Methodenartikel

Methoden voor het bestuderen van de optica, fysiologie en biochemie van het samengestelde oog van de vlieg

24 maart 2023

 , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BEHANDELDE ARTIKELEN:

Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling M. F., Stavenga, D. G. Geautomatiseerd in kaart brengen van de visuele ruimte van de samengestelde ogen van de huismug. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643 (2022).

Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Bestudering van membraaneiwitverkeer in Drosophila fotoreceptorcellen met behulp van eGFP-gelabelde eiwitten. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375 (2022).

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila fotoreceptoren. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514 (2022).

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Zuivering van endogene Drosophila transient receptor potential kanalen. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260 (2021).

Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analyse van lipidesignalering in Drosophila fotoreceptoren met behulp van massaspectrometrie. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516 (2022).

Redactioneel

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het samengestelde oog van de vlieg is een belangrijk biologisch modelsysteem voor het verhelderen van fundamentele biologische mechanismen. Enkele van de mechanismen die met dit systeem zijn bestudeerd, omvatten het volgende: het samengestelde oogzicht met een bijna panoramisch gezichtsveld1; de biofysica, eiwitassemblage en biogenesis van de lichtgevoelige G-proteïn-gekoppelde receptor2,3,4; het fosfolipase Cβ-gemedieerde signaaltransductiesysteem5,6; TRP-kanaalactivering en modulatie in natuurlijk weefsel5,6; de samenstelling en functie van het multi-eiwit signaalcomplex7,8; de moleculaire structuur, biochemie en functie van inositol-fosfolipiderecycling9,10; en de signaalgemedieerde subcellulaire translocatie van signaaleiwitten11,12. De unieke anatomische structuur en optica van het samengestelde oog van de vlieg zijn uitgebreid bestudeerd en hebben fundamentele ontwikkelingsmechanismen en visuele capaciteiten onthuld.

Deze methodencollectie omvat het werk van toonaangevende wetenschappers die methoden hebben ontwikkeld en verfijnd voor het bestuderen van enkele van de bovenstaande mechanismen in het samengestelde oog van de vlieg. Muñoz et al. beschrijven een methode voor kwantitatieve analyse van de optische rangschikking van het vlieg-oog die een nauwkeurige weergave van het samengestelde oog en zijn ruimtelijke organisatie biedt13. Deze methode is essentieel voor het bestuderen van de neuronale verwerking van visuele informatie in detail. Belangrijk is dat er veel pogingen zijn geweest om bio-geïnspireerde kunstmatige ogen te produceren, en deze zijn gebaseerd op kwantitatieve studies van bestaande samengestelde ogen. Wagner et al. gebruiken de diepe pseudopupil, een uniek optisch fenomeen van het samengestelde oog, en hoge vergrotingsmicroscopie met de optische neutralisatie van de hoornhuid om eGFP-gelabelde eiwitten binnen Drosophila fotoreceptorcellen te lokaliseren14. Deze methode maakt de detectie mogelijk van structurele defecten in de rhabdomeres als gevolg van fotoreceptordegeneratie en cellulaire lokalisatie en traffic van belangrijke signaaleiwitten. Gutorov et al. gebruiken elektrofysiologische metingen van het hele oog of van enkele fotoreceptorcellen om het niveau van fotopigmenttoestanden in vivo en hun modulaties door specifieke mutaties in signaaleiwitten te meten15. Deze methode exploiteert de ladingsverplaatsingen binnen een visuele pigmenttoestand (R) geïnduceerd door de absorptie van fotonen, wat resulteert in de vorming van een tweede pigmenttoestand die stabiel is in het donker (M). Een aanvullende methode maakt gebruik van verlengde depolarisatie na licht-uit (PDA) die de donkere bi-stabiele eigenschappen van het visuele pigment en de verschillen in de absorptiespectra van de vlieg R- en M-toestanden exploiteert. Aangezien de PDA afhankelijk is van de omzetting van een grote hoeveelheid fotopigment, kan zelfs het geringste defect in de biogenese van het fotopigment leiden tot een gemakkelijk detecteerbare abnormale PDA. Inderdaad, Drosophila mutanten die abnormale PDA vertonen, hebben geleid tot de ontdekking van nieuwe signaaleiwitten. Een uitstekend voorbeeld hiervan is de ontdekking van het nieuwe eiwitcomplex bestaande uit het scaffold-eiwit inactivatie maar geen napotentiaal D (INAD), de oogspecifieke proteïnekinase C (eyePKC), de fosfolipase Cβ (PLCβ) en het transient receptor potentiaal (TRP) kanaal. Voor de eerste keer presenteren Liu et al. een techniek om het Drosophila TRP-kanaal te zuiveren16. Deze gewijzigde affiniteitszuiveringsmethode gebruikt een competitiestrategie die is gebaseerd op het assemblagemechanisme van het INAD-signaalcomplex. Deze strategie maakt de zuivering van het endogene TRP-kanaal mogelijk. Volgens deze methode wordt eerst een PLCβ-fragment gebonden aan Ni-beads gelabeld met histidine en gebruikt om het endogene INAD-eiwitcomplex te trekken dat is verkregen uit Drosophila hoofdhomogenaten. Vervolgens worden TRP-fragmenten die zijn gelabeld met overmatig gezuiverde glutathion S-transferase (GST) toegevoegd aan de Ni-beads om te concurreren met het endogene TRP-kanaal dat aan de INAD is gebonden. Ten slotte wordt grootte-uitsluitingschromatografie gebruikt om de gelabelde TRP-kanaalfragmenten in de supernatant te scheiden van het endogene TRP-kanaal. Panda et al. rapporteren een gevoelige techniek om verschillende klassen lipiden in Drosophila fotoreceptorcellen te identificeren en te kwantificeren met behulp van massaspectrometrie17. De activering van PLCβ is cruciaal voor fototransductie, omdat dit leidt tot de hydrolyse van fosfatidylinositol 4,5 bisfosfaat (PI(4,5)P2) in het oppervlaktemembraan. Deze reactie leidt uiteindelijk tot de activering van het TRP-kanaal. Bovendien resulteert de activiteit van PLCβ in de generatie van veel lipidesoorten. Er is voorgesteld dat verschillende van deze lipidesoorten mogelijk deel nemen aan TRP-activering en een sleutelrol spelen in de functionele organisatie van fotoreceptoren voor het optimaliseren van sensorische transductie. In de studie van Panda et al.17 werden deze bevindingen beoordeeld door Drosophila mutanten te isoleren die defecte enzymen bevatten die de niveaus van specifieke lipiden regelen.

