Methodenartikel

Genereren van genetisch gemodificeerde Plasmodium berghei Sporozoïeten

DOI:

10.3791/64992

⸱

5 mei 2023

 , 
1Center for Tropical and Emerging Global Diseases, University of Georgia, 2Department of Cellular Biology, University of Georgia

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria wordt overgedragen door inoculatie van het sporozoietstadium van Plasmodium door geïnfecteerde muggen. Transgeen Plasmodium heeft ons in staat gesteld de biologie van malaria beter te begrijpen en heeft rechtstreeks bijgedragen aan de ontwikkeling van malariavaccins. Hier beschrijven we een gestroomlijnde methodologie om transgene Plasmodium berghei sporozoïeten te genereren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malaria is een dodelijke ziekte die wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium en wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen . Het sporozoietstadium van Plasmodium dat door muggen in de huid van gewervelde gastheren wordt afgezet, ondergaat een fase van verplichte ontwikkeling in de lever voordat klinische malaria wordt geïnitieerd. We weten weinig over de biologie van de ontwikkeling van Plasmodium in de lever; toegang tot het sporozoietstadium en het vermogen om dergelijke sporozoïeten genetisch te modificeren zijn cruciale hulpmiddelen voor het bestuderen van de aard van Plasmodium-infectie en de resulterende immuunrespons in de lever. Hier presenteren we een uitgebreid protocol voor het genereren van transgene Plasmodium berghei sporozoïeten. We modificeren P. berghei genetisch in het bloedstadium en gebruiken deze vorm om Anopheles-muggen te infecteren wanneer ze een bloedmaaltijd nemen. Nadat de transgene parasieten zich in de muggen hebben ontwikkeld, isoleren we het sporozoietstadium van de parasiet uit de speekselklieren van de mug voor in vivo en in vitro experimenten. We demonstreren de validiteit van het protocol door sporozoïeten te genereren van een nieuwe stam van P. berghei die het groen fluorescerende eiwit (GFP) subeenheid 11 (GFP11) tot expressie brengt, en laten zien hoe het kan worden gebruikt om de biologie van malaria in het leverstadium te onderzoeken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ondanks de vooruitgang in de ontwikkeling van geneesmiddelen en onderzoek naar malariapreventie en -behandeling, blijft de wereldwijde ziektelast van malaria hoog. Elk jaar sterven meer dan een half miljoen mensen aan malaria, met de hoogste sterftecijfers onder kinderen die in malaria-endemische regio's wonen,zoals Afrika ten zuiden van de Sahara. Malaria wordt veroorzaakt door de parasiet Plasmodium, die op mensen wordt overgedragen door de beet van vrouwelijke Anopheles-muggen die de parasiet in hun speekselklieren dragen. Het infectieuze stadium van Plasmodium - de sporozoïeten - wordt tijdens een bloedmaaltijd afgezet in de huid van de gewervelde gastheren en reist door de bloedbaan om levercellen te infecteren, waar ze een verplichte ontwikkeling ondergaan (pre-erytrocytaire malaria vormen) voordat ze de erytrocyten infecteren. De infectie van de erytrocyten initieert het bloedstadium van malaria en is verantwoordelijk voor het geheel van de morbiditeit en mortaliteit die met de ziekte gepaardgaan2,3.

De obligate aard van de pre-erytrocytaire ontwikkeling van Plasmodium heeft het tot een aantrekkelijk doelwit gemaakt voor profylactische inspanningen op het gebied van vaccin- engeneesmiddelenontwikkeling4. Een voorwaarde voor het bestuderen van de biologie van pre-erytrocytaire malaria, evenals de ontwikkeling van vaccins of geneesmiddelen gericht op het leverstadium, is toegang tot Plasmodium sporozoïeten. Bovendien heeft ons vermogen om genetisch gemodificeerde Plasmodium-sporozoïeten te genereren een belangrijke rol gespeeld in het succes van dergelijke onderzoeksinspanningen 5,6,7,8,9. Transgene Plasmodium-lijnen die fluorescerende of lichtgevende reportereiwitten tot expressie brengen, hebben ons in staat gesteld hun ontwikkeling in vivo en in vitro te volgen 10,11. Genetisch verzwakte parasieten (GAP's), gegenereerd door de deletie van meerdere genen in Plasmodium, zijn ook enkele van de meest veelbelovende vaccinkandidaten12,13.

Malariamodellen van knaagdieren en niet-menselijke primaten hebben ons geholpen de mechanismen van gastheer-parasietinteracties bij menselijke malaria te begrijpen vanwege de overeenkomsten in biologie en levenscyclus tussen Plasmodium-soorten 14. Het gebruik van Plasmodium-soorten die knaagdieren infecteren, maar geen mensen (bijv. P. berghei) maakt het mogelijk om de volledige levenscyclus van parasieten te behouden en infectieuze sporozoïeten te genereren voor het bestuderen van malaria in het leverstadium in een gecontroleerde omgeving met bioveiligheidsniveau 1. Er bestaan al verschillende afzonderlijke protocollen voor het genereren van transgene Plasmodium-parasieten in het bloedstadium15, infectie van muggen 16 en isolatie van sporozoïeten17. Hier schetsen we een uitgebreid protocol dat deze methodologieën combineert om transgene P. berghei-sporozoïeten te genereren en te isoleren, met de nieuwe transgene stam PbGFP11 als voorbeeld. PbGFP 11 transporteert de 11e β-streng van super-folder groen fluorescerend eiwit (GFP), GFP11, naar de parasitofore vacuole (PV) die wordt gegenereerd in de hepatocyten van de gastheer. PbGFP 11 wordt gebruikt in combinatie met transgene hepatocyten (Hepa1-6-achtergrond) die residuen tot expressie brengen die het GFP 1-10-fragment (GFP 1-10) in het cytoplasma vormen (Hepa GFP 1-10-cellen). PbGFP11 rapporteert PV-lysis in de hepatocyten van de gastheer door zelfcomplementatie en de hervorming van functioneel GFP en het groene fluorescentiesignaal18. Merk op dat GFP 11 is gecodeerd als een reeks van zeven tandemsequenties in PbGFP11 om het resulterende fluorescentiesignaal te versterken. Bij het kleuren van PbGFP11 sporozoïeten met de cytoplasmatische kleurstof CellTrace Violet (CTV), kunnen we de parasieten volgen. De lysis van dergelijke CTV-gekleurde intracellulaire parasieten zelf resulteert in lekkage van CTV in het cytoplasma van de gastheercel en kleuring van de gastheercel. Naast het visualiseren en onderscheiden van de lysis van Plasmodium PV en/of de parasiet in gastheerhepatocyten, kan dit systeem op betrouwbare wijze worden gebruikt om de immuunroutes te bestuderen die verantwoordelijk zijn voor een van deze processen, door de genetische of therapeutische verstoring van de moleculaire componenten van dergelijke routes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Al het onderzoek met gewervelde dieren in ons laboratorium werd uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en protocollen voor diergebruik van de Universiteit van Georgia.

1. Generatie van P. berghei-geïnfecteerde muizen

  1. Start een infectie in het bloedstadium bij mannelijke of vrouwelijke, 6-8 weken oude C57BL/6 (B6)-muizen met behulp van wildtype P. berghei-parasieten. Om dit te doen, brengt u gecryopreserveerd P. berghei-geïnfecteerd bloed (2 x 105 geïnfecteerde rode bloedcellen), gereconstitueerd in 400 μL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), intraperitoneaal (i.p.) over in een of twee donormuizen.
  2. Breng vers bloed dat is verzameld door retro-orbitale bloeding van de donormuizen 5 dagen na infectie (d.p.i.) over naar twee naïeve B6-muizen. Om dit te doen, verzamelt u 200 μL bloed, reconstitueert u met 300 μL PBS en injecteert u 200 μL i.p. in de ontvangende muizen. Zorg ervoor dat de parasitemie bij de donoren op dit tijdstip 2%-5%19,20 is.
  3. Monitor parasitemie zoals eerder beschreven19,20, beginnend bij 2 d.p.i. bij de ontvangers. Wanneer parasitemie varieert van 3%-5% (ongeveer 5 d.p.i.), euthanaseer dan de ontvangende muizen en verzamel vervolgens bloed door middel van een hartpunctie of retro-orbitale bloeding. Euthanaseer de muizen met behulp van kooldioxide-inhalatie gevolgd door cervicale dislocatie, of volgens de richtlijnen van de instelling.
    OPMERKING: Zodra de parasitemie meer dan 5% bedraagt, kan de transfectie-efficiëntie afnemen als gevolg van de verhoogde prevalentie van meervoudig geïnfecteerde rode bloedcellen.

