Methodenartikel

Genereren van functionele endodermale leverorganoïden

DOI:

10.3791/65027

⸱

2 mei 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Izmir Biomedicine and Genome Center, 2Department of Histology and Embryology, Health Science Institute, Dokuz Eylul University, 3Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Izmir Tinaztepe University, 4Department of Histology and Embryology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 5Department of Pediatric Gastroenterology and Metabolism, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University, 6Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Koc University, 7Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Dokuz Eylul University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft het genereren van snelle en reproduceerbare endodermale leverorganoïden (eHEPO's). Met dit protocol kunnen eHEPO's binnen 2 weken worden geproduceerd en op lange termijn (meer dan 1 jaar) worden uitgebreid zonder hun differentiatie en functionaliteit te verliezen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïdetechnologie heeft ons in staat gesteld om in vitro een verscheidenheid aan menselijke orgaanachtige ministructuren te genereren, zoals voor de lever, hersenen en darmen. De opmerkelijke vooruitgang in organoïdemodellen heeft onlangs een nieuw experimenteel tijdperk geopend voor verschillende toepassingen in ziektemodellering, ontwikkelingsbiologie en ontdekking van geneesmiddelen. Volwassen stamcellen of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide leverorganoïden regelen de aanmaak van hepatocyten die voor diverse toepassingen kunnen worden gebruikt. Hier presenteren we een robuust en reproduceerbaar protocol voor het genereren van leverorganoïden uit pluripotente stamcellen. Dit protocol is van toepassing op gezonde en van de patiënt afgeleide cellen. Om 3D-endoderm-afgeleide leverorganoïden (eHEPO's) te verkrijgen, werden iPSC's eerst direct gedifferentieerd tot endodermale cellen en vervolgens werden FACS-verrijkte EpCAM-positieve (EpCAM+) cellen gebruikt om leverorganoïden te vestigen met behulp van het expansiemedium. Wij bieden een snelle en efficiënte methode om binnen 2 weken leverorganoïden te genereren. De gegenereerde organoïden bootsen de essentiële eigenschappen en functies van hepatocyten na, zoals albuminesecretie, glycogeenopslag en cytochroom P450-enzymactiviteit. Naast de leverspecifieke overeenkomsten in genexpressie, bestaan eHEPO's uit gepolariseerde epitheelcellen met galcanaliculi ertussen. Bovendien kunnen eHEPO's worden uitgebreid en seriële passages op lange termijn (1 jaar) zonder hun vermogen om te differentiëren tot volwassen hepatocyten te verliezen. eHEPO's bieden dus een alternatieve bron om functionele hepatocyten te produceren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organoïden zijn geminiaturiseerde orgaanachtige structuren die worden gekweekt in 3-dimensionale kweekomstandigheden die de micro-omgeving van het orgaan nabootsen en de intrinsieke factoren bevatten die nodig zijn voor zelforganisatie en zelfvernieuwing in de orgaanontwikkeling zelf. Organoïden kunnen worden afgeleid van pluripotente stamcellen (PSC's) of van volwassen weefsel afgeleide cellen (stam- of voorlopercellen)1. Hoewel hun nauwkeurige orgaanachtige organisatie en functionele gelijkenis met het specifieke orgaan ze tot waardevolle hulpmiddelen maken voor ziektemodellering, moