Methodenartikel

Het meten van de diameter van het netvliesvat van fluorescerende angiografiebeelden van muizen

DOI:

10.3791/64964

⸱

19 mei 2023

 ,  , 
1Department of Physiology, Biomedical Center, Faculty of Medicine, University of Iceland, 2Department of Ophthalmology, National University Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het retinale vaatstelsel van muizen is bijzonder interessant voor het begrijpen van de mechanismen van vasculaire patroonvorming. Dit protocol meet automatisch de diameter van de retinale vaten van muizen op basis van fluorescerende angiografie-fundusbeelden op een vaste afstand van de optische schijf.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het is belangrijk om de ontwikkeling van retinale vasculatuur te bestuderen bij retinopathieën waarbij abnormale vaatgroei uiteindelijk kan leiden tot verlies van het gezichtsvermogen. Mutaties in het gen voor microftalmie-geassocieerde transcriptiefactor (Mitf) vertonen hypopigmentatie, microftalmie, retinale degeneratie en in sommige gevallen blindheid. In vivo beeldvorming van het netvlies van muizen met niet-invasieve middelen is van vitaal belang voor oogonderzoek. Gezien zijn kleine formaat is het beeldvormen van de fundus-mythese van muizen echter moeilijk en kan het gespecialiseerde hulpmiddelen, onderhoud en training vereisen. In deze studie hebben we een unieke software ontwikkeld waarmee de diameter van het netvlies bij muizen kan worden geanalyseerd met een geautomatiseerd programma dat is geschreven in MATLAB. Fundusfoto's werden verkregen met een commercieel funduscamerasysteem na een intraperitoneale injectie van een fluoresceïnezoutoplossing. Beelden werden gewijzigd om het contrast te verbeteren, en het MATLAB-programma maakte het mogelijk om de gemiddelde vasculaire diameter automatisch te extraheren op een vooraf gedefinieerde afstand van de optische schijf. De vasculaire veranderingen werden onderzocht bij wildtype muizen en muizen met verschillende mutaties in het Mitf-gen door de diameter van het netvlies te analyseren. Het op maat geschreven MATLAB-programma dat hier is ontwikkeld, is praktisch, gemakkelijk te gebruiken en stelt onderzoekers in staat om de gemiddelde diameter en de gemiddelde totale diameter, evenals het aantal bloedvaten van het netvlies van de muis, gemakkelijk en betrouwbaar te analyseren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Misschien wel het meest onderzochte vaatbed in het lichaam is het retinale vaatstelsel. Met een steeds betere technische verfijning kan het vaatstelsel van het netvlies gemakkelijk worden gefotografeerd bij levende patiënten en in veelonderzoeksgebieden worden gebruikt. Bovendien is het retinale vaatstelsel van muizen tijdens de ontwikkeling een zeer effectief modelsysteem gebleken voor onderzoek naar de fundamentele biologie van vasculaire groei. Het primaire doel van het retinale vaatstelsel is om het binnenste deel van het netvlies metabolische ondersteuning te bieden via een laminair capillair netwerk dat het neurale weefsel doordringt. Niettemin kan de toestand van het netvlies, en bijgevolg elke disfunctie of atrofie, aanzienlijke effecten hebben op zowel de vertakkingen van het netvlies als de diameter van de slagaders, wat een samenspel tussen de netvliescellen en het vaatstelsel aantoont 3,4. Het is bekend dat tal van oogaandoeningen, waaronder retinopathie van prematuriteit (ROP), diabetische retinopathie (DR), leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), glaucoom en neovascularisatie van het hoornvlies, kunnen leiden tot abnormale oculaire angiogenese. In het geval van het retinale vaatstelsel vertonen muismodellen van retinale degeneratie vaak veranderingen die vergelijkbaar zijn met die welke worden gezien bij menselijke vaatziekten 6,7. De Myc-supergenfamilie van fundamentele helix-loop-helix-zipper-transcriptiefactoren omvat het gen voor microftalmie-geassocieerde transcriptiefactor (Mitf) dat tot expressie komt in het retinale pigmentepitheel (RPE)8,9,10.