Het samengestelde oog van de vlieg is een nuttig experimenteel systeem voor het verhelderen van fundamentele mechanismen in de biologie. De krachtige

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur heeft niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteur heeft geen dankbetuigingen.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Douglass, J. K., Wehling, M. F. Rapid mapping of compound eye visual sampling parameters with FACETS, a highly automated wide-field goniometer. Journal of Comparative Physiology A: Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 202 (12), 839-851 (2016).
  2. Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
  3. Rosenbaum, E. E., et al. XPORT-dependent transport of TRP and rhodopsin. Neuron. 72 (4), 602-615 (2011).
  4. Vought, B. W., et al. Characterization of the primary photointermediates of Drosophila rhodopsin. Biochemistry. 39 (46), 14128-14137 (2000).
  5. Randall, A. S., et al. Speed and sensitivity of phototransduction in Drosophila depend on degree of saturation of membrane phospholipids. The Journal of Neuroscience. 35 (6), 2731-2746 (2015).
  6. Minke, B., Pak, W. L. The light-activated TRP channel: The founding member of the TRP channel superfamily. Journal of Neurogenetics. 36 (2-3), 55-64 (2022).
  7. Huber, A., et al. The transient receptor potential protein (Trp), a putative store-operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD. The EMBO Journal. 15 (24), 7036-7045 (1996).
  8. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  9. Raghu, P., Basak, B., Krishnan, H. Emerging perspectives on multidomain phosphatidylinositol transfer proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (9), 158984(2021).
  10. Raghu, P., Yadav, S., Mallampati, N. B. Lipid signaling in Drosophila photoreceptors. Biochimica et Biophysica Acta. 1821 (8), 1154-1165 (2012).
  11. Bahner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
  12. Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
  13. Muñoz Arias, M., Douglass, J. K., Wehling, M. F., Stavenga, D. G. Automated charting of the visual space of housefly compound eyes. Journal of Visualized Experiments. (181), e63643(2022).
  14. Wagner, K., Smylla, T. K., Zeger, M., Huber, A. Studying membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells using eGFP-tagged proteins. Journal of Visualized Experiments. (179), e63375(2022).
  15. Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological methods for measuring photopigment levels in Drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments. (184), e63514(2022).
  16. Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of endogenous Drosophila Transient Receptor Potential channels. Journal of Visualized Experiments. (178), e63260(2021).
  17. Panda, A., Thakur, R., Kumari, A., Raghu, P. Analysis of lipid signaling in Drosophila photoreceptors using mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (181), e63516(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

DrosophilaPhotoreceptor CellsMembrane Protein TraffickingPhotopigment LevelsElectrophysiological MethodsEndogenous ChannelsLipid SignalingMass SpectrometryVisualized Experiments

Gerelateerde artikelen