OP: Formaldehyde is giftig en moet altijd worden gebruikt in een chemische zuurkast. Nitrilhandschoenen, veiligheidsbrillen en laboratoriumjassen moeten altijd worden gedragen.
5. Fixatie van de organoïde zorgt ervoor dat ze zinken en centrifugeren is niet meer nodig. Laat de organoïden zinken door de buis rechtop te plaatsen en wacht 2-3 minuten, verwijder de formaldehyde en voeg 500 μL koude PBS toe om de formaldehyde weg te spoelen.
6. Laat de organoïden zinken, verwijder de overtollige PBS en voeg 500 μL verse koude PBS toe. Laat de organoïden zinken, verwijder de overtollige PBS en voeg 500 μL blokkeringsbuffer toe (5% normaal ezelserum, 1% BSA en 0,5% Triton X-100 in PBS). Zet de buis op een rocker-shaker gedurende 60 minuten bij RT.
   OPMERKING: Blokkeren kan ook 's nachts (O/N) bij 4 °C.
7. Laat de organoïden zinken, verwijder de blokkerende buffer en resuspensie van de organoïden in 200 μL blokkeringsbuffer met primaire antilichamen (zie tabel met materialen). Bewaar de organoïden op een rocker-shaker O/N bij 4 °C.
   OPMERKING: Om de kleuring van nucleaire eiwitten, laag tot expressie gebrachte eiwitten of antilichamen die niet-specifieke kleuring vertonen te verbeteren, kan de incubatietijd gedurende 1 of 2 dagen bij 4 °C worden verlengd. Het plaatsen van de organoïden op een rocker-shaker is essentieel omdat het voorkomt dat organoïden samenklonteren en de kleuringsefficiëntie verhoogt.
8. Laat de organoïden zinken, verwijder de primaire antilichaammix en was de organoïden met 500 μL van 0,02% Triton X-100 in PBS (0,02% Tx) gedurende 60 minuten bij RT. Herhaal drie keer.
   OPMERKING: Wanneer langere primaire antilichaamincubatie nodig is, voeg dan een wasstap toe met 0,02% Tx in PBS O/N bij 4 °C.
9. Laat de organoïden zinken, verwijder de wasbuffer en voeg 200 μL fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam toe in blokkerende buffer O/N bij 4 °C. Na het toevoegen van fluorescerende secundaire antilichamen, houdt u de organoïden in het donker om bleken van het signaal te voorkomen.
10. Laat de organoïden zinken, verwijder de secundaire antilichaammix en was de organoïden met 500 μL van 0,02% Tx gedurende 60 minuten bij RT. Herhaal dit drie keer.
11. Contrakleuring van de organoïden met 200 μL DAPI (0,25 μg/ml) oplossing voor nucleaire kleuring indien nodig. Incubeer de monsters gedurende 60 minuten bij RT op een rocker-shaker.
12. Laat de organoïden zinken, verwijder de DAPI-oplossing en was de organoïden in 500 μL PBS gedurende 15 minuten bij RT. Herhaal dit drie keer.
13. Laat de organoïden zinken en verwijder alle overtollige vloeistof. Voeg 10 μL klaringsoplossing toe aan de organoïden en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
    OPMERKING: De opruimoplossing is viskeus, dus snijd het buitenste deel van een pipetpunt van 20 μL af voordat u de opruimoplossing pipetteert. Er kan meer opruimoplossing worden toegevoegd als een grotere afstandhouder wordt gebruikt voor beeldvorming. Montage-oplossing kan worden gebruikt in plaats van de opruimoplossing wanneer de organoïden niet worden verwijderd. De clearing-oplossing vermindert de achtergrond bij het maken van afbeeldingen en vergroot de beelddiepte.
14. Plaats een 0,05 mm dubbelzijdige kleverige 4-well afstandhouder op een microscoopglaasje. Voeg de 10 μL opruimoplossing met de organoïden in één put toe en plaats een afdekstrook bovenop de afstandhouder.
    OPMERKING: Organoïden kunnen ook worden gemonteerd zonder het gebruik van een afstandhouder. De afstandhouder houdt de organoïde vorm intact en voorkomt dat de organoïden worden afgeplat.
15. Houd de dia op RT O/N om de organoïden te verwijderen. Voor langdurige opslag houdt u de dia's op 4 °C. Verkrijg beelden met behulp van een confocaal microscopiesysteem.