2. Generatie schizonten in cultuur

  1. Verzamel bloed van de geïnfecteerde muizen in stap 1.3 (ongeveer 2 ml in totaal van twee muizen) in 5 ml Alsever's oplossing (zie Materiaaltabel) in een steriele omgeving. Voer de stappen 2.1 tot en met 3.12 uit onder steriele omstandigheden.
    OPMERKING: Steriele omstandigheden omvatten het dragen van handschoenen, het afvegen van handschoenen en oppervlakken met 70% ethanol, het gebruik van steriele verbruiksartikelen en materialen en het werken in een bioveiligheidskast.
  2. Centrifugeer het bloed gedurende 8 minuten bij 450 x g bij kamertemperatuur (RT). Gooi het supernatans weg en resuspendeer de celpellet in 10 ml volledig RPMI-medium (RPMI 1640 met 20% foetaal runderserum [FBS] en 1% penicilline-streptomycine, v/v).
  3. Centrifugeer gedurende 8 minuten bij 450 x g bij RT. Resuspendeer de pellet in 25 ml volledig RPMI-medium en breng over naar een T75-kweekkolf met een filterdop.
  4. Plaats in een incubator bij 36,5 °C en 5% CO2 , terwijl u zachtjes schudt om de cellen gedurende 16 uur in suspensie te houden.
  5. Controleer op het tijdstip van 16 uur op de ontwikkeling van schizont. Om dit te doen, verzamelt u 500 μL van het monster, centrifugeert u gedurende 8 minuten bij 450 x g , resuspendeert u de pellet in 10 μL volledige RPMI-media en bereidt u een dun bloeduitstrijkje voor. Kleur het bloeduitstrijkje met Giemsa-kleuring19 (zie Tabel met materialen) en bepaal de frequentie van schizonten (Figuur 1).
  6. Voor een optimale transfectie-efficiëntie moet 60%-70% van de parasieten zich in het schizontstadium bevinden. Als er minder dan deze drempelwaarde wordt vastgesteld, ga dan door met kweken zoals in stap 2.4 en controleer elk uur of de bovenstaande drempel is overschreden voordat u verder gaat.