Van talrijke organen, waaronder het oog, het oor, het immuunsysteem, het centrale zenuwstelsel, de nieren, de botten en de huid, is aangetoond dat ze worden gereguleerd door Mitf 9,11,12,13. We hebben ontdekt dat de structuur en functie van de RPE worden beïnvloed bij muizen die verschillende mutaties in het Mitf-gen dragen, wat resulteert in sommige gevallen van retinale degeneratie enuiteindelijk verlies van het gezichtsvermogen. Onlangs is aangetoond dat het aantal vaten en de diameter van de vaten aanzienlijk verschillen tussen Mitf-mutante en wildtype muizen14. Onderzoekers en artsen kunnen nu het retinale vaatstelsel in vivo nauwkeurig kwantificeren als gevolg van ontwikkelingen in de beeldvorming van het netvlies. Sinds de jaren 1800 hebben onderzoekers en artsen geprofiteerd van het voordeel van het visualiseren van het retinale vaatstelsel, en fluoresceïne-angiografie (FA) heeft zowel de netvliesbloedstroom als de afbraak van de bloed-retinale barrière aangetoond15.

Dit artikel laat zien hoe u de diameter van het netvlies van FA-afbeeldingen van muizen kunt analyseren met een op maat geschreven code in MATLAB-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimenten werden goedgekeurd door de IJslandse Voedsel- en Veterinaire Autoriteit (MAST-licentie nr. 2108002). Alle dierstudies zijn uitgevoerd volgens de Verklaring van de Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research. Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J en Mitfmi-vga9/+ muizen werden in deze studie gebruikt. C57BL/6J muizen (n = 7) werden gebruikt als controle. De wilde typen werden commercieel verkregen (zie Materiaaltabel), maar alle gemuteerde muizen (n = 7) werden gefokt en grootgebracht in dierenfaciliteiten in het Biomedisch Centrum van de Universiteit van IJsland. In de huidige studie werden dieren van 3 maanden oud gebruikt; Het protocol is echter ook van toepassing op dieren van 1 maand en ouder.

1. Experimentele voorbereiding

  1. Bereid het anesthesiemengsel voor. Neem een ampul van een ketamine-stockoplossing van 2 ml (25 mg/ml) en 250 μl xylazine-stockoplossing (2%) om een werkoplossing van ketamine/xylazine-mengsel (25 mg/ml ketamine en 20 mg/ml xylazine) te bereiden (zie materiaaltabel).
  2. Verdoof de muis met een intraperitoneale injectie van het ketamine/xylazine-mengsel, met een vloeistofvolume dat vier keer zo groot is als het lichaamsgewicht van de muis; Een muis met een gewicht van 20 g heeft bijvoorbeeld 35 μL xylazine/ketamine-werkoplossing nodig om een werkdosis xylazine (4 mg/kg lichaamsgewicht) en ketamine (40 mg/kg lichaamsgewicht) te verkrijgen.
  3. Verwijd de pupillen met een oogdruppel van 10% fenylefrinehydrochloride en 1% tropicamide onmiddellijk na anesthesie.
  4. Wacht tot het dier volledig verdoofd is en de pupillen wijd verwijd zijn.
  5. Bereid een fluoresceïnezoutoplossing voor. Voeg 9 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; 1x) toe aan 1 ml fluoresceïneoplossing (100 mg/ml bouillonconcentratie) (zie materiaaltabel). De uiteindelijke concentratie van de werkoplossing is 10 mg/ml.

2. In vivo beeldvorming van het netvlies met behulp van een knaagdierbeeldvormingssysteem voor het netvlies

  1. Fluoresceïne werkoplossing intraperitoneaal (5 μL/g lichaamsgewicht) toedienen aan het verdoofde dier.
  2. Breng een druppel 2% methylcellulosegel aan op het oppervlak van het hoornvlies en plaats het dier vervolgens op de positioneringstafel van het beeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel).
  3. Plaats de retinale beeldvormende fundus-cameralens om het hoornvlies van de muis direct en voorzichtig aan te raken. Om de oogzenuwkop in het midden van het gezichtsveld te plaatsen, past u de uitlijning iets aan.
  4. Schakel over naar het groene fluorescerende kanaal op de funduscamera.
  5. Stel scherp op de netvliesvaten om foto's te maken.
  6. Om het ideale tijdstip te vinden, maakt u een aantal foto's op 1, 3, 5 en 10 minuten (maar niet langer dan 10 minuten) na de fluoresceïne-injectie.
    OPMERKING: De FA-behandeling moet binnen 10 minuten worden voltooid, omdat na die tijd de fluoresceïne te diffuus kan worden en de bloedvaten niet meer detecteerbaar worden.
  7. Na voltooiing van de beeldvorming, terwijl de muis nog verdoofd is, euthanaseert u deze door cervicale dislocatie.

3. Analyse van de diameter van het netvlies

  1. Open het MATLAB-programma (zie Materiaaltabel).
  2. Download en bewaar de code "fundusDiameter.m" (zie Aanvullend coderingsbestand 1, Aanvullend coderingsbestand 2 en Aanvullend coderingsbestand 3).
  3. Open de map waarin de code is opgeslagen. Sleep de code en plaats deze over de huidige map in MATLAB.
  4. Sleep de FFA-afbeelding (fundus, fluorescentie, angiografie-afbeelding) of afbeeldingen die u wilt analyseren neer over de huidige map in MATLAB.
  5. Druk op de tool Uitvoeren in de MATLAB-werkbalk.
  6. Er verschijnt een pop-upvenster. Typ de bestandsnaam van de afbeelding in het vak Bestandsnaam invoeren en druk op OK.
    OPMERKING: Wijzig of wijzig de rest van de parameters niet.
  7. Selecteer het midden van de optische schijf en selecteer vervolgens de rand van de optische schijf. De software berekent nu de intensiteit van pixels in de fundusbeelden van de muis in een cirkel met een straal die twee keer zo groot is als die van de optische schijf, met de klok mee vanaf het midden van de optische schijf (Figuur 1).
  8. Zorg er vervolgens voor dat de software de gemiddelde vaatdiameter (in pixels) van elk vat in de fundus uitzet als functie van het aantal vaten (Figuur 2).
  9. Zorg er vervolgens voor dat de software de meetgegevens voor elk vaartuig overzet naar een Excel-document, waar het gemiddelde, de mediaan en de standaarddeviatie van deze waarden worden berekend (tabel 1 en tabel 2).
  10. Verplaats de waarden uit de resultatentabel naar een spreadsheetprogramma door alle waarden in de tabel te selecteren. Plak de waarden in de spreadsheet.
  11. Teken de grafieken en voer statistische analyses uit met behulp van de gegevens die in een spreadsheetprogramma naar keuze zijn geplakt (zie Materiaaltabel).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 toont het proces dat wordt gebruikt om het retinale vaatstelsel te analyseren, dat wordt toegepast op FFA-beelden van muizen van alle geteste muizen. Een straal die twee keer zo groot is als de optische schijf wordt gebruikt om de intensiteit van pixels in een cirkelvormige richting met de klok mee te meten vanaf het midden van de optische schijf. Het markeert pixels met een begin- of eindpunt wanneer het respectievelijk punten boven en onder een door de gebruiker opgegeven drempel ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige artikel is het eerste dat een methode presenteert om de diameter van het netvlies en het vaatstelsel van het netvlies te analyseren op basis van FA-beelden van muizen. Aangezien alleen fundusbeeldvorming werd gebruikt om beelden van het netvlies vast te leggen, heeft de methode verschillende nadelen, waarvan er één is dat men alleen veranderingen in de oppervlakkige lagen van dat netvliesvasculatuur kan afleiden bij de muizen die in deze studie zijn onderzocht; Eventuele verschillen in de diepere lagen zijn n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door een Postdoctoral Fellowship-beurs van het Icelandic Research Fund (217796-052) (A.G.L.) en het Helga Jónsdóttir and Sigurlidi Kristjánsson Memorial Fund (A.G.L en T.E.). De auteurs danken prof. Eiríkur Steingrímsson voor het ter beschikking stellen van de muizen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1% Tropicamide (Mydriacyl)Alcon Inc LaboratoriesMydriaticum
2% MethocelOmniVision Eye CareHydroxypropryl methylcellulose gel
C57BL/6JJackson Laboratory000664Wild type muizen
Excel for Microsoft 365Microsoft IncSoftwarepakket
Fluoresceïne natriumzoutSigma-Aldrich28803-100GFluorescente angiografie
Matlab 8.0The MathWorks, Inc.Softwarepakket
Micron IV rodent fundus cameraPhoenix-Micron40-2200Fundusfotografie
Fenylephrine 10% w/vBausch & LombMydriaticum
Fosfaat Buffered Saline - 100 tablettenGibco18912-014Verdunning
Sigmaplot 13Jandel Scientific SoftwareSoftwarepakket
S-Ketamine, 25 mg/mLPfizer Inc.PAA104470Anesthesie IP