Resultaten

De slokdarm is verdeeld in verschillende lagen: epitheel, lamina propria, submucosa en muscularis externa (figuur 1A). Fibroblasten bevinden zich in de submucosa en lamina propria, aangeduid als het stroma. In dit protocol wordt de muscularis externa mechanisch verwijderd (figuur 1B), wat niet leidt tot een verlies van fibroblasten (Pdgfrα^H2BeGFP+) die zich in het stroma bevinden (figuur 1C). Vóór dissociatie wordt het epitheel gescheiden van het stroma, wat resulteert in twee weefselsegmenten (figuur 1B). Het scheiden van de twee lagen biedt de mogelijkheid om de dissociatietijd te verlengen voor de robuustere epitheellaag in vergelijking met de fragiele stromale laag. Op deze manier wordt een efficiënt isolatieprotocol opgesteld dat zowel levensvatbare epitheliale voorlopercellen als stromale fibroblasten oplevert (figuur 1B). Slokdarmvoorlopercellen worden gesorteerd op basis van hun hoge INTEGRIN-β4- en E-CADHERIN-expressie (figuur 1C,D).

Subpopulaties van fibroblasten kunnen worden geïsoleerd met behulp van verschillende markers. In dit protocol wordt een strategie voor fibroblastisolatie op basis van veelgebruikte fibroblastmarkers PDGFRα en DPP4 (CD26) gegeven. Isolatie door de Pdgfrα^{H2BeGFP-reporterexpressie} of DPP4-antilichaam toont aan dat ongeveer 50% van de geïsoleerde cellen fibroblasten zijn (figuur 1E,F). Bovendien is 70% van de PDGFRα+ fibroblasten DPP4+, wat aangeeft dat een grotendeels overlappende, maar niet identieke fibroblastpopulatie wordt verkregen. Na het isoleren van zowel epitheel- als stromale celpopulaties, worden slokdarmvoorlopercellen alleen of samen met fibroblasten in een matrixkoepel gekweekt. Om de bijdrage van fibroblasten aan de vorming van organoïden te bestuderen, wordt de co-cultuur gehandhaafd in een groeifactor gereduceerd medium (figuur 1G).

Slokdarmvoorlopercellen vormen organoïden in aanwezigheid van EGF, NOGGIN en RSPO (ENR). Het verwijderen van NOGGIN en het verminderen van de hoeveelheid RSPO (25 ng / μL; ER_laag) is voldoende om organoïdevorming te voorkomen (figuur 2A). Interessant is dat het toevoegen van DPP4 + of PDGFR + fibroblasten aan de slokdarmvoorlopercellen in het ER_low medium het organoïdevormende vermogen herstelt, wat een ondersteunende functie voor beide fibroblastpopulaties aantoont (figuur 2A-D). Visualisatie van het Pdgfrα^{H2BeGFP-transgen} laat zien dat fibroblasten tijdens de vorming van organoïden in nauw contact staan met de epitheelvoorlopercellen (figuur 2A). Op dag 6 zijn Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblasten nog steeds overvloedig aanwezig in de co-cultuur. Fibroblasten zijn aanwezig in de hele koepel, in de buurt van en raken de organoïden (volledige pijl), of bevestigd aan de organoïden (pijlpunt; Figuur 2D).

Whole mount kleuring toont een 3D-weergave van de interactie van de fibroblasten met de organoïden (figuur 3). Hoewel het mogelijk is om het hele montageprotocol uit te voeren zonder het gebruik van een clearingoplossing, vermindert het de transparantie en laserpenetratie van de organoïde (figuur 3B, z-view). Bij het monteren van organoïden helpt de afstandhouder om de organoïde morfologie te behouden. Daarentegen vlakt het beplaten van de coverslip direct op de organoïden (zonder afstandhouder) de organoïden af en resulteert in verlies van organoïde structuur (figuur 3A, B).

Zowel de DPP4+ als de PDGFRα+ fibroblasten blijken om de organoïden te zijn gewikkeld (Figuur 3C, Video1 en Video 2). Differentiatie van slokdarmorganoïden kan worden beoordeeld met behulp van verschillende markers. Figuur 4 laat zien dat het meegeleverde kleuringsprotocol geschikt is voor gemakkelijker te kleuren keratines (KRT14/13) en moeilijker-te-kleuren transcriptiefactoren (TRP63/KLF4). Het co-cultuurprotocol genereert organoïden met een vergelijkbaar differentiatiepatroon, zoals aangetoond in vivo^13,14 en zoals gezien in organoïden gekweekt in ENR-medium; KRT14+ of TRP63+ voorlopercellen vormen de buitenste laag en KRT13+ of KLF4+ gedifferentieerde cellen oriënteren zich naar binnen.

Dit protocol biedt een hulpmiddel om de slokdarmstamcelniche in vitro te bestuderen en visualiseert de interactie tussen organoïden en fibroblasten. Door een protocol te implementeren voor de isolatie van fibroblasten met behulp van antilichamen, is de methode aanpasbaar en kan deze worden gebruikt om fibroblastsubpopulaties te bestuderen zonder de noodzaak van transgene muizen.

Figuur 1: Isolatie van voorlopercellen en fibroblastsubpopulaties uit de slokdarm. (A) Schematisch overzicht van de verschillende lagen in de slokdarm. Het stroma bevat de lamina propria en submucosa. (B) Schematisch overzicht van het isolatieprotocol. De spier (muscularis externa) wordt mechanisch verwijderd met behulp van een tang; De resterende slokdarm wordt opengesneden en geïncubeerd in thermolysine om de epitheellaag van het stroma te scheiden. Het epitheel en stroma worden gescheiden, mechanisch gehakt en enzymatisch verteerd tot eencellige suspensies. Gedissocieerde cellen worden vervolgens gekleurd en voorbereid op FACS. (C) Doorsnede van de slokdarm ontdaan van de muscularis externa met Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblasten in het stroma. INTEGRINE-β4 (ITGβ4) en E-CADHERINE (ECAD) dubbelpositieve cellen zijn de epitheliale voorlopercellen van de slokdarm. Schaalbalk = 100 μm. (D) Representatieve flowcytometrieplot van epitheelcelisolatie met het percentage levende cellen (bovenste paneel) van alle afzonderlijke cellen. Het onderste paneel toont het percentage geïsoleerde ITGβ4+ ECAD+ voorlopercellen (Prog.) van alle levende cellen. (E) Representatieve flowcytometrie plot van stromale celisolatie met het percentage levende cellen (paneel linksboven). Representatieve flowcytometrieplots met het percentage geïsoleerde DPP4+ fibroblasten (Fibr.; paneel rechtsboven) en Pdgfrα+ fibroblasten (linkerbenedenpaneel) van alle levende cellen. 70% van de Pdgfrα+ fibroblasten zijn ook DPP4+ (rechterbenedenpaneel). (F) Representatieve flowcytometrieplot van het stroma met alleen DPP4+ cellen (2,5%), DPP4+ PDGFRα+ cellen (37,5%), en PDGFRα+ alleen cellen (17,7%). De percentages zijn van alle levende cellen. (G) Alleen epitheelcellen worden geplateerd in een matrixkoepel in aanwezigheid van 50 ng/μL EGF, 100 ng/μL NOGGIN en 250 ng/μL RSPO (ENR), of samen met fibroblasten in aanwezigheid van EGF en een lage concentratie RSPO (25 ng/μL). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve resultaten van organoïde coculturen. (A) Brightfield-beelden die de groei van de organoïden van dag 1 tot dag 6 laten zien. De brightfield-beelden met de organoïden die samen met Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblasten zijn gekweekt, tonen ook het nucleaire eGFP-signaal. Schaalbalk = 25 μm. (B) Brightfieldbeelden van de hele matrixkoepel op dag 6. De linkerkolom toont organoïde co-culturen gekweekt in de aanwezigheid van Pdgfrα+ fibroblasten in ER laag of E laag R_laagmedium. De middelste kolom toont organoïde co-culturen gekweekt in de aanwezigheid van DPP4 + fibroblasten in ER laag of E laag R_laagmedium. De rechterkolom toont organoïde monoculturen gekweekt in ENR-medium. ENR-medium = EGF (50 ng/μL), NOGGIN (100 ng/μL) en RSPO (250 ng/μL). ER_laag = EFG en 25 ng/μL RSPO. E laagR_laag = 5 ng/μL EGF en 25 ng/μL RSPO. Schaalbalk = 500 μm. (C) Grafiek met de organoïdevormingsefficiëntie (%) (d.w.z. het percentage cellen dat organoïden vormt in verschillende kweekomstandigheden). Elke stip vertegenwoordigt een matrixkoepel en de balk vertegenwoordigt het gemiddelde van alle stippen per voorwaarde. (D) Brightfield en fluorescerend beeld van dag 6 organoïden co-gekweekt met Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblasten. Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblasten zijn aanwezig in de koepel, bevestigd aan de organoïden (pijlpunt) en ongebonden maar in contact met de organoïden (volledige pijl). Schaalbalk = 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Whole mount staining protocol voor de studie van fibroblast-organoïde interacties . (A) Schematisch overzicht van het gehele mount immunofluorescentie protocol. AB = antilichaam. (B) Immunofluorescentiebeeld van onduidelijke kleuring van de hele berg die een verminderde transparantie en penetratie van het laserlicht laat zien in vergelijking met de geklaarde organoïden. De afwezigheid van een spacer resulteert in afplatting van de organoïde en verlies in organoïde morfologie. (C) Hele montagebeelden van de co-gekweekte organoïden tonen 3D-oppervlakken van de organoïden met VIMENTIN + fibroblasten (Fibr.) gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde. 3D-doorsneden en 2D-vlakbeelden tonen het lumen van de organoïde. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Whole mount images tonen verschillende basale en suprabasale celpopulaties. (A) Whole mount kleuring van mono- en co-gekweekte organoïden met Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblasten met KRT14+ basale cellen in de buitenste laag en KRT13+ gedifferentieerde suprabasale cellen. Schaalbalk = 50 μm. (B) Whole mount kleuring van mono- en co-gekweekte organoïden met Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblasten met TRP63+ basale cellen in de buitenste laag en KLF4+ gedifferentieerde suprabasale cellen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Tabel met een beschrijving van de componenten van de organoïde cultuurmedia. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Video 1: Pdgfrα^H2BeGFP+ fibroblast gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde. De video vergezelt het bovenste paneel van figuur 3C. De schaalbalk in figuur 3C is 50 μm en de organoïde is ~120 μm in diameter. VIMENTIN wordt weergegeven in wit, E-CADHERIN in rood, Pdgfrα^H2BeGFP in groen en DAPI in blauw. Klik hier om deze video te downloaden.

Video 2: DPP4+ fibroblast gewikkeld rond en in nauw contact met de organoïde. De video vergezelt het onderste paneel van figuur 3C. De schaalbalk in figuur 3C is 50 μm en de organoïde is ~120 μm in diameter. VIMENTIN wordt weergegeven in wit, E-CADHERIN in rood en DAPI in blauw. Klik hier om deze video te downloaden.

Discussie

Het hier gepresenteerde protocol stelt een in vitro model vast voor het onderzoeken van functionele oesofageale epitheel-fibroblastinteracties.

De epitheellaag is gescheiden van het stroma, waardoor een geoptimaliseerd dissociatieprotocol mogelijk is voor zowel het epitheliale als het stromale compartiment. Ondanks optimalisatie van het epitheliale dissociatieprotocol blijven weefselklonters zichtbaar. Elke 15 minuten krachtig op en neer pipetteren vermindert het aantal en de grootte van de klonten aanzienlijk. Andere protocollen gebruiken trypsine om de epitheellaag^verder te dissociëren ^5,6. Hier wordt het gebruik van trypsine, of het verder verhogen van de dissociatietijd, niet aanbevolen, omdat dit meestal resulteert in verminderde levensvatbaarheid van epitheelcellen en organoïdevormende efficiëntie. In tegenstelling tot het epitheel is het stroma gemakkelijk gedissocieerd en 30 minuten in dissociatieoplossing resulteert in een eencellige suspensie met ~ 90% fibroblast levensvatbaarheid (figuur 1E). Het uitsluiten van de epitheliale-stomale scheidingsstap in het protocol verhoogt de dissociatietijd aanzienlijk, wat resulteert in een verminderde levensvatbaarheid van fibroblasten en een lagere opbrengst van epitheelcellen. Bovendien biedt het scheiden van het epitheel van het stroma de mogelijkheid om het celaantal van elke populatie te bepalen en epitheelcellen en fibroblasten van verschillende muislijnen te mengen bij het opzetten van de co-culturen.

Het bestuderen van de fibroblastfunctie op organoïdegroei is een veelgebruikte methode in de stamcelbiologie 9,10,11,15,16. Gevestigde co-cultuur media zijn ofwel DMEM aangevuld met 10% foetaal kalf serum (FCS)^9,15 of groeifactor verlaagd medium^10,16. In dit protocol wordt het groeifactor gereduceerd medium gebruikt om de omstandigheden in de in vivo stamcelniche na te bootsen, waar fibroblasten grotendeels rustig zijn. FCS is een groeifactorrijk serum dat resulteert in activering en proliferatie van fibroblasten in de co-culturen, waarschijnlijk overeenkomend met een fibroblastceltoestand die verschilt van de in vivo toestand. Door FCS uit te sluiten en groeifactoren te verminderen, zodat het medium alleen (ER_laag) de organoïde groei niet ondersteunt en de proliferatie van fibroblasten niet stimuleert, is het mogelijk om het effect van de fibroblasten op de organoïde groei te isoleren. In dit medium wordt NOGGIN verwijderd en RSPO tot een minimum beperkt (10% RPSO). Van zowel NOGGIN als RSPO is aangetoond dat ze essentieel zijn voor de groei van slokdarmorganoïden⁶. EFG werd behouden in het cocultuurmedium, omdat het zelf de groei van organoïden niet ondersteunt. Fibroblasten zijn echter ook in staat om organoïde groei te ondersteunen in een EGF-gereduceerd medium (E laag R_laag; Figuur 2B,D).

Organoïde coculturen kunnen niet worden onderhouden door passaging, omdat fibroblasten verloren gaan tijdens trypsinisatie. Organoïde passaging werd echter opgenomen in het protocol, omdat slokdarmorganoïden kunnen worden onderhouden, uitgebreid en gebruikt voor verdere experimenten als monoculturen. Gepasseerde organoïden uit monoculturen kunnen worden gebruikt om coculturen op te zetten met vers geïsoleerde fibroblasten. Een nadeel van het gebruik van primaire cellen is het aantal muizen dat nodig is om meerdere organoïde coculturen op te zetten. Wanneer zich wordt gericht op kleine subpopulaties van fibroblasten, is het aantal verkregen coculturen beperkt. In andere protocollen worden fibroblasten eerst in cultuur uitgebreid voordat ze worden gebruikt om organoïde coculturen op te zetten¹⁰. Fibroblasten veranderen echter morfologie en identiteit tijdens het passeren, aangetoond door het gebruik van primaire huid- en hartfibroblasten^17,18. Conventionele 2D-passaging van slokdarmfibroblasten resulteert in zowel morfologie als fenotypeveranderingen, wat aantoont dat in vitro verrijking van fibroblasten niet geschikt is voor co-culturen die gericht zijn op fenocopie van de endogene stamcelniche.

Whole mount kleuring biedt een hulpmiddel om fibroblast-organoïde interactie te behouden en te visualiseren. Opgemerkt moet worden dat, hoewel niet alle organoïden fibroblasten direct aan hen hebben bevestigd, de meeste organoïden in contact komen met fibroblasten (zie figuur 2C). Om epitheliale-fibroblastinteracties te behouden, is het belangrijk om de organoïden met zorg te behandelen en krachtig pipetteren, vortexing en snel spinnen te vermijden. Optimale fixatie is belangrijk om de 3D-weefselarchitectuur te behouden en endogene fluorescentie te behouden. Een fixatie van 30 minuten volstaat om het H2BeGFP-signaal te behouden en is optimaal voor de antilichamen die in dit protocol worden gebruikt, maar dit kan variëren tussen de gebruikte fluoroforen en antilichamen. Het opruimen van de organoïden vermindert lichtverstrooiing en verbetert de visualisatie van de hele 3D-structuur aanzienlijk. Omdat de organoïden klein zijn, is het opruimen gemakkelijk en snel; het in beeld brengen van hele organoïden met behulp van laserscannende confocale microscopie kan echter tijdrovend zijn, omdat er meerdere Z-stacks moeten worden gemaakt. Confocale microscopen, zoals de draaiende schijf, kunnen worden gebruikt om de beeldvormingstijd te verkorten.

Over het algemeen bieden slokdarmorganoïden gekweekt in de aanwezigheid van fibroblasten een waardevol hulpmiddel om aspecten van de slokdarmstamcelniche te begrijpen. Bovendien biedt whole mount clearing een toegankelijke methode om de interactie tussen fibroblasten en organoïden te visualiseren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher (Gibco)	17504001
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	fisher scientific	356231
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	276855-100ML
DMEM/F-12	Thermo Fisher (Gibco)	11320074
DPBS	Thermo Fisher (Gibco)	14190250
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F7524
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher (Gibco)	35050061
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Thermo Fisher (Gibco)	14175-129
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno	017-000-121
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher (Gibco)	15140122
Triton X-100 solution	Merck	93443-100ML
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher (Gibco)	25200-056
Chemicals, Peptides, and recombinant proteins
DAPI Solution	Thermo Fisher	62248
Dissociation solution: 0.25 mg/ml Liberase TM, 0.25 mg/ml Dnase in HBSS
Dnase I	Sigma-Aldrich	11284932001
Formaldehyde, 37%, with 10-15% methanol	Sigma-Aldrich	252549-1L
Liberase	Sigma-Aldrich	5401127001
N-Acetyl-cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-25G
Noggin murine	Peprotech	250-38
RapiClear 1.47	SunJin Lab	#RC147001
Recombinant Mouse EGF Protein, CF	R&D systems	2028-EG-200
R-spondin-1 murine	Peprotech	315-32
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Thermo Fisher	S34857
Thermolysin	Sigma-Aldrich	T7902-25MG
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503-5MG
Plastic & Glassware
Corning Sterile Cell Strainers 40um	VWR	15360801
Corning Sterile Cell Strainers 70um	VWR	431751
Menzel Deckgläser/ cover slips	Thermo Fisher	Q10143263NR15
SafeSeal reaction tube, 1.5 mL, PP	Sarstedt	72.706
Snap Cap Low Retention Microcentrifuge Tubes 0.6 mL	Thermo Fisher	3446
SuperFrost Slides	VWR	631-9483
Tools
0.05 mm 4 circular well iSpacer	SunJin Lab	#IS204
Dumont #5 forceps, biology tip	F.S.T	11252-20
ImmEdge Pen	VectorLaboratories	H-4000
Spring Scissors Angled to Side Ball Tip 8mm Cutting Edge	F.S.T	15033-09
Instruments
Confocal microscope Stellaris 5	Leica
Dissection microscope ZEISS Stemi 305	Zeiss
FACS ARIA III	BD Biosciences
Conjugated Antibodies for FACS
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD104 Antibody Clone: 346-11A	123608	123608
APC anti-mouse CD26 (DPP-4) Antibody	H194-112	H194-112
PE/Cy7 anti-mouse/human CD324 (E-Cadherin) Antibody	147310	147310
Antibodies for Immunofluorescence
CD104 (β-integrin 4) Clone: 346-11A	BioLegend	553745
Cytokeratin 14	Acris Antibodies (AbD Serotec)	BP5009
Cytokeratin13 Clone: EPR3671	abcam	ab92551
E-cadherin (CD324) Clone: 2.40E+11	Cell Signaling Technology	3195
Keratin 5 Polyclonal Chicken Antibody, Purified Clone: Poly9059	BioLegend	905901
p63 Clone: 4a4	abcam	ab735
Recombinant Anti-KLF4 antibod Clone: EPR20753-25	abcam	ab214666
Vimentin	Sigma-Aldrich	AB5733
Secondary antibodies
Donkey anti-species* antibodies with fluorophore of choice	Jackson Immuno