3. Transfectie van Plasmodium schizonts

  1. Bereid een gradiëntcentrifugatiebuffer voor door 13 ml dichtheidsgradiëntvoorraadmedium (zie materiaaltabel) te reconstitueren met 1,44 ml 1,5 M NaCl en 5,6 ml 0,15 M NaCl in een centrifugatiebuis van 50 ml.
  2. Breng 25 ml bloedkweek over in een verse centrifugatiebuis van 50 ml. Laag voorzichtig 20 ml gradiëntcentrifugatiebuffer op de bodem van de centrifugatiebuis met behulp van een smalle glazen pipet om een gradiëntkolom te creëren. Zorg ervoor dat u de vloeistoflagen en grensvlakken niet verstoort en zorg voor een duidelijke scheiding tussen de buffer en de media.
  3. Centrifugeer gedurende 20 minuten op 450 x g zonder rem bij RT. Verwijder met een pasteurpipet voorzichtig de schizontlaag15 die zich op het grensvlak van de kweekmedia en de gradiëntcentrifugatiebuffer bevindt en plaats deze in een nieuwe centrifugatiebuis van 50 ml.
  4. Resuspendeer de geïsoleerde schizonten in volledige RPMI-media en breng het totale volume op 40 ml. Centrifugeer bij 450 x g gedurende 8 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
  5. Resuspendeer de schizonten in 10 ml volledige RPMI-media. Breng vervolgens 1 ml van deze oplossing over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml voor elke transfectie en centrifugeer gedurende 5 seconden bij 16.000 x g om de geïnfecteerde rode bloedcellen te pelleteren. De geïnfecteerde rode bloedcellen die op de bovenstaande manier van twee muizen zijn afgeleid, kunnen voor maximaal 10 afzonderlijke transfecties worden gebruikt.
  6. Combineer 100 μl van de elektroporatiebuffer (nucleofectoroplossing uit de elektroporatiekit; zie materiaaltabel) bij RT met 5 μg circulair of gelineariseerd doelplasmide-DNA (in een volume van maximaal 10 μl), al naar gelang van toepassing voor elke transfectie in afzonderlijke microcentrifugebuisjes van 1,5 ml. Een "geen plasmide"-monster moet worden opgenomen als controle voor transfectie en antibioticaselectie.
  7. Verwijder het supernatans na centrifugeren uit stap 3.5 en resuspendeer de geïnfecteerde rode bloedcellen voorzichtig in de bereide nucleofectoroplossing + plasmide-DNA (uit stap 3.6).
  8. Breng de suspensie (nucleofectoroplossing + plasmide + schizonten; maximaal 110 μl) over in elektroporatiecuvetten. Transfect met behulp van een geschikt nucleofectorprogramma (U-033, zie Tabel met materialen).
    NOTITIE: Zorg ervoor dat stap 3.8 tot 3.10 bij RT wordt uitgevoerd.
  9. Voeg 100 μl volledig RPMI-medium toe aan de cuvet en breng de volledige oplossing (nu 200 μl totaal volume) over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en houd op RT.
  10. Injecteer de 200 μL-oplossing van getransfecteerde parasieten intraveneus (i.v.) in muizen, waarbij de tijd tussen transfectie en de uiteindelijke injectie bij muizen wordt geminimaliseerd.
    OPMERKING: Getransfecteerde schizonten worden minder dan 5 minuten na elektroporatie in muizen geïnjecteerd om de efficiëntie van het protocol te maximaliseren.

4. Selectie van de getransfecteerde parasieten

  1. Controleer de parasitemieniveaus bij de muizen die zijn ingeënt met de getransfecteerde schizonten dagelijks vanaf 2 d.p.i. om de infectie te verifiëren.
  2. Zodra de infectie is geverifieerd, begint u met de selectie van geneesmiddelen met behulp van orale toediening van het geneesmiddel in drinkwater, ad libitum aangeboden.
    OPMERKING: Pyrimethamine werd gebruikt als de selecteerbare geneesmiddelmarker voor het plasmide. In dit geval werd 17,5 mg pyrimethamine toegevoegd aan 250 ml schoon water (eindconcentratie van 70 mg/l). Bovendien werd 10 g suiker aan dit water toegevoegd om een adequate consumptie van het pyrimethaminehoudende water door muizen aan te moedigen.
  3. Controleer parasitemie om de twee dagen met behulp van bloeduitstrijkjes gemaakt met 5 μl bloed, vanaf 6 dagen na de start van de behandeling met pyrimethamine. Het ontbreken van detecteerbare parasieten na 15 dagen duidt op een mislukte transfectie; Start in dit geval het proces opnieuw vanaf stap 1.1 voor een nieuwe poging.
  4. Wanneer parasitemie ten minste 1% bereikt, worden de parasieten overgebracht naar naïeve B6-muizen voor de aanmaak van parasieten in het bloedstadium. Ga door met de selectie in de nieuw geïnfecteerde muizen totdat parasitemie 2%-5% bereikt, waarna u voorraden genereerten ze cryopreserveert.

5. Infectie van muggen met de transgene lijnen

  1. Infecteer B6-muizen met 200 μL bloed dat de geselecteerde parasieten bevat (2 x 105 geïnfecteerde rode bloedcellen/muis, i.v.). Bepaal parasitemie bij deze muizen op de dag van muggenvoeding en infectie. Parasitemie tussen 2%-5% is optimaal voor de infectie van muggen. Eenmaal geverifieerd, breng de infectie onmiddellijk over op de vrouwelijke Anopheles stephensi-muggen volgens stap 5.2-5.4).
    OPMERKING: Incubatoren die muggen voor infectie bevatten, moeten worden gehouden op 20.5 °C, op een luchtvochtigheid van 80% en op een licht/donker-cyclus van 12 uur (lichten aan tussen 07:00 uur en 19:00 uur).
  2. Scheid de vrouwtjesmuggen de dag voor de muggeninfectie door een warmtebron bovenop de kooi te plaatsen met zowel mannelijke als vrouwelijke muggen, zoals een dunne plastic blaas of handschoen gevuld met water verwarmd tot 37 °C. Verwijder de vrouwelijke muggen, die worden aangetrokken door de warmtebron, met behulp van een insectenaspirator en breng deze over naar een aparte, kleinere kooi voor infectie.
    OPMERKING: Mannelijke muggen kunnen worden onderscheiden van vrouwelijke muggen door hun iets kleinere lichaamsgrootte en pluimantennes.
  3. Injecteer de geïnfecteerde muizen met een algemene verdoving (bijv. 2% tribroomethanol/avertin). Zorg voor volledige anesthesie door stevig in het voetkussen van elke muis te knijpen. Als ze niet reageren, zijn ze voldoende verdoofd en klaar om de infectie over te brengen op muggen.
  4. Plaats de verdoofde muizen bovenop de gekooide vrouwtjesmuggen (uit stap 5.2) onder sternale ligging. Spreid de voor- en achterpoten handmatig om het grootste oppervlak te bieden voor het voeden van muggen. Laat de geïnfecteerde muizen in totaal 15 minuten boven elke kooi staan en controleer elke 5 minuten of de muizen niet wakker zijn. Zodra het voeren is voltooid, euthanaseert u de muizen met behulp van cervicale dislocatie, of volgens het institutionele protocol voor diergebruik, en gooit u ze veilig weg.

6. Verzameling van sporozoïeten

  1. Controleer de middendarm van muggen op oöcysten bij ongeveer 10 d.p.i. om een succesvolle infectie en de ontwikkeling van Plasmodium in de muggen te verifiëren. Isoleer de middendarm van de mug van de buik door het terminale abdominale segment met een tang te verwijderen. Visualiseer de middendarm onder gepolariseerd licht op de aanwezigheid van oöcysten22.
  2. Wild-type sporozoïeten zullen naar verwachting aanwezig zijn in de speekselklieren van muggen 18-21 dagen na het voeden met geïnfecteerde muizen. Ontleed op dag 18 5-10 muggen om het aantal sporozoieten te beoordelen.
    OPMERKING: Muggen worden gewassen en gedood in ethanol. Vervolgens worden dode muggen twee keer gewassen met PBS om puin te verwijderen voordat ze worden versneden.
  3. Om de sporozoïeten te isoleren en te tellen, verwijdert u voorzichtig de kop van de mug terwijl u druk uitoefent op de thorax van de mug met een pincet of een fijne ontleednaald. De speekselklieren blijven vastzitten aan de verwijderde kop (Figuur 2).
  4. Verwijder eventueel extra muggenresten uit de speekselklieren en plaats deze in een microcentrifugebuisje met 400 μl muggendissectiemedia (Dulbecco's gemodificeerde Ealge-medium [DMEM] met 1% muizenserum, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine; zie materiaaltabel).
  5. Verstoor de geïsoleerde speekselklieren door 15-20 keer door een injectiespuit van 30 G te gaan. Plaats 10 μL van de verstoorde speekselklieren in muggendissectiemedia in een hemocytometer en tel. Resuspenderen in de gewenste concentratie muggendissectiemedia of PBS voor injectie bij muizen, inoculatie in celculturen of cryopreservatie op lange termijn23,24.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het bepalen van de frequentie en ontwikkeling van schizonten is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat voldoende levensvatbare parasieten zich in het optimale stadium voor transfectie bevinden. Onrijpe schizonten kunnen worden onderscheiden van volledig volwassen schizonten door de aanwezigheid van minder merozoïeten die niet de hele intracellulaire ruimte van de RBC vullen (Figuur 1B). Het is belangrijk op te merken dat bij het maken van bloeduitstrijkjes uit gekweekt bloed, geïnfectee...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben het bovenstaande protocol in ons laboratorium gebruikt om verschillende lijnen van transgene P. berghei-parasieten te maken. Hoewel geoptimaliseerd voor P. berghei, hebben we dit protocol ook met succes gebruikt om transgene P. yoelii-sporozoïeten te genereren. Na het injecteren van de getransfecteerde schizonten in muizen, zijn parasieten meestal niet later dan 3 d.p.i. detecteerbaar in alle groepen, inclusief de controle zonder plasmide. De selectie wordt pas gestart nadat parasitem...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health-subsidie AI168307 aan SPK.  We danken de UGA CTEGD Flow Cytometry Core en de UGA CTEGD Microscopy Core. We erkennen ook de bijdragen van Ash Pathak, Anne Elliot en het personeel van UGA Sporocore bij het optimaliseren van het protocol. We willen Dr. Daichi Kamiyama bedanken voor waardevolle inzichten, discussie en de ouderplasmiden die GFP11 en GFP 1-10 bevatten. We willen ook de leden van het Kurup-lab bedanken voor hun constante steun, geduld en aanmoediging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
30 G x 1/2" Syringe needleExel international26437
Alsever's solutionSigma-AldritchA3551-500ML
Amaxa Basic Parasite Nucleofector Kit 2LonzaVMI-1021
Avertin (2,2,2-Tribromoethanol)TCI AmericaT1420
Blood collection tubesBD bioscience365967voor serumcollectie
C-Chip disposable hematocytometerINCYTODHC-N01-5
CellVeiw Cell Culture DishGreiner Bio-One627860
Centrifuge 5425Eppendorf5405000107
Centrifuge 5910REppendorf5910RVoor gradiëntcentrifugatie
Delta Vision II - Inverted microscope systemOlympusIX-71
Dimethyl SulfoxideSigmaD5879-500ml
Fetal bovine serumGenClone25-525
GFP11 plasmidKurup LabpSKspGFP11Gemaakt vanuit PL0017 plasmid
Giemsa StainSigma-Aldritch48900-1L-F
Hepa GFP1-10 cellsKurup LabHepa GFP1-10Gemaakt vanuit Hepa 1-6 cellen (ATCC Cat# CRL-1830)
Mouse SerumGebruikt voor mosquito dissectie media
NaClMillipore-SigmaSX0420-51.5 M en 0.15 M voor percoll oplossing
Nucleofector IIAmaxa Biosystems (Lonza)Programma U-033 gebruikt voor RBC elektroporatie
Pasteur pipetteVWR14673-043
Penicillin/StreptomycinSigma-AldritchP0781-100ML
Percoll (Density gradient stock medium)Cytivia17-0891-02Details in protocol
PL0017 PlasmidBEI ResourcesMRA-786
Pyrimethamine (voor orale toediening)Sigma46706Bereidingsdetails: Voeg 17,5 mg Pyrimethamine toe aan 2,5 mL DMSO. Vortex, indien nodig om volledig op te lossen; Pas pH van 225 mL dH2O aan tot 4 met HCL. Voeg Pyrimethamine in DMSO toe aan water en breng tot 250 mL. Voeg 10 g suiker toe om regelmatige consumptie van het geneesmiddelwater te bevorderen. Pyrimethamine is lichtgevoelig. Gebruik een donkere fles of een fles bedekt met aluminiumfolie bij de behandeling van muizen.
RPMI 1640Corning15-040-CV
SoftWoRx microscopy softwareApplied Precisionv6.1.3

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. WHO. Geneva. World Health Organization. , 1(2020).
  2. Cowman, A. F., Healer, J., Marapana, D., Marsh, K. Malaria: biology and disease. Cell. 167 (3), 610-624 (2016).
  3. Crompton, P. D., et al. Malaria immunity in man and mosquito: insights into unsolved mysteries of a deadly infectious disease. Annual Review of Immunology. 32, 157-187 (2014).
  4. Marques-da-Silva, C., Peissig, K., Kurup, S. P. Pre-erythrocytic vaccines against malaria. Vaccines. 8 (3), 400(2020).
  5. Balu, B., Adams, J. H. Advancements in transfection technologies for Plasmodium. International Journal for Parasitology. 37 (1), 1-10 (2007).
  6. Rodriguez, A., Tarleton, R. L. Transgenic parasites accelerate drug discovery. Trends in Parasitology. 28 (3), 90-92 (2012).
  7. Voorberg-vander Wel, A. M., et al. A dual fluorescent Plasmodium cynomolgi reporter line reveals in vitro malaria hypnozoite reactivation. Communications Biology. 3, 7(2020).
  8. Christian, D. A., et al. Use of transgenic parasites and host reporters to dissect events that promote interleukin-12 production during toxoplasmosis. Infection and Immunity. 82 (10), 4056-4067 (2014).
  9. Montagna, G. N., et al. Antigen export during liver infection of the malaria parasite augments protective immunity. mBio. 5 (4), e01321(2014).
  10. Amino, R., Menard, R., Frischknecht, F. In vivo imaging of malaria parasites-recent advances and future directions. Current Opinion in Microbiology. 8 (4), 407-414 (2005).
  11. Siciliano, G., Alano, P. Enlightening the malaria parasite life cycle: bioluminescent Plasmodium in fundamental and applied research. Frontiers in Microbiology. 6, 391(2015).
  12. Othman, A. S., et al. The use of transgenic parasites in malaria vaccine research. Expert Review of Vaccines. 16 (7), 1-13 (2017).
  13. Kreutzfeld, O., Muller, K., Matuschewski, K. Engineering of genetically arrested parasites (GAPs) for a precision malaria vaccine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 198(2017).
  14. Otto, T. D., et al. A comprehensive evaluation of rodent malaria parasite genomes and gene expression. BMC Biology. 12, 86(2014).
  15. Janse, C. J., Ramesar, J., Waters, A. P. High-efficiency transfection and drug selection of genetically transformed blood stages of the rodent malaria parasite Plasmodium berghei. Nature Protocols. 1 (1), 346-356 (2006).
  16. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).
  17. Pacheco, N. D., Strome, C. P., Mitchell, F., Bawden, M. P., Beaudoin, R. L. Rapid, large-scale isolation of Plasmodium berghei sporozoites from infected mosquitoes. The Journal of Parasitology. 65 (3), 414-417 (1979).
  18. Kamiyama, D., et al. Versatile protein tagging in cells with split fluorescent protein. Nature Communications. 7, 11046(2016).
  19. Bailey, J. W., et al. Guideline: the laboratory diagnosis of malaria. General Haematology Task Force of the British Committee for Standards in Haematology. British Journal of Haematology. 163 (5), 573-580 (2013).
  20. Das, D., et al. A systematic literature review of microscopy methods reported in malaria clinical trials. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 104 (3), 836-841 (2020).
  21. de Oca, M. M., Engwerda, C., Haque, A. Plasmodium berghei ANKA (PbA) infection of C57BL/6J mice: a model of severe malaria. Methods in Molecular Biology. 1031, 203-213 (2013).
  22. Musiime, A. K., et al. Is that a real oocyst? Insectary establishment and identification of Plasmodium falciparum oocysts in midguts of Anopheles mosquitoes fed on infected human blood in Tororo, Uganda. Malaria Journal. 18 (1), 287(2019).
  23. Marques-da-Silva, C., et al. Direct type I interferon signaling in hepatocytes controls malaria. Cell Reports. 40 (3), 111098(2022).
  24. Bowers, C., et al. Cryopreservation of Plasmodium sporozoites. Pathogens. 11 (12), 1487(2022).
  25. Zander, R. A., et al. Th1-like plasmodium-specific memory CD4+ T cells support humoral immunity. Cell Reports. 21 (7), 1839-1852 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Genetisch gemodificeerde parasietentransgene sporozo etenmuggeninfectieleverstadium malariaisolatie van schizontenelektroporatieprotocolbloedstadiumparasietendissectie van speekselklierenGFP expressie

Gerelateerde artikelen