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheung, C. Y., Ikram, M. K., Chen, C., Wong, T. Y. Imaging retina to study dementia and stroke. Progress in Retinal and Eye Research. 57, 89-107 (2017).
  2. Selvam, S., Kumar, T., Fruttiger, M. Retinal vasculature development in health and disease. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 1-19 (2018).
  3. Ma, Y., et al. Quantitative analysis of retinal vessel attenuation in eyes with retinitis pigmentosa. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (7), 4306-4314 (2012).
  4. Eysteinsson, T., Hardarson, S. H., Bragason, D., Stefansson, E. Retinal vessel oxygen saturation and vessel diameter in retinitis pigmentosa. Acta Ophthalmologica. 92 (5), 449-453 (2014).
  5. Al-Latayfeh, M., Silva, P. S., Sun, J. K., Aiello, L. P. Antiangiogenic therapy for ischemic retinopathies. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (6), 006411(2012).
  6. Wang, S., Villegas-Perez, M. P., Vidal-Sanz, M., Lund, R. D. Progressive optic axon dystrophy and vacuslar changes in rd mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (2), 537-545 (2000).
  7. Liu, H., et al. Photoreceptor cells influence retinal vascular degeneration in mouse models of retinal degeneration and diabetes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (10), 4272-4281 (2016).
  8. Steingrimsson, E., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Melanocytes and the microphthalmia transcription factor network. Annual Review of Genetics. 38, 365-411 (2004).
  9. Arnheiter, H. The discovery of the microphthalmia locus and its gene. Mitf. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (6), 729-735 (2010).
  10. Garcia-Llorca, A., Aspelund, S. G., Ogmundsdottir, M. H., Steingrimsson, E., Eysteinsson, T. The microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) gene and its role in regulating eye function. Scientific Reports. 9 (1), 15386(2019).
  11. Bharti, K., Liu, W., Csermely, T., Bertuzzi, S., Arnheiter, H. Alternative promoter use in eye development: the complex role and regulation of the transcription factor MITF. Development. 135 (6), 1169-1178 (2008).
  12. Lu, S. Y., Li, M., Lin, Y. L. Mitf induction by RANKL is critical for osteoclastogenesis. Molecular Biology of the Cell. 21 (10), 1763-1771 (2010).
  13. Pillaiyar, T., Manickam, M., Jung, S. H. Recent development of signaling pathways inhibitors of melanogenesis. Cellular Signalling. 40, 99-115 (2017).
  14. Danielsson, S. B., Garcia-Llorca, A., Reynisson, H., Eysteinsson, T. Mouse microphthalmia-associated transcription factor (Mitf) mutations affect the structure of the retinal vasculature. Acta Ophthalmologica. 100 (8), 911-918 (2022).
  15. Burns, S. A., Elsner, A. E., Gast, T. J. Imaging the retinal vasculature. Annual Review of Vision Science. 7, 129-153 (2021).
  16. Wei, W., et al. Automated vessel diameter quantification and vessel tracing for OCT angiography. Journal of Biophotonics. 13 (12), e202000248(2020).
  17. Salas, M., et al. Compact akinetic swept source optical coherence tomography angiography at 1060 nm supporting a wide field of view and adaptive optics imaging modes of the posterior eye. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1871-1892 (2018).
  18. Albanna, W., et al. Non-invasive evaluation of neurovascular coupling in the murine retina by dynamic retinal vessel analysis. PLoS One. 13 (10), e0204689(2018).
  19. Moult, E. M., et al. Evaluating anesthetic protocols for functional blood flow imaging in the rat eye. Journal of Biomedical Optics. 22 (1), 16005(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

FundusbeeldvormingRetinale VasculatuurMATLAB analyseFluoresce ne injectieOptische SchijfRetinale ZiektemodellenVasculaire Diameter metingFunduscamera

Gerelateerde artikelen