Methodenartikel

Lichtgeïnduceerde dielectroforese voor het karakteriseren van het elektrische gedrag van menselijke mesenchymale stamcellen

4.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64909

⸱

16 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 2Department of Biomedical Engineering, Samueli School of Engineering, University of California, Irvine, 3Department of Chemistry, School of Physical Sciences, University of California, Irvine, 4Sue & Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

Hier presenteren we lichtgeïnduceerde dielectroforese als een labelvrije benadering voor het karakteriseren van heterogene cellijnen, met name menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs). Dit artikel beschrijft een protocol voor het gebruik en optimaliseren van een microfluïdisch apparaat met een fotogeleidende laag om het elektrische gedrag van hMSCs te karakteriseren zonder hun oorspronkelijke toestand te veranderen.

Samenvatting

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) bieden een van de patiënt afgeleide celbron voor het uitvoeren van mechanistische studies van ziekten of voor verschillende therapeutische toepassingen. Het begrijpen van hMSC-eigenschappen, zoals hun elektrische gedrag in verschillende rijpingsstadia, is de afgelopen jaren belangrijker geworden. Dielectroforese (DEP) is een methode die cellen in een niet-uniform elektrisch veld kan manipuleren, waarmee informatie kan worden verkregen over de elektrische eigenschappen van de cellen, zoals de celmembraancapaciteit en permittiviteit. Traditionele vormen van DEP gebruiken metalen elektroden, zoals driedimensionale elektroden, om de reactie van cellen op DEP te karakteriseren. In dit artikel presenteren we een microfluïdisch apparaat gebouwd met een fotogeleidende laag die in staat is om cellen te manipuleren door middel van lichtprojecties die fungeren als in situ virtuele elektroden met gemakkelijk aanpasbare geometrieën. Hier wordt een protocol gepresenteerd dat dit fenomeen demonstreert, genaamd light-induced DEP (LiDEP), voor het karakteriseren van hMSCs. We laten zien dat LiDEP-geïnduceerde celresponsen, gemeten als celsnelheden, kunnen worden geoptimaliseerd door verschillende parameters zoals de ingangsspanning, de golflengtebereiken van de lichtprojecties en de intensiteit van de lichtbron. In de toekomst voorzien we dat dit platform de weg kan vrijmaken voor technologieën die labelvrij zijn en real-time karakterisering van heterogene populaties van hMSCs of andere stamcellijnen uitvoeren.

Inleiding

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSCs) worden erkend voor hun immunosuppressieve eigenschappen1, die hebben geleid tot hun gebruik in therapieën voor de behandeling van een verscheidenheid aan ziekten, zoals type II diabetes2, graft versus host ziekte3 en leverziekte4. HMSC's zijn heterogeen en bevatten subpopulaties van cellen die differentiëren in adipocyten, chondrocyten en osteoblasten. HMSC's zijn afgeleid van vetweefsel, navelstrengweefsel en beenmerg, en hun differentiatiepotentiaal hangt af van het weefsel van oorsprong en het gebruikte celkweekproces5. Volgens een studie van Sakaguchi et al. hebben hMSC's afgeleid van vetweefsel bijvoorbeeld meer kans om te differentiëren in adipocyten, terwijl hMSC's afgeleid van beenmerg eerder differentiëren in osteocyten6. De impact van de weefseloorsprong van hMSCs op hun differentiatiepotentieel is echter een fenomeen dat nog verder moet worden begrepen. Bovendien dragen de gevarieerde differentiatiepotentialen van hMSCs bij aan hun inherente heterogeniteit en creëren ze uitdagingen bij het toepassen van hMSCs voor therapeutica. Als zodanig is de karakterisering, evenals het sorteren, van heterogene stamcellijnen van cruciaal belang voor het ontwikkelen van de in vitro en klinische toepassing van deze cellen. Flowcytometrie, de gouden standaardtechniek voor het onderzoeken van verschillen in cellulaire fenotypen, maakt gebruik van celoppervlakantigenen en fluorescerende kleurstoffen om doelcellen te labelen en te karakteriseren op basis van lichtverstrooiing of celspecifieke fluorescentiekenmerken 6,7,8. De nadelen van deze methode zijn de beperkte beschikbaarheid van biomarkers voor celoppervlakantigeen, de hoge kosten van de apparatuur en werking, en het feit dat de kleuring van het celoppervlak mogelijk het celmembraan kan beschadigen en therapeutische toepassingen kan beïnvloeden 9,10,11. Daarom zou het verkennen van nieuwe technieken voor celkarakterisering zonder de oorspronkelijke toestand van het celmembraan in gevaar te brengen, de klinische prestaties van stamceltherapieën ten goede kunnen komen.

Dielectroforese (DEP), een methode voor celkarakterisering die geen oppervlaktelabels gebruikt, is de focus van dit huidige werk. DEP is een labelvrije of niet-kleuringsmethode geïmplementeerd op microfluïdische platforms om heterogene populaties van cellen te karakteriseren op basis van hun elektrische eigenschappen. DEP gebruikt een wisselstroom (AC) elektrisch veld ter vervanging van fluorescentiekleuring (d.w.z. een op etiketten gebaseerde methode)7. De andere voordelen van het gebruik van op DEP gebaseerde microfluïdische apparaten voor celkarakterisering zijn het gebruik van kleine volumes (microliters), snelle analysetijd, minimale vereisten voor de voorbereiding van celmonsters, minimaal risico op monsterverontreiniging, minimale afvalproductie en lage kosten12,13. Een ander voordeel van DEP is de real-time monitoring van cellen14,15,16. Voor DEP worden cellen in suspensie blootgesteld aan een niet-uniform AC-elektrisch veld dat is gemaakt met elektroden en worden ze gepolariseerd6. Deze polarisatie veroorzaakt celbeweging en maakt celmanipulatie mogelijk op basis van de frequentie en spanning van het toegepaste AC-elektrische veld. Door de frequentie aan te passen, meestal tussen 5 kHz en 20 MHz, kunnen cellen worden aangetrokken door of afgestoten van de elektroden, wat overeenkomt met respectievelijk positief en negatief DEP-gedrag6.

Er zijn meerdere modi van DEP-karakterisering, namelijk traditioneel, veldstroomfractionering en lichtgeïnduceerd, zoals geclassificeerd door hun elektrodeconfiguratie en / of operationele strategie17. De 3DEP-analyzer, een traditionele modus van DEP, bevat fysieke metaalelektroden en bewaakt de cellulaire respons op een AC-elektrisch veld. Dit systeem maakt gebruik van een chip bestaande uit microwells met meerdere driedimensionale cirkelvormige elektroden en detecteert veranderingen in lichtintensiteiten om cel-DEP-gedrag te karakteriseren 18,19,20,21. Positieve DEP wordt waargenomen als de cellen naar de randen van de cirkelvormige elektroden langs de wanden van de microwell bewegen, wat resulteert in een verhoogde lichtintensiteit in het midden van de microwell. Negatieve DEP wordt waargenomen als cellen clusteren in het midden van de microwell weg van de cirkelvormige elektroden, wat resulteert in een verminderde lichtintensiteit in het midden van de microwell. Deze twee verschijnselen zijn weergegeven in figuur 1. Traditionele DEP-methoden hebben het vermogen om de elektrische eigenschappen van heterogene celpopulaties te karakteriseren 18,20,21. Mulhall et al. toonden bijvoorbeeld het potentieel aan om onderscheid te maken tussen normale orale keratinocyten (HOK) en kwaadaardige orale keratinocyten (H357) cellijnen op basis van verschillen in membraancapaciteit21 met behulp van de 3DEP-analyzer. Een beperking van traditionele vormen van DEP is echter de vaste elektrodegeometrie. Omdat hMSC's heterogeen zijn, is het voordelig om de elektrodegeometrieën gemakkelijk te kunnen wijzigen tijdens DEP-beoordelingen. Door bijvoorbeeld de elektroden of elektrodearrays in realtime te kunnen wijzigen voor eencellige overvulling, kunnen de cellen worden gekarakteriseerd op basis van snelheid en DEP-gedrag. De toepassing van real-time elektrodemodificatie in DEP-beoordelingen van hMSC's maakt de eencellige analyse van hMSCs mogelijk direct nadat ze uit het monsterweefsel zijn gehaald om de heterogeniteit van de steekproefpopulatie te karakteriseren.

Om de beperking van traditionele vormen van DEP (d.w.z. vaste fysieke elektroden) te overwinnen en nieuwe mogelijkheden te verkennen voor real-time elektrodeconfiguratiewijzigingen met behulp van het DEP-fenomeen, is lichtgeïnduceerde DEP (LiDEP) onderzocht. LiDEP is een niet-traditionele modus van DEP die cellen manipuleert met behulp van een fotogeleidend microfluïdisch apparaat22,23 via lichtprojecties, gelokaliseerde elektroden creëren een niet-uniform elektrisch veld, vergelijkbaar met de traditionele DEP-methode. Deze aanpak zorgt ook voor flexibiliteit in de elektrodegeometrie en voor het verplaatsen van de elektroden in het microfluïdische apparaat. Dit vermindert de beperking die wordt gezien met vaste elektroden en biedt de mogelijkheid om meer informatie te krijgen over cellulaire heterogeniteit. LiDEP is gebruikt voor het detecteren en analyseren van verschillende celtypen in homogene en heterogene populaties van cellen22,23,24. Liao et al. gebruikten LiDEP bijvoorbeeld om circulerende tumorcellen (CTC's) te scheiden die de epitheelceladhesiemodule (EpCAMneg) van rode bloedcellen tot expressie brengen om hun betekenis bij kankermetastasete onderzoeken 22. Eencellige analyse met LiDEP is met succes gebruikt om kankercellen te karakteriseren en te manipuleren met de stratificatie van pancreastumorigeniciteit23 en de analyse van CTC's in monsters vóór en na metastase24.

Hier beschrijven we hoe LiDEP kan worden gebruikt om hMSCs te manipuleren met een verscheidenheid aan elektrodegeometrieën (cirkel, diamant, ster en parallelle lijnen) en systeeminstellingen (toegepaste spanning, lichtintensiteit en microfluïdisch apparaatmateriaal), waardoor een benadering wordt geboden om het gedrag van van de mens afgeleide stamcellen met virtuele elektroden te karakteriseren.

Protocol

1. LiDEP microfluïdische apparaat fabricage

OPMERKING: Het fabricageproces bestaat uit het combineren van drie gelaagde componenten: (i) een fotogeleidende laag met amorf silicium (A:Si) en molybdeen afgezet op een indiumtinoxide (ITO) glassubstraat; ii) een microkanaallaag die is uitgesneden uit dubbelzijdige tape; en (iii) een top ITO-glassubstraat met gaten geboord voor de in- en uitlaat van de celsuspensie.

  1. Glascoating van fotogeleidend indiumtinoxide (ITO)
    1. Reinig het ITO-gecoate glassubstraat (15-20 Ω weerstand) door stikstofgas (N2) aan het oppervlak te laten stromen met een stroomsnelheid die voldoende is om zichtbare stofdeeltjes te verplaatsen. Spoel na deze stap het substraat af met aceton.
    2. Breng de ITO-gecoate glasplaat over in een isopropylalcoholbad om het acetonresidu af te spoelen, spoel af met DI-water en laat N2-gas opnieuw stromen totdat het substraat volledig droog is.
    3. Plaats de glasschuif met de ITO-gecoate kant naar boven in het vacuümsputtersysteem.
    4. Sputter een 10 nm dikke laag molybdeen op het ITO-gecoate glassubstraat (molybdeendoel) met een depositiesnelheid van 0,7 Å/s en een depositietijd van 140 s.
    5. Voeg een schaduwmasker toe aan één kant van het glazen substraat om 2 mm van de rand van het glazen substraat onbedekt te laten voor elektrische verbindingen. Deponeer 1 μm A:Si met behulp van inductief gekoppelde plasma-plasma versterkte chemische dampafzetting (ICP-PECVD), zoals beschreven in Medjdoub et al.25.
    6. Reinig de glijbaan met N2-gas om stof en andere onzuiverheden te verwijderen. Voor elke A:Si die onder het schaduwmasker wordt afgezet, dompelt u de rand tot de 2 mm markering onder in een 25% w/v kaliumhydroxideoplossing om de A:Si te etsen.
  2. Fabricage van LiDEP-chipapparaten
    1. Om het microkanaal te vormen, verkrijgt u dubbelzijdige tape (52 mm x 25 mm) en ponsgaten (diameter = 4 mm) op 5-6 mm afstand van de rand van de kortere afmeting en gecentreerd tussen de langere zijden van de tape. Gebruik een scalpel om twee rechte lijnen (3 mm uit elkaar) over de gaten te snijden. Zorg ervoor dat de beschermvellen aan beide zijden van de dubbelzijdige tape aanwezig zijn tijdens de hele microkanaalsnijstap.
    2. Boor twee gaten met een diameter van 3 mm in de bovenste ITO-glasplaat. De tape kan bovenop het ITO-gecoate glas worden uitgelijnd, waarbij de lange rand van de tape wordt uitgelijnd met de lange rand van het glas. Markeer de locatie van het gat met een afwasbare stift. Zorg ervoor dat de geboorde gaten uitlijnen met de gaten die in de dubbelzijdige tape zijn gestanst. Deze twee gaten zullen fungeren als de inlaat- en uitlaatgaten van het microfluïdische apparaat.
    3. Verwijder een kant van de beschermfolie op de dubbelzijdige tape, lijn de gaten in de tape en de bovenste ITO-glasplaat uit en druk ze tegen elkaar aan. Druk zachtjes om luchtzakken te verwijderen, vooral in de buurt van het microkanaal. Luchtzakken kunnen ervoor zorgen dat het medium of andere oplossingen onder de tape sijpelen, wat schimmel in het microfluïdische apparaat kan beschadigen of veroorzaken.
    4. Verwijder de andere beschermende film van de dubbelzijdige tape en druk op de molybdeen en A:Si-gecoate ITO-glaszijde. Stem de rand van de fotogeleidende dia die tegenover de 2 mm spelingszijde staat af op de rand van de dubbelzijdige tape die zich in het midden van de bovenste ITO-glasplaat bevindt. Er zal een kater zijn van de bovenste ITO-glasplaat en de fotogeleidende met materiaal gecoate ITO-glasplaat.
    5. Druk op een vlakke ondergrond om een goede hechting te garanderen. Een schema van de glassubstraat en dubbelzijdige tapelagen is weergegeven in figuur 1A. Knip overtollige tape aan de zijkant af.
    6. Breng kopertape aan op de randen van laag A en laag C om de functiegenerator aan te sluiten. Doe dit door de tape aan de zijkant van het ITO of fotogeleidende materiaal te wikkelen, afhankelijk van of het laag A of laag C is, vanaf de rand van de dubbelzijdige tape tot ongeveer 3 cm op de ongecoate kant van het glassubstraat.
    7. Om een succesvolle fabricage van het apparaat te garanderen, gebruikt u een multimeter om te testen op een weerstandsmeting tussen de gecoate dia's van beide glassubstraten en de kopertape die aan het glas was bevestigd.
  3. DEP-buffervoorbereiding
    1. Meet 4,25 g sucrose af en plaats deze in een conische buis van 50 ml. Meet vervolgens 0,15 g glucose af en plaats deze in dezelfde conische buis van 50 ml.
    2. Vul de conische buis met 25 ml ultrapuur water, sluit het deksel en meng. Zodra ongeveer de helft van de sucrose en glucose zijn opgelost, vult u de conische buis met ultrapuur water tot de lijn van 50 ml. Meng krachtig totdat alle sucrose en glucose zijn opgelost. DEP-bufferoplossing bevat 8,5% (m/v) sucrose en 0,3% (m/v) glucose.
    3. Verkrijg 20 ml van de bereide sucrose en glucose-oplossing en plaats deze in een conische buis van 50 ml. Meet vervolgens 0,1 g runderserumalbumine (BSA) af en plaats het in de conische buis van 50 ml met de sucrose- en glucoseoplossing. Vortex totdat het BSA is opgelost. De uiteindelijke DEP-bufferoplossing bevat 0,5% (w/v) BSA.
  4. Celvoorbereiding
    1. Verkrijg ten minste 1 x 106 cellen (hMSCs of HEK 293) gesuspendeerd in 1 ml groeimedium met behulp van het celkweekprotocol beschreven in eerdere studies26,27. Plaats de celsuspensie in een centrifugebuis van 10 ml.
    2. Centrifugeer de HEK 293-cellen op 201 x g gedurende 5 minuten en de hMSC's op 290 x g gedurende 10 minuten. Na centrifugeren, het supernatant opzuigen en de cellen resuspenderen in 1 ml van de DEP-bufferoplossing met 0,5% BSA. Zorg ervoor dat u de bufferoplossing niet te snel toevoegt, omdat er bubbels kunnen ontstaan.
    3. Herhaal het centrifugatieproces nog twee keer en resuspensie vervolgens de cellen in de DEP-buffer met 0,5% BSA voor LiDEP-karakterisering. Het vermelde celvoorbereidingsprotocol is voldoende voor 10 runs. Eén frequentietest vereist bijvoorbeeld minstens 15 runs en dus moet 2 ml cellen in een concentratie van 1 x 106 cellen / ml worden gemaakt.

2. LiDEP-karakterisering

  1. Experimentele opstelling
    1. Assembleer de volgende apparatuur voor de experimentele opstelling voor het kwantificeren van de cellulaire reacties op LiDEP: een laptop, een projector, een objectieflens, een digitale microscoop en een functiegenerator. Gebruik de laptop om de lichtprojecties (ster, diamant, drie lijnen en ovaal) te ontwerpen en sluit deze aan op de projector.
    2. Gebruik de projector als lichtbron om de lichtprojecties op het fotogeleidende oppervlak (laag C) van de LiDEP-chip weer te geven. Stel het zo in dat het licht van de lichtbron (projector) door een 10x objectieve lens naar het microkanaalgebied van de LiDEP-chip reist. De 10x objectieflens zit bovenop de projectorlens. Aanvullende figuur 1 toont de integratie van de projector in het LiDEP-systeem.
    3. Sluit de LiDEP-chip aan op de functiegenerator om het ac-elektrische veld toe te passen. Observeer de cellen die de LiDEP-kracht ervaren door de digitale microscoop te gebruiken voor beeldvorming en video-opname. Figuur 1B toont een schema van het experimentele apparaat. Volg standaard celkweekprotocollen26,27 voor alle geteste cellen.
  2. Experimentele procedures
    1. Spoel het microkanaal met 70% ethanol, gevolgd door 0,5% BSA-oplossing. Spoel het microkanaal nog twee keer met 0,5% BSA-oplossing om ervoor te zorgen dat de ethanol en eerdere cellen volledig worden weggespoeld. Cellen die al zijn blootgesteld aan het DEP-veld reageren anders dan verse cellen en kunnen de gegevensverzameling verstoren.
    2. Verwijder de 0,5% BSA-oplossing met een pipet en plaats het microfluïdische apparaat in de apparaathouder.
    3. Bevestig krokodillenklemmen aan elk van de koperen tape-aansluitingen op het apparaat. Stel de functiegenerator in op de gewenste spanning (spanning piek-tot-piek, Vpp) en frequentie (Hz). Het hier geteste frequentiebereik was 30 kHz tot 20 MHz.
    4. Voeg 70 μL celsuspensie (cellen + DEP-bufferoplossing met 0,5% BSA) toe aan het microkanaal van het apparaat. Vanwege de dunheid van het microkanaal (~ 0,05 mm) kan morsen uit de inlaat- en uitlaatgaten optreden. Om de hoeveelheid morsen te verminderen, gebruikt u een kleinere pipetpunt en kantelt u de punt iets in het gat in de richting van het microkanaal. Elke toegangsoplossing (0,5% BSA of cellen in oplossing) kan worden weggeveegd met papieren doekjes voor eenmalig gebruik en worden weggegooid in biologisch gevaarlijk afval.
    5. Projecteer de gewenste virtuele elektrodegeometrie (hier cirkels, diamanten, sterren en/of parallelle lijnen) op de LiDEP-chip.
    6. Stel in de digitale microscoopsoftware de videolengte in op 3 minuten. Stel een labtimer in op 2 min 30 s. Zodra de cellen stationair zijn in het microkanaal van de LiDEP-chip, drukt u op Start in de digitale microscoopsoftware om het video-opnameproces te starten.
    7. Wacht 10 s, druk vervolgens op de AAN-knop van de kanaaluitgang van de functiegenerator om het ac-elektrische veld toe te passen en druk op Start voor de timer. Bewaak het DEP-gedrag van de cel door de digitale microscoop en voorkom schudden of beweging rond de opstelling.
    8. Zodra de timer afgaat, drukt u op de AAN-knop van de kanaaluitgang van de functiegenerator. Hierdoor wordt de uitgang van het kanaal van de functiegenerator uitgeschakeld en wordt het elektrische veld van de wisselstroom niet langer via de elektroden geleverd. Stop de video-opname op 3 minuten en sla deze op in de digitale microscoop voor toekomstige analyse.
    9. Pipetteer de cellen uit het uitlaatuiteinde van de LiDEP-chip door langzaam 60 μL DEP-buffer met 0,5% BSA in het microkanaal te duwen en tegelijkertijd aan de uitlaat te verzamelen. Ga door totdat er weinig tot geen cellen in het microkanaal zijn.
    10. Herhaal stap 2.2.3-2.2.9 totdat alle frequenties zijn getest.

Resultaten

Spannings- en elektrodekleurtests werden voltooid met behulp van de bovenstaande procedure met een kleine variatie in stap 2.2.3 en stap 2.2.10. Voor de spanningstest bleven de kleur en frequentie van de elektrode constant en werden 5 V pp, 10 V pp en 20 Vpp toegepast. Voor de elektrodekleurtest werden de toegepaste spanning en frequentie constant gehouden op 30 kHz en 20 Vpp, en blauwe, rode, witte en gele (waarnaar wordt verwezen door HEX-kleurcodes #4472C4, #FF0000, #FFFFFF en #FFFF00, respectievelijk) geprojecteerde elektroden werden onderzocht. De levensvatbaarheid van de cel werd onderzocht door de cellen te kleuren met trypanblauw en het aantal levende en dode cellen te tellen met behulp van een hemocytometer.

Met de LiDEP-opstelling waren we in staat om de hMSCs te manipuleren en DEP-responscurven te genereren als reactie op de ingangsfrequentie, wat een manier is om het elektrische gedrag van cellen te karakteriseren. Een reeks experimenten werd uitgevoerd om de optimale bedrijfsomstandigheden te vinden door parameters zoals de toegepaste spanning en de geprojecteerde elektrodekleur (d.w.z. vormen met verschillende kleuren gemaakt met een grafische editorsoftware) te manipuleren om consistent celgedrag te observeren naar het niet-uniforme AC elektrische veld gegenereerd met de virtuele elektroden. De verzamelde gegevens voor celresponsen met LiDEP, niet-traditionele DEP, werden vergeleken met resultaten van de 3DEP-analyzer, traditionele DEP.

De eerste optimalisatietest richtte zich op de positieve DEP-respons van hMSCs (d.w.z. de cellen die naar de virtuele elektrode bewegen) in de LiDEP-chip. De cellen die geen positieve DEP-respons vertoonden, vertoonden ofwel een negatieve DEP-respons door weg te bewegen van de virtuele elektrode, waren stationair en roterend, of reageerden niet op het elektrische veld. De respons van de cellen werd gekwantificeerd door hun snelheden (μm/s) in ImageJ te volgen gedurende een periode van 2 min 30 s. Voor de virtuele elektrode werd een gele ovale projectie gebruikt en de toegepaste spanningen van 5 V pp, 10 V pp en 20 Vpp werden onderzocht bij een ingestelde frequentie van 30 kHz. We concentreerden ons op cellen die zich binnen 50 μm van de virtuele elektrode bevonden, terwijl het elektrische AC-veld was ingeschakeld voor consistentie en om uitschieters te minimaliseren. De 20 V pp resulteerde in de snelste celbeweging van de HEK 293-cellen, met een gemiddelde snelheid van 0,035 μm/s, gevolgd door 0,032 μm/s bij 10 V pp en 0,020 μm/s bij 5 Vpp, wat betekent dat deze cellen een relatief homogene controle vertegenwoordigen. Een vergelijkbare trend werd waargenomen voor hMSCs, die een gemiddelde snelheid hadden van 0,051 μm/s bij 20 V pp, 0,036 μm/s bij 10 V pp en 0,025 μm/s bij 5 V pp, zoals in figuur 2A (hier geeft * p < 0,05 aan). Bij 20 Vpp werd waargenomen dat de hMSCs tegelijkertijd positieve en negatieve DEP ervoeren. Dit werd niet waargenomen bij 10 V pp en 5 V pp. De levensvatbaarheidsbevindingen van de hMSCs na het ervaren van de DEP-kracht toonden aan dat hogere spanningen over het algemeen resulteerden in een lagere levensvatbaarheid van de cel, waarbij 66% van de cellen levensvatbaar was bij 5 V pp, 58% van de cellen levensvatbaar bij 10 V pp en 57% van de cellen levensvatbaar bij 20 V pp, zoals in figuur 2B (hier geeft ** p < 0,01 aan).

Omdat LiDEP een optisch gebaseerd systeem is, zijn de lichtintensiteit en elektrodekleur parameters die gemakkelijk kunnen worden afgestemd om de prestaties van de LiDEP-chip te regelen. Hier werden verschillende elektrodekleuren (wit, geel, rood en blauw) gegenereerd op basis van de vorm die werd geprojecteerd geëvalueerd om het effect op de DEP-responsen van de cellen te bepalen. HEK 293-cellen en hMSCs werden geëvalueerd bij 20 Vpp en 30 kHz. Er werd gekozen voor wit-, geel-, rood- en blauwgekleurde elektroden, maar de verlichting door de LiDEP-chip werd beïnvloed door de fotogeleidende laag, die een roodoranje kleur had. De geprojecteerde witte elektrode leek dus geel met een witte binnenkant, de rode elektrode leek oranje met een rode omtrek en de blauwe elektrode leek lichtgroen (figuur 3A-D). De vermogens voor deze vier kleuren waren als volgt: 77,7 μW ± 0,7 μW, 92,7 μW ± 1,3 μW, 21,9 μW ± 0,2 μW en 56,7 μW ± 0,9 μW voor respectievelijk wit, geel, rood en blauw. Dit suggereert sterk dat geel en wit het sterkste DEP-veld hadden, terwijl blauw en rood zwakker waren, zoals in figuur 3E (hier geeft *** p < 0,001 aan voor HEK 293-cellen en ** geeft p < 0,01 aan voor hMSCs). Stationaire rotatie van de cellen aan de randen van de gele en witte virtuele elektroden tijdens de toepassing van de DEP-kracht werd ook waargenomen. Voor alle elektrodekleurvariaties traden gelijktijdige negatieve en positieve DEP-responsen op, die correleerden met wat werd getoond bij 20 Vpp voor de spanningstest. Bovendien, terwijl de snelheid van de cellen varieerde op basis van de elektrodekleur, reageerden bijna alle cellen binnen de 50 μm-grens op LiDEP. De grootte van de hMSCs werd gemeten als 19,2 μm ± 5,8 μm.

Om het vermogen van LiDEP in vergelijking met DEP met conventionele elektroden te beoordelen, beoordeelden we de verschillen tussen het DEP-gedrag van cellen die LiDEP gebruiken en dat van cellen die zijn geanalyseerd door de 3DEP-analyzer. De DEP-respons van hMSCs werd gemeten in een DEP-bufferoplossing met lage geleidbaarheid met 0,5% BSA (~100 μS/cm). Om de 3DEP-analyzer na te bootsen, werd een enkele ovale gele virtuele elektrode geprojecteerd op 10 Vpp. Het DEP-gedrag van de hMSCs werd gekarakteriseerd van 30 kHz tot 20 MHz. Bij frequenties lager dan 25 kHz zagen we elektrolyse, wat resulteerde in bellenvorming aan het oppervlak van de metaallaag in het microfluïdische apparaat. Voor LiDEP ervoeren de hMSC's bij lagere frequenties een positieve DEP-kracht, zoals in figuur 4A, weergegeven als het percentage cellen dat wordt aangetrokken door de virtuele elektrode. De cellen begonnen met een sterke positieve DEP-kracht, die verzwakte naarmate de frequentie toenam. De cellen ervoeren de sterkste positieve DEP-kracht van 30 kHz tot 97 kHz. Na het toepassen van het AC-elektrische veld op deze frequenties, reageerden sommige cellen niet meer, terwijl andere cellen negatief DEP-gedrag vertoonden. Deze trend wijkt af van de waargenomen respons gekwantificeerd met behulp van de 3DEP-analyzer; de cellen namen toe in positieve DEP van 37 kHz tot 255 kHz en daalden in positieve DEP van 1.772 kHz tot 20 MHz, zoals in figuur 4B.

figure-results-1
Figuur 1: Experimentele opstelling voor het LiDEP-protocol dat hier wordt beschreven voor hMSCs. (A) Schematisch en echt beeld van de LiDEP-chip met de fotogeleidende laag en de experimentele opstelling. (B) Representatieve beelden van positieve en negatieve DEP-responsen van cellen in de 3DEP-analysator (met behulp van conventionele DEP-elektroden, boven) en schematische weergave van positieve en negatieve DEP-responsen van cellen met LiDEP (met behulp van lichtprojecties als virtuele elektroden, onder). (C) Voorbeelden van verschillende vormen die als virtuele elektroden op het apparaat kunnen worden geprojecteerd. Figuur gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Karakterisering van de DEP-responsen (snelheid) van hMSCs en hun levensvatbaarheid onder de gegeven omstandigheden. (A) De gemeten snelheden van de positieve DEP-responsen van hMSCs op 5 V pp, 10 V pp en 20 V pp. De hMSCs bewogen met 0,051 μm/s bij 20 V pp, 0,036 μm/s bij 10 V pp en 0,025 μm/s bij 5 Vpp. (B) De levensvatbaarheid van de hMSCs na het ervaren van de positieve DEP-kracht die wordt gegenereerd met virtuele elektroden. De levensvatbaarheid was 57%, 58% en 66% voor respectievelijk 20 V pp, 10 V pp en 5 Vpp. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie (SD). Statistische analyse voltooid op gepoolde datasets met behulp van t-tests (*p < 0,05 en **p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Vergelijking van de DEP-responsen tussen homogene (HEK 293) en heterogene (hMSCs) cellijnen. Positieve DEP-respons van hMSCs-cellen op (A) witte, (B) gele, (C) rode en (D) blauwe elektroden bij 20 Vpp en 30 kHz. (E) Snelheidsreacties van HEK 293-cellen en hMSCs op de verschillende gekleurde elektroden. De HEK 293-cellen vertoonden de hoogste snelheden met de gele en rode elektroden op respectievelijk 0,035 μm/s en 0,033 μm/s. De HEK 293-cellen vertoonden de laagste snelheid met de blauwe elektroden op 0,027 μm/s. De hMSC's vertoonden de hoogste snelheden met de gele en witte elektroden op respectievelijk 0,068 μm/s en 0,049 μm/s. De hMSCs ervoeren de laagste snelheid met de rode elektroden bij 0,039 μm/s. De foutbalken vertegenwoordigen de SD. Statistische analyse voltooid op gepoolde datasets met behulp van t-tests (*p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Vergelijking van de DEP-responsen van hMSCs met LiDEP en 3DEP. De DEP-responsen van hMSCs gemeten met (A) LiDEP en (B) de 3DEP-analyzer bij 10 Vpp. Bij LiDEP was er een verval in de positieve DEP-respons van de hMSCs van 30 kHz naar 20 MHz. Van de 3DEP-analyzer namen de cellen toe in positieve DEP van 37 kHz tot 255 kHz en daalden in positieve DEP van 1.772 kHz tot 20 MHz. Foutbalken vertegenwoordigen de SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1: Representatieve afbeeldingen van de LiDEP-opstelling die is gebruikt voor de experimenten in dit protocol. Ingezoomde afbeelding van het LiDEP-systeem die de integratie van de projector laat zien. Licht reist van de bron (projector) door een 10x objectieve lens naar het microkanaal van de LiDEP-chip. Het 10x objectief zit bovenop de projectorlens. Elk onderdeel is genummerd in de foto's en vermeld op de zijkant. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende video 1: Representatieve video van hMSC's die reageren op de witte, gele, rode en blauwe virtuele elektroden. De cellen worden gevisualiseerd als het ervaren van positieve DEP (bewegen naar de virtuele elektrode), het ervaren van negatieve DEP (weg bewegen van de virtuele elektrode), stationair en roterend, of niet reagerend op het elektrische veld. De hMSCs werden getest op 37 kHz en 20 Vpp, en de video werd 20x versneld. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het onderzoeken van de heterogeniteit van hMSCs is belangrijk voor hun vooruitgang in therapieën. Dit werk biedt een eerste stap voor het gebruik van LiDEP als een analytisch hulpmiddel voor de beoordeling van hMSCs. We onderzochten de spanningsafhankelijkheid van de positieve DEP-respons van cellen in LiDEP door de snelheid te kwantificeren. Er wordt verwacht dat hogere spanningen een sterkere positieve DEP-kracht zouden moeten produceren, en we hebben dit patroon waargenomen met de gemeten snelheden. De spanningen van 10 V pp en 20 Vpp waren voldoende voor de manipulatie van hMSCs met LiDEP. Lagere spanningen (d.w.z. 5 Vpp) resulteerden in langzamere celresponsen; hoewel dit niet optimaal is voor hMSCs, kan dit voordelig zijn voor andere celtypen. Er was een spanningsafhankelijke afname van de levensvatbaarheid van de hMSCs van ongeveer 9%. Dit wijkt enigszins af van de eerdere literatuur 6,12,28,29, waarin het gebruik van traditionele DEP en LiDEP bij het onderzoek van biologische cellen de levensvatbaarheid van de cel niet verminderde. Het experimentele doel in elke studie varieerde echter. Glasser en Fuhr volgden de groei van aanhangende L929-muisfibroblasten op metaalelektroden in celkweekmedium28. Omgekeerd onderzochten Lu et al. de levensvatbaarheid van neurale stamcellen blootgesteld aan AC-elektrische velden gedurende verschillende perioden12. Adams et al. karakteriseerden de diëlektrische eigenschappen van hMSCs met metaalelektroden12, en Li et al. manipuleerden leukemiecellen met LiDEP29. Het verschil tussen deze studies en de onze was het gebruik van BSA, wat de oorzaak kan zijn van de afname van de levensvatbaarheid die we hebben waargenomen. De lagere algehele levensvatbaarheid kan echter ook te wijten zijn aan de blootstellingstijd (2 min 30 s) die wordt gebruikt in het hier vastgestelde protocol. Deze tijd werd gekozen om voldoende tijd te bieden om celmanipulatie te visualiseren tijdens blootstelling aan het niet-uniforme AC-elektrische veld.

De methoden voor celkarakterisering werden getest via de elektrodekleur om de mogelijkheden en beperkingen van ons LiDEP-systeem te bepalen dat is gebouwd zoals beschreven in het protocol. In dit specifieke protocol kan de elektrodekleur worden geregeld op basis van de kleur van de vorm die wordt geprojecteerd via een grafisch editorbestand. We gebruikten vier kleuren: wit, geel, rood en blauw. Uit de vermogensafgiftemetingen voor elke kleur werden de geprojecteerde gele (#FFFF00) en witte (#FFFFFF) elektroden gemeten om hogere intensiteiten te hebben, wat de basis was van waarom deze kleuren gunstiger waren om te gebruiken in de daaropvolgende experimenten. Bovendien, vanwege de vastgestelde lichtintensiteitsafhankelijkheid van fotogeleidende materialen30,31, suggereren de resultaten dat de prestaties van LiDEP-apparaten afhankelijk zijn van fotogeleidende A: Si en kunnen worden afgestemd door de keuze van de geprojecteerde elektrodekleur. Een combinatie van positieve en negatieve DEP-responsen van hMSCs werd ook waargenomen met behulp van LiDEP, wat vergelijkbaar is met het fenomeen dat wordt gezien in traditionele DEP-methoden. Bij elke elektrodekleur ervoeren de hMSC's negatieve DEP-kracht, positieve DEP-kracht en celrotatie, wat aangeeft dat het celmonster heterogeen was bij een enkele frequentie (aanvullende video 1). Dit komt overeen met de bevindingen van Adams et al.6 dat hMSCs zowel negatief als positief DEP-gedrag vertonen bij een enkele frequentie. Deze omstandigheden (elektrodekleur, elektrodevorm en fotogeleidend materiaal) kunnen aanvullende parameters bieden voor het detecteren van het niveau van heterogeniteit in hMSC-monsters.

Ten slotte werden de resultaten van de LiDEP-beoordeling vergeleken met de resultaten van de 3DEP-analyzer als benchmark voor hMSC DEP-gedrag. Er werd een verschil waargenomen in het frequentiebereik van de positieve DEP-respons van hMSC's, maar de trends in de gegevens verzameld via LiDEP en de 3DEP-analyzer waren over het algemeen vergelijkbaar (d.w.z. de positieve DEP-respons nam af met verhoogde frequentie). Toen het ac-elektrische veld aan de LiDEP-chip werd geleverd en er licht op werd geprojecteerd, daalde de geleiding in het gebied binnen de lichtprojectie, waardoor een niet-uniform elektrisch veld ontstond. Daarom beïnvloeden de kenmerken van de lichtbron (d.w.z. intensiteit en golflengte) de verwachte respons van de cellen in de LiDEP-chip, zoals blijkt uit de resultaten van de spannings- en elektrodekleurvariatietests. Andere parameters die kunnen worden gewijzigd, zijn het materiaal van de fotogeleidende laag en de geleidbaarheid van de DEP-bufferoplossing. Als zodanig moeten de omstandigheden die worden gebruikt om het DEP-gedrag van cellen te evalueren, worden geëvalueerd op basis van de installatie van het LiDEP-systeem. Omgekeerd, voor de 3DEP-analysator, of andere methoden die metalen elektroden gebruiken om de DEP-kracht toe te passen, zijn de elektrodekarakteristieken constant en kunnen ze niet onmiddellijk worden gevarieerd om zich aan te passen aan wat nodig is voor de onderzochte cellen. Deze variatie van het positieve DEP-gedrag kan gunstig zijn voor toekomstig onderzoek naar de karakterisering van verschillende celtypen binnen hMSC-monsters, eencellige analyse of celsortering. Bovendien, naarmate de cellen verder van de virtuele elektroden verwijderd raken, wordt het AC-elektrische veld zwakker. Met de 3DEP-analyzer of andere traditionele DEP-modi die metaalelektroden gebruiken, kan echter een groter elektrisch veldgebied worden toegepast, waardoor meer cellen kunnen worden gemanipuleerd. Daarom ondervonden minder cellen per LiDEP-experiment de effecten van het AC-elektrische veld in het microkanaal van de LiDEP-chip. Verdere discrepanties kunnen worden veroorzaakt door veranderingen in de prestaties van het apparaat in de loop van de tijd (d.w.z. 2 uur of 3 uur), die nog steeds worden onderzocht. De constante stroom van water, ethanol en DEP-bufferoplossing kan het oppervlak van de microkanaallaag (d.w.z. het fotogeleidende materiaal) afbreken en moet worden overwogen. De prestaties van het apparaat in de loop van de tijd voor celkarakterisering moeten ook worden overwogen voor het uitgebreide gebruik van één LiDEP-chip. Wijzigingen in de experimentele parameters in real-time duurden slechts enkele seconden tot minuten. De kleur en geometrieën van de elektrode werden onmiddellijk aangepast met behulp van instellingen in de grafische editorsoftware.

Samenvattend demonstreert dit artikel de mogelijkheden van LiDEP om een cellijn met heterogene celpopulaties zoals hMSCs te manipuleren en te karakteriseren. Met behulp van deze opstelling en het beschreven protocol waren we in staat om de succesvolle karakterisering van hMSCs te bereiken onder de omstandigheden van 20 Vpp en geprojecteerde virtuele gele elektroden. Toekomstige studies moeten zich richten op het aanpassen van de blootstellingstijd van de hMSCs aan het AC-elektrische veld gecreëerd via LiDEP, het verhogen van de lichtintensiteit van de virtuele elektroden en het beoordelen van verschillende bronnen van hMSCs (of andere stamcelpopulaties) om een LiDEP-catalogus te ontwikkelen van de elektrische handtekeningen van heterogene stamcelpopulaties.

Openbaarmakingen

De auteurs melden geen belangenconflicten.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Science Foundation CAREER award (2048221) via CBET. We willen graag Mo Kebaili van de Integrated Nanosystems Research Facility (INRF) van de UCI bedanken. Daarnaast willen we Dr. Devin Keck bedanken voor zijn hulp bij de ontwikkeling van het LiDEP-systeem.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin-EDTAGibco25300054
10x objectiefAmScope---
Amorf silicium (A:Si)Millipore SigmaS5130
Antibiotic-Antimycotic (100X)Gibco15240-062
Rundserum Albumine (BSA)FisherBP9706-100
KopertapeZehheBF4964
Dextrose (glucose)FisherD16-1
Digitaal microscoopKeyenceVHX-7000
Dubbelzijdig plakbandInsulectroFLX000484
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS)Gibco14190-144
Fetaal rundserum (FBS)Corning35-011-CV
FunctiegeneratorTektronixAFG 31102
Grafische editor softwareMicrosoft Office Powerpoint---
Indium tin oxidec gecoate glazen platenMSE SuppliedGL0333
L-Alanyl-L-GlutamineATCCPCS-999-034
LaptopDellInspiron 14, 2-in-1
Mesenchymale Stamcel BasismediumATCCPCS-500-030
Mesenchymale Stamcel Groei Kit voor navelstreng- en vetweefsel afkomstig uit navelstrengATCCPCS-500-040
Minimum Essentieel Medium Alpha (MEM a, 1X)GibloA10490-01
Molybdeen, 99.95%Kurt J. LeskerEJTMOXX352A4Sputtering doelwit
Fenol RoodSigmaP5530
Vermogen MeterThor LabsS130VC/PM400
ProjectorVecupoi---
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 MediaGibco11875-093Dit medium heeft L-Glutamine en Fenol Rood.
SucroseFisherBP220-1
Trypan Blauw VlekGibco15250-0610.40%
Trypsine NeutralizerGibcoR002100
Vacuum Sputtering SysteemDentonDV-502M

Referenties

  1. Mahla, S. R. Stem cells applications in regenerative medicine and disease therapeutics. International Journal of Cell Biology. 2016, (2016).
  2. Bhansali, A. Efficacy of autologous bone marrow-derived stem cell transplantation in patients with type 2 diabetes mellitus. Stem Cells and Development. 18 (10), 1407-1416 (2009).
  3. Bouchlaka, M. N. Human mesenchymal stem cell-educated macrophages are a distinct high IL-6-producing subset that confer protection in graft-versus-host-disease and radiation injury models. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 23 (6), 897-905 (2017).
  4. Alfaifi, M., Eom, Y. W., Newsome, P. N., Baik, S. K. Mesenchymal stromal cell therapy for liver diseases. Journal of Hepatology. 68 (6), 1272-1285 (2018).
  5. Oswald, J. Mesenchymal stem cells can be differentiated into endothelial cells in vitro. Stem Cells. 22 (3), 377-384 (2004).
  6. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis and rheumatism. 52 (8), 2521-2529 (2005).
  7. Poirier, J. T. Chapter 5 - Genetic profiling of tumors in PDX models. In Patient Derived Tumor Xenograft Models: Promise, Potential and Practice. Uthamanthil, R., Tinkey, P. , Academic Press. Cambridge, MA. 149-159 (2017).
  8. Sino Biological. Fluorescence-activated cell sorting (FACS). , Available from: https://www.sinobiological.com/category/fcm-facs-facs (2023).
  9. González-González, M., Vázquez-Villegas, P., García-Salinas, C., Rito-Palomares, M. Current strategies and challenges for the purification of Stem Cells. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 87 (1), 2-10 (2011).
  10. Flanagan, A. L. Unique dielectric properties distinguish stem cells and their differentiated progeny. Stem Cells. 23 (3), 656-665 (2007).
  11. Vykoukal, J., Vykoukal, D. M., Freyberg, S., Alt, E. U., Gascoyne, P. R. C. Enrichment of putative stem cells from adipose tissue using dielectrophoretic field-flow fractionation. Lab on a Chip. 8 (8), 1386-1393 (2008).
  12. Adams, T. N. G., Turner, P. A., Janorkar, A. V., Zhao, F., Minerick, A. R. Characterizing the dielectric properties of human mesenchymal stem cells and the effects of charged elastin-like polypeptide copolymer treatment. Biomicrofluidics. 8 (5), (2014).
  13. Wu, H. W., Lin, C. C., Lee, G. B. Stem cells in microfluidics. Biomicrofluidics. 5 (1), (2011).
  14. Adams, T. N. G. Label-free enrichment of fate-biased human neural stem and progenitor cells. Biosensors and Bioelectronics. 152, 111982(2020).
  15. Zhao, K., Larasati,, Duncker, B. P., Li, D. Continuous cell characterization and separation by microfluidic alternating current dielectrophoresis. Analytical Chemistry. 91 (9), 6304-6314 (2019).
  16. Song, H. Continuous-flow sorting o stem cells and differentiation products based on dielectrophoresis. Lab on a Chip. 15, 1320-1328 (2015).
  17. Khoshmanesh, K., Nahavandi, S., Baratchi, S., Mitchell, A., Kalantar-Zadeh, K. Dielectrophoretic platforms for bio-microfluidic systems. Biosensors and Bioelectronics. 26 (5), 1800-1814 (2010).
  18. Hoettges, K. F. Ten-second electrophysiology: Evaluation of the 3DEP platform for high-speed, high-accuracy cell analysis. Scientific Reports. 9, 19153(2019).
  19. Hubner, Y., Hoettges, K. F., Kass, G. E. N., Ogin, S. L., Hughes, M. P. Parallel measurements of drug actions on Erythrocytes by dielectrophoresis, using a three-dimensional electrode design. IEE Proceedings - Nanobiotechnology. 152 (4), 150-154 (2005).
  20. Hoettges, K. F. Dielectrophoresis-activated multiwell plate for label-free high-throughput drug assessment. Analytical Chemistry. 80 (9), 2063-2068 (2008).
  21. Mulhall, H. J. Cancer, pre-cancer and normal oral cells distinguished by dielectrophoresis. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401 (8), 2455-2463 (2011).
  22. Liao, C. -J. An optically induced dielectrophoresis (ODEP)-based microfluidic system for the isolation of high-purity CD45neg/EPCAMNEG cells from the blood samples of cancer patients-Demonstration and initial exploration of the clinical significance of these cells. Micromachines. 9 (11), 563(2018).
  23. McGrath, J. S. Electrophysiology-based stratification of pancreatic tumorigenicity by label-free single-cell impedance cytometry. Analytica Chimica Acta. 1101, 90-98 (2019).
  24. Chiu, T. K. Optically-induced-dielectrophoresis (ODEP)-based cell manipulation in a microfluidic system for high-purity isolation of integral circulating tumor cell (CTC) clusters based on their size characteristics. Sensors and Actuators, B: Chemical. 258, 1161-1173 (2018).
  25. Medjdoub, M., Courant, J. L., Maher, H., Post, G. Inductively coupled plasma - plasma enhanced chemical vapor deposition silicon nitride for passivation of InP based high electron mobility transistors (HEMTs). Material Science and Engineering: B. 80 (1-3), 252-256 (2001).
  26. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells; Normal, human. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/pcs-500-010 (2023).
  27. 293 [HEK-293]. , ATCC. Available from: https://www.atcc.org/products/crl-1573 (2023).
  28. Glasser, H., Fuhr, G. Cultivation of cells under strong ac-electric field-differentiation between heating and trans-membrane potential effects. Bioelectrochemistry and Bioenergetics. 47 (2), 301-310 (1998).
  29. Li, B. Implementation of flexible virtual microchannels based on optically induced dielectrophoresis. Nanotechnology. 33, 295102(2022).
  30. Schellenberg, J. J., Kao, K. C. On the relationship between photoconductivity and light intensity in solids. Journal of Physics D: Applied Physics. 21, 1764-1768 (1988).
  31. Aoyagi, Y., Masuda, K., Namba, S. Explaination of light-intensity dependence of photoconductivity in zinc phthalocyanine. Journal of Applied Physics. 43, 249-251 (1972).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DielektroforesemethodeMicrofluidisch apparaatVirtuele elektrodenElektrisch celgedragCelmembraancapaciteitMeting van cellevensvatbaarheidElectrorotatieReal time celkarakterisering

Gerelateerde artikelen