Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het meten van axonaal vrachttransport in primaire corticale gekweekte neuronen van muizen

746 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/64999

⸱

24 februari 2023

 , 
1Laboratory of Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 2Advanced Prevention and Research Laboratory for Dementia, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de hele procedure voor de analyse van axonaal transport. Met name de berekening van de transportsnelheid, exclusief het pauzeren, en de visualisatiemethode met behulp van open-access software "KYMOMAKER" worden hier getoond.

Samenvatting

Neuronale cellen zijn sterk gepolariseerde cellen die stereotiep meerdere dendrieten en een axon herbergen. De lengte van een axon vereist een efficiënt bidirectioneel transport door motoreiwitten. Verschillende rapporten hebben gesuggereerd dat defecten in axonaal transport geassocieerd zijn met neurodegeneratieve ziekten. Ook het mechanisme van de coördinatie van meerdere motoreiwitten is een aantrekkelijk onderwerp geweest. Omdat het axon unidirectionele microtubuli heeft, is het gemakkelijker om te bepalen welke motoreiwitten bij de beweging betrokken zijn. Daarom is het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan het transport van axonale lading cruciaal voor het blootleggen van het moleculaire mechanisme van neurodegeneratieve ziekten en de regulatie van motoreiwitten. Hier introduceren we het hele proces van axonale transportanalyse, inclusief het kweken van primaire corticale neuronen van muizen, transfectie van plasmiden die coderen voor ladingseiwitten, en richtings- en snelheidsanalyses zonder het effect van pauzes. Bovendien wordt de open-access software "KYMOMAKER" geïntroduceerd, die het mogelijk maakt om een kymograaf te genereren om transportsporen in hun richting te markeren en het axonale transport gemakkelijker te visualiseren.

Inleiding

Kinesine-familieleden en cytoplasmatisch dyneïne zijn motoreiwitten die langs de microtubuli in cellen bewegen om hun lading te transporteren1. De meeste kinesines bewegen naar het plus-uiteinde, terwijl dyneïne naar het min-uiteinde van een microtubuli beweegt. De functies en mechanismen van vrachttransport in het neuronale axon zijn uitgebreid onderzocht. Vanwege hun lengte hebben axonen stabiel transport over lange afstanden nodig om de gezondheid van neuronen te behouden. Defecten in het transport van mitochondriën, autofagosomen en blaasjes die amyloïde-β-eiwitprecursor (APP) bevatten, zijn gemeld als oorzaken van neurodegeneratieve ziekten 2,3. Talrijke in vitro onderzoeken hebben de mechanismen onthuld die ten grondslag liggen aan gecoördineerd transport door motoreiwitten, en verschillende studies met gezuiverde motoreiwitten en microtubuli hebben blootgelegd hoe motormoleculen langs microtubuli bewegen 4,5. Meestal zijn er meerdere motoren betrokken bij een enkele vracht6. Er zijn echter enkele modellen van hoe de tegenovergestelde motoren de richting van het vrachtvervoer bepalen. Een daarvan is het "associatie/dissociatiemodel"; Hierbij worden tijdens het eenrichtingstransport alleen eenrichtingsmotoren aan de lading gekoppeld. In de tweede, het "coördinatiemodel", zijn beide motoren aan dezelfde lading bevestigd en wordt slechts één kant van de motor geactiveerd. In het derde "touwtrekmodel" bepaalt de krachtbalans tussen kinesinen en dyneïnen de transportrichting 7,8,9. Bovendien hebben verschillende rapporten gesuggereerd dat de balans en het aantal geactiveerde motoreiwitten de snelheid van het vrachtvervoer in vitro beïnvloeden 8,10.

Een onbeantwoorde vraag is hoe deze activiteiten van kinesines of dyneïnen worden gereguleerd in levende cellen. Eerdere rapporten hebben acetylering van microtubuli in axonen aangetoond, en neurotrofe factoren versterken het axonale transport 11,12. Ook functioneren verschillende soorten vracht en vrachtadapters op overeenkomstige manieren als motoractivatoren13,14. Velen zijn geassocieerd met het membraan van transportblaasjes en hun functies worden gereguleerd door signalen zoals posttranslationele modificaties15. Daarom biedt het observeren van transportrichting en -snelheid in levende cellen waardevol inzicht in de moleculaire regulatie van vrachtvervoer in in vitro experimenten. De observatie van axonaal transport maakt het mogelijk om onderscheid te maken tussen transport op basis van kinesine en dyneïne. Omdat axonen plus-end unidirectionele microtubuli16 herbergen, wordt vracht anterograde (d.w.z. soma naar axon-terminal) vervoerd door kinesines en retrograde (d.w.z. axon-terminal naar soma) door dyneïnen.

In de huidige studie wordt een methode beschreven om axonaal transport in primaire gekweekte neuronen te observeren en te analyseren. Als voorbeeld wordt de procedure beschreven voor het observeren van het axonale transport van membraaneiwitten - APP, calsyntenine-1/alcadeïne α (Alcα) en calsyntenine-3/alcadeïne β (Alcβ) bevattende blaasjes. Het is bekend dat het anterograde transport van APP-bevattende blaasjes aanzienlijk sneller is dan dat van Alcα-bevattende blaasjes, hoewel beide worden getransporteerd door kinesine-1 17,18,19. In eerdere rapporten zijn verschillende methoden gebruikt om snelheid te meten. De meest variabele stap is het omgaan met pauzes tijdens het transport. In levende cellen wordt het transport soms belemmerd door obstakels langs de microtubuli; motoren kunnen echter een gebied omzeilen met of zonder een pauze20. De berekening van de snelheid over een langere waarnemingstijd kan worden beïnvloed door de pauze, wat kan resulteren in een langzamere snelheidsschatting. Hier wordt een methode beschreven waarbij beweging over een gesegmenteerde periode (200 ms) wordt gebruikt om het effect van de fysieke pauze van motoren uit te sluiten. Ten slotte wordt een open-access (alleen Windows) softwareprogramma met de naam "KYMOMAKER"21 geïntroduceerd. Kymografen worden veel gebruikt om vesiculair transport te visualiseren en zijn handig om de transportrichting van elke lading te visualiseren zonder dat er een film nodig is. De software genereert kymografen van time-lapse-films door een eendimensionaal Watershed-algoritme meerdere keren toe te passen tijdens de rotatie van afbeeldingen. Hierdoor kan de resulterende kymograaf fijne structuren efficiënt en gemakkelijk weergeven. Bovendien detecteert en markeert KYMOMAKER automatisch paden op basis van hun richting en maakt het mogelijk om gemakkelijk te begrijpen diagrammen te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten werden goedgekeurd door de Animal Studies Committee van de Universiteit van Hokkaido, in navolging van de ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) richtlijnen. Vrouwelijke C57BL/6J-muizen (zwanger, 15,5 dagen) werden gebruikt voor de huidige studie.

1. Preparaat van primaire corticale gekweekte neuronen van muizen

  1. Voeg 0,1 mg/ml poly-L-lysine toe in 0,1 M Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethaan)-HCl (pH 8,5) in een kamer met glazen bodem met 8 putjes (nr. 1,0) (zie materiaaltabel). Incubeer de kamer in een broedmachine van 37 °C gedurende minimaal 1 uur.
  2. Spoel de kamer minimaal drie keer af met gesteriliseerd water en laat aan de lucht drogen in een weefselkweekkap.
  3. Offer de drachtige muizen na 15,5 dagen op door cervicale dislocatie, of volgens institutioneel goedgekeurde voorschriften.
  4. Knijp in de baarmoederhoorn met de embryo's, isoleer de hele baarmoederhoorns met een schaar en dompel ze onder in koude fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) op ijs.
  5. Isoleer bij koude PBS de embryo's met een scherp pincet en verwijder alle vruchtwatervliezen van de embryo's.
  6. Was de embryo's opnieuw met verse koude PBS.
    OPMERKING: Spoel tijdens elke isolatiestap zoveel mogelijk bloed weg en zorg ervoor dat u de bloedvaten of embryo's niet beschadigt.
  7. Plaats een embryo op een gesteriliseerd gaasje in een koud petrischaaltje onder lichtmicroscopie.
  8. Isoleer de hersenen. Snijd het hoofd, de huid en de schedel van het embryo af met de punt van een gebogen, scherp pincet. Verwijder de huid en schedel om de bovenkant en zijkanten van de hersenen bloot te leggen.
  9. Schep het hele brein eruit met behulp van het gebogen deel van het pincet en dompel het onder in een petrischaaltje met ijskoude 1x Hanks' gebalanceerde zoutoplossing (HBSS; 10 mM HEPES [pH 7,6], 5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 4,2 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4, 39 mM D-glucose, en 0,5 μg/ml gentamicine; zie Materiaaltabel).
  10. Herhaal stap 1.7-1.9 totdat het vereiste aantal hersenen is verkregen.
    OPMERKING: Meestal kunnen 5 x 106 tot 2 x 107 cellen per brein worden verkregen.
  11. Scheid de cortex22 van de hersenen met behulp van een pincet in koude 1x HBSS en scheur de hersenvliezen van de cortex.
  12. Breng de cortex over naar een nieuw petrischaaltje met daarin 1x HBSS. Snijd de cortex doormidden of in drieën met behulp van chirurgische mesjes.
  13. Breng de cortex over in een centrifugebuis van 15 ml met behulp van tip-cut 1.000 μL tips en verwijder overtollige 1x HBSS.
  14. Voeg 100 eenheden papaïne en 200 μg deoxyribonuclease I (DNase I) verdund met 5 ml verdunde papaïneoplossing (5 mg/ml D-glucose, 0,2 mg/ml runderserumalbumine en 0,2 mg/ml L-cysteïne in 1x PBS; zie materiaaltabel) per embryo toe en incubeer gedurende 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Keer de buis tijdens de incubatie elke 5 minuten om.
    OPMERKING: Pre-incubatie van papaïne in verdunde papaïneoplossing wordt aanbevolen. Incubeer gedurende 5 minuten in een waterbad van 37 °C en voeg dan DNase I toe.
  15. Gooi de oplossing weg. Voeg 2 ml 20% door warmte geïnactiveerd paardenserum toe (zie materiaaltabel) in 1x HBSS. Incubeer gedurende 1 min.
  16. Gooi de oplossing weg. Spoel de tissue twee keer af met 4 ml 1x HBSS.
  17. Gooi de oplossing weg. Voeg 0,5 ml per embryo platingmedium toe (neurobasaal medium met 2% B-27-supplement, 4 mM glutamax, 5% door warmte geïnactiveerd paardenserum en 1x penicilline-streptomycine; zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Tijdens de stappen 1.14-1.17 is geen centrifugatie nodig omdat de doorgesneden cortexstukken zonder centrifugatie naar de bodem van de buis zinken. Gebruik geen aspirator en zuig de stukken niet op.
  18. Resuspendeer heel voorzichtig met een gesneden 1.000 μL tip of 10 ml pipet 5 tot 10 keer.
  19. Resuspendeer 10 keer heel voorzichtig met een tip van 1.000 μL.
  20. Centrifugeer bij 250 × g bij kamertemperatuur (20-25 °C) gedurende 3 min.
  21. Verwijder het bovenstaande en suspendeer heel voorzichtig met 10 maal een tip van 1,5 ml per embryo van het uitplatingsmedium met behulp van een tip van 1.000 μl.
  22. Plaats een celzeef van 40 μm op een centrifugebuis van 50 ml en filtreer vervolgens de celsuspensie door middel van zwaartekracht. Vang de gefilterde celsuspensie op in de buis.
  23. Tel de cellen en de plaat in de kamers op 2 × 104 tot 5 × 104 cellen/cm2, met een geschikte hoeveelheid platingmedium. Een voorbeeld van de dichtheid wordt weergegeven in aanvullende figuur 1.
  24. Vervang op day-in-vitro (Div.) 2 de helft van het medium door kweekmedium (neurobasaal medium met 2% B-27-supplement, 4 mM Glutamax en 1x penicilline-streptomycine) en voeg 5 μM 5-fluor-2-deoxyuridine toe (zie materiaaltabel).
  25. Vervang na Div. 4 elke 2 of 3 dagen de helft van het medium door kweekmedium.

2. Transfectie van plasmiden naar primair gekweekt neuron met behulp van de calciumfosfaatmethode

OPMERKING: De genoemde volumes zijn voor een put van 0,8 cm2 in een kamer met 8 putjes met glazen bodem (zie materiaaltabel).

  1. Bereid 50 μl DNA/CaCl2-oplossing door 200 ng te mengen met 2 μg van een plasmide (APP-EGFP in pCAGGS, Alcα-EGFP in pcDNA3.118 of Alcβ-EGFP in pcDNA3.1; zie aanvullende tabel 1) dat codeert voor een fluorescentie-gelabeld eiwit, 6,2 μl 2 M CaCl2 en gesteriliseerd water.
  2. 50 μL 2x HEPES-gebufferde zoutoplossing (HBS) in nieuwe centrifugebuisjes.
  3. Voeg 6,2 μL DNA/CaCl2 oplossing toe aan 2x HBS oplossing. Meng voorzichtig door 10 keer te pipetteren.
  4. Herhaal stap 2.3 totdat alle DNA/CaCl2-oplossing is overgebracht.
  5. Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Vang het kweekmedium op in de kamer met glazen bodem en vervang het door vers kweekmedium zonder antibiotica.
    OPMERKING: Bewaar het verzamelde medium in de celkweekincubator tot stap 2.10.
  7. Voeg 50 μL van het DNA/CaCl2/HBS-mengsel per putje druppelsgewijs toe aan neuronen. Cultuur voor 1 uur.
  8. Bereid tijdens de incubatie het aangezuurde medium voor door een petrischaaltje met DMEM (gemodificeerd Eagle's medium van Dulbecco)/F-12-media van Ham in een incubator met 10% CO2 -gehalte bij 37 °C te plaatsen.
  9. Na incubatie gedurende 1 uur na transfectie, spoelt u de primaire neuronen 3 keer met DMEM/Ham's F-12 (aangezuurd medium).
  10. Vervang de media door een mengsel van half verzamelde media en halfverse cultuurmedia. Kweek tot waarneming door microscopie bij 37 °C en 5% CO2.

3. Observatie van axonaal transport

  1. Pre-incubeer de kamer die is uitgerust met TIRF-microscopie (totale interne reflectie) (zie materiaaltabel) bij 37 °C.
  2. Als de CO2 -regelaar is uitgerust, kan het kweekmedium worden gebruikt als observatiemedia onder 5% CO2 . Als het niet is uitgerust, vervang het medium dan door een pH-stabiel medium, zoals Leibovitz L-15 (zie materiaaltabel), geleverd met 4 mM Glutamax en 2% B-27 supplement.
  3. Zoek een getransfecteerde cel en identificeer vervolgens een axon. Vergroot de invalshoek van de laser totdat de laser volledig is gereflecteerd. Verklein vervolgens de hoek totdat alle blaasjes in het axon zichtbaar zijn (pseudo-TIRF). Maak foto's met een belichtingstijd van 200 ms voor 150 frames (30 s).
    OPMERKING: In dit experiment werd pseud-TIRF-verlichting gebruikt om alle axonblaasjes op te vangen. Andere microscopen die zijn uitgerust met snelle opnamesystemen kunnen worden gebruikt.
    OPMERKING: Noteer de richting van het axon elke keer in de bestandsnaam. Het gebied van het initiële axonsegment of het terminale axongebied werd vermeden uit de waarneming.

4. Beeldverwerking

  1. Open de verkregen afbeeldingen met behulp van de MetaMorph-software (zie Materiaaltabel).
  2. Open de gereedschapsbalk > Afstand meten > kalibreren. Schakel "toepassen op alle geopende afbeeldingen" in en voer de werkelijke afstand van een pixel in.
  3. Open de werkbalk > Display > roteren. Schakel het selectievakje voor "alle vliegtuigen" in. Draai zodat het axon horizontaal is en de richting naar de axonaansluiting naar rechts.
  4. Open de werkbalk > Regio's > Regio's maken. Stel de grootte van het gebied voor knippen in en klik op Maken. Plaats het frame dat op de afbeelding verschijnt op het axongebied voor analyse. Sla de gegenereerde afbeeldingsreeks op als een stapelbestand.
    OPMERKING: Selecteer gebieden die geen ongerichte axonen of vuil bevatten.
  5. Open de werkbalk > weergave > afbeeldingen. Selecteer Kalibratiebalk om de schaalbalk te stempelen. Selecteer Gegevens/Tijd om een tijdstempel aan de afbeeldingen toe te voegen. Schakel "alle vliegtuigen" in. Verplaats de objecten naar de juiste ruimte en klik op stempel.
  6. Open de werkbalk > stapel > film maken. Voer de juiste framesnelheid in en selecteer AVI. Sla het op als een nieuw bestand.

5. Een kymograaf tekenen en sporen detecteren met KYMOMAKER

  1. Download KYMOMAKER (zie Materiaaltabel) en open "Kymoanalysis.exe" in de map KYMOMAKER.
  2. Open "kymoAnalysis.exe" om de hoofdvensters weer te geven (Figuur 1A). Selecteer Bestand > Laden en open de gemaakte AVI-film. Er verschijnt een "Voorbeeld"-venster (Afbeelding 1B).
  3. Voer in het tabblad Kymograaf genereren > het gedeelte bijsnijden de pixelnummers in voor het bijsnijden. Het bijsnijden wordt onmiddellijk weergegeven in het venster "Voorbeeld" om eenvoudige aanpassing mogelijk te maken (Afbeelding 1C). Controleer of de volledige schaalbalk en tijdstempel zijn verwijderd.
  4. Klik op de knop Genereren om de kymograaf te genereren (Figuur 1C). KYMOMAKER detecteert de helderste pixel binnen elke y-as in het venster "Voorbeeld". Sla de kymograaf op via bestand > sla > normale kymograaf op.
  5. Om de sporen met lage intensiteit in de kymograaf te detecteren, klikt u op Roterende kymograaf. Pas het nummer aan in het gedeelte "Roterende kymograaf" en bekijk het resultaat door op de roterende kymograaf te klikken (Figuur 1D).
    OPMERKING: "Rotatie (graad)" is het interval van de graad voor het Rotational Watershed-algoritme21. 10° betekent bijvoorbeeld dat het Watershed-algoritme elke 10° 36 keer wordt uitgevoerd en dat de resultaten vervolgens worden gecombineerd in het venster "Rotational Watershed".
  6. Als u de anterograde en retrograde sporen in de kymograaf wilt detecteren, selecteert u op het tabblad Detectie > sectie Doel de optie origineel als de roterende kymograaf niet is gegenereerd. Zorg ervoor dat door Rotatie te selecteren, het gemaakte Rotational Watershed wordt gebruikt om sporen te detecteren. Selecteer Watershed in 'Detectiemethode'. Klik op de knop Detecteren om automatisch sporen te detecteren.
    OPMERKING: Gedetecteerde sporen worden getekend in het venster "Werken". Als u "Masking" inschakelt, worden sporen getekend op de originele kymograaf.
  7. Detecteer de anterograde en retrograde sporen door een nummer in te voeren in de sectie Detectie > Filtering > Snelheid (Figuur 1E,F). Detecteer anterograde sporen door 0,4 tot 7,0 μm/s in te voeren. Detecteer retrograde sporen door -0,4 tot -7,0 μm/s in te voeren.
    OPMERKING: De instelling voor de laagste snelheid hangt af van de definitie van een immobiele toestand van blaasjes. Zie stap 6.7.
  8. Sla de bestanden op.

6. Bepalen van de snelheid

  1. Open de MetaMorph-software.
    OPMERKING: De "manual tracking" plugin in ImageJ kan ook de snelheden op dezelfde manier berekenen.
  2. Open het bestand dat in stap 4.4 is gemaakt. Zorg ervoor dat de kalibratie is aangepast aan de beelden.
  3. Open de werkbalk > apps > punten bijhouden. Klik op Track toevoegen. Zoek een bewegend blaasje dat anterograde of retrograde is getransporteerd. Volg vervolgens het blaasje door te klikken totdat het transport eindigt. Klik op Gereed.
  4. Herhaal stap 6.3 totdat alle blaasjes zijn gevolgd.
  5. Klik op log openen om een CSV-bestand te openen. Klik vervolgens op logbestand om gegevens in het CSV-bestand weer te geven.
  6. Sla het CSV-bestand op.
  7. Als u de gesegmenteerde snelheid wilt berekenen die niet wordt beïnvloed door de pauze, verwijdert u berekende snelheden van 0,37 μm/s of lager in de kolom 'snelheid'.
    OPMERKING: Blaasjes kunnen zeer kort bewegen door abnormale diffusie en ze worden niet verwerkt door motoreiwitten23. Om te voorkomen dat deze bewegingen worden meegenomen in de berekening van motoraangedreven snelheden, wordt de laagste snelheid (1 pixel/200 ms) in dit protocol uit de berekening verwijderd.
  8. Bereken de gesegmenteerde gemiddelde snelheid elke vijf frames (in totaal 1 s). Gooi het laatste deel van de snelheid weg als er minder dan vijf frames over zijn.
  9. Combineer alle gemiddelde snelheden van één voorwaarde. Genereer histogrammen om de verdeling van snelheden te visualiseren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Primaire gekweekte neuronen uit de E15.5-muiscortex werden gekweekt in een schaal met glazen bodem zoals beschreven. APP-EGFP, Alcα-EGFP of Alcβ-EGFP werden bijvoorbeeld tot expressie gebracht in de primaire corticale neuronen. Van APP en Alcα is bekend dat ze in het axon worden getransporteerd door kinesine-1 2,17. APP associeert met kinesine-1 via het adaptereiwit JIP1 (JNK-interagerend eiwit 1), terwijl Alcα direct bi...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er wordt een analysemethode voor axonaal transport beschreven, die de berekening van de gesegmenteerde snelheid en het genereren van kymografen omvat. Een kritieke stap tijdens de transfectiestap is het handhaven van de gezondheid van gekweekte neuronen. De transfectiemethode beschreven door Jiang en Chen29 werd gevolgd met kleine wijzigingen. Zachte menging van de DNA/CaCl2-oplossing en 2x HBS verhoogde de efficiëntie van transfectie door de grootte va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door KAKENHI (22K15270, Grant-in-Aid for Young Scientists) en de Akiyama Life Science Foundation for YS. We willen onze dankbaarheid betuigen aan Dr. Masataka Kinjo en Dr. Akira Kitamura, Laboratory of Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University voor het leveren van kritische input en expertise die het onderzoek enorm hebben geholpen. De waarneming met TIRF-microscopie werd uitgevoerd met behulp van het instrument dat was geïnstalleerd in het Laboratory of Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University. Het instrument is geregistreerd in het Open Facility-systeem dat wordt beheerd door het Global Facility Center, Creative Research Institution, Hokkaido University (AP-100138). We danken Dr. Seiichi Uchida, Human Interface Laboratory, Department of Advanced Information Technology, Faculty of Information Sciences and Electrical Engineering, Kyushu University, Fukuoka Japan, voor de assemblage met de applicatie Kymomaker. Geavanceerd preventie- en onderzoekslaboratorium voor dementie, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University wordt ondersteund door Japan Medical Leaf co., Ltd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-Fluoro-2-deoxyuridineSigma-AldrichF0503
Apo TIRF 100x/1.49 OILNikon
B-27 Supplement (50x), serum freeThermo fischer scientific17504044
Bovine serum albuminWako013-25773
CalPhos Mammalian Transfection KitTakara631312
Cell strainer  40 µm NylonFalcon352340
CoolSNAP HQPhotometrics
Deoxyribonuclease ISigma-AldrichDN-25
D-GlucoseWako041-00595
DMEM/Ham’s F-12Wako042-30555
Dumont No. 7 forcepsDumont No.7
Feather surgical blade FeatherNo.11
Feather surgical blade handle FeatherNo. 3
GentamicinWako079-02973
Gentamicin SulfateWako075-04913
GlutaMAX SupplementThermo fischer scientific35050061
HEPESDOJINDO342-01375
Horse Serum, heat inactivatedThermo fischer scientific26050088
KClWako163-03545
KH2PO4Wako169-04245
KYMOMAKERhttp://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL5520
MetaMorph version 6.2r1 Metamorph
Na2HPO4Wako197-02865
NaClWako197-01667
NaHCO3Wako191-01305
Neurobasal MediumThermo fischer scientific21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-ENikon
Nunc Lab-Tek  8 well Chambered CoverglassThermo fischer scientific155411
PapainWorthingtonLS003126
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140122
Poly-L-lysine hydrobromideSigma-AldrichP2636-500MG
Trizma baseMerckT1194-10PAKsolved with water to make 0.1 M Tris-HCl (pH.8.5)

Referenties

  1. Hirokawa, N., Noda, Y., Tanaka, Y., Niwa, S. Kinesin superfamily motor proteins and intracellular transport. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (10), 682-696 (2009).
  2. Stokin, G. B., et al. Axonopathy and transport deficits early in the pathogenesis of Alzheimer's diseases. Science. 307 (5713), 1282-1288 (2005).
  3. Guo, W., Stoklund Dittlau, K., vanden Bosch, L. Axonal transport defects and neurodegeneration: Molecular mechanisms and therapeutic implications. Seminars in Cell & Developmental Biology. 99, 133-150 (2020).
  4. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  5. Carter, N. J., Cross, R. A. Mechanics of the kinesin step. Nature. 435 (7040), 308-312 (2005).
  6. Welte, M. A. Bidirectional transport along microtubules. Current Biology. 14 (13), R525-R537 (2004).
  7. Hendricks, A. G., et al. Motor coordination via a tug-of-war mechanism drives bidirectional vesicle transport. Current Biology. 20 (8), 697-702 (2010).
  8. Rezaul, K., et al. Engineered tug-of-war between kinesin and dynein controls direction of microtubule based transport in vivo. Traffic. 17 (5), 475-486 (2016).
  9. Encalada, S. E., Goldstein, L. S. B. Biophysical challenges to axonal transport: motor-cargo deficiencies and neurodegeneration. Annual Review of Biophysics. 43, 141-169 (2014).
  10. Monzon, G. A., et al. Stable tug-of-war between kinesin-1 and cytoplasmic dynein upon different ATP and roadblock concentrations. Journal of Cell Science. 133 (22), 226248(2020).
  11. Guo, W., et al. HDAC6 inhibition reverses axonal transport defects in motor neurons derived from FUS-ALS patients. Nature Communications. 8 (1), 861(2017).
  12. Tosolini, A. P., et al. BDNF-dependent modulation of axonal transport is selectively impaired in ALS. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 121(2022).
  13. Verhey, K. J., Hammond, J. W. Traffic control: regulation of kinesin motors. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10 (11), 765-777 (2009).
  14. Fu, M. M., Holzbaur, E. L. F. Integrated regulation of motor-driven organelle transport by scaffolding proteins. Trends in Cell Biology. 24 (10), 564-574 (2014).
  15. Kumari, D., Ray, K. Phosphoregulation of kinesins involved in long-range intracellular transport. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 873164(2022).
  16. Wai Yau, K., et al. Cellular/molecular dendrites in vitro and in vivo contain microtubules of opposite polarity and axon formation correlates with uniform plus-end-out microtubule orientation. The Journal of Neuroscience. 36 (4), 1071-1085 (2016).
  17. Araki, Y., et al. The novel cargo Alcadein induces vesicle association of kinesin-1 motor components and activates axonal transport. The EMBO Journal. 26 (6), 1475-1486 (2007).
  18. Sobu, Y., et al. Phosphorylation of multiple sites within an acidic region of Alcadein α is required for kinesin-1 association and Golgi exit of Alcadein α cargo. Molecular Biology of the Cell. 28 (26), 3844-3856 (2017).
  19. Tsukamoto, M., et al. The cytoplasmic region of the amyloid β-protein precursor (APP) is necessary and sufficient for the enhanced fast velocity of APP transport by kinesin-1. FEBS Letters. 592 (16), 2716-2724 (2018).
  20. Ferro, L. S., Can, S., Turner, M. A., Elshenawy, M. M., Yildiz, A. Kinesin and dynein use distinct mechanisms to bypass obstacles. eLife. 8, e48629(2019).
  21. Chiba, K., Shimada, Y., Kinjo, M., Suzuki, T., Uchida, S. Simple and direct assembly of kymographs from movies using KYMOMAKER. Traffic. 15 (1), 1-11 (2014).
  22. Xu, S. -Y., Wu, Y. -M., Ji, Z., Gao, X. -Y., Pan, S. -Y. A modified technique for culturing primary fetal rat cortical neurons. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 803930(2012).
  23. Han, D., et al. Deciphering anomalous heterogeneous intracellular transport with neural networks. eLife. 9, e52224(2020).
  24. Araki, Y., et al. Novel cadherin-related membrane proteins, Alcadeins, enhance the X11-like protein-mediated stabilization of amyloid beta-protein precursor metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 278 (49), 49448-49458 (2003).
  25. Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nature Protocols. 1 (2), 695-700 (2006).
  26. Tosolini, A. P., Villarroel-Campos, D., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Expanding the toolkit for in vivo imaging of axonal transport. Journal of Visualized Experiments. (178), e63471(2021).
  27. Takihara, Y., et al. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  28. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  29. Basu, H., Ding, L., Pekkurnaz, G., Cronin, M., Kymolyzer Schwarz, T. L. a semi-autonomous kymography tool to analyze intracellular motility. Current Protocols in Cell Biology. 87 (1), 107(2020).
  30. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. F. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319 (5866), 1086-1089 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Corticale neuronen van muizenanalyse van axonaal transportmotorische eiwittenneurodegeneratieve ziektengenereren van kymografenbidirectioneel transporttransfectie van vrachteiwittendirectionele snelheidsanalysemicrotubuli polariteit

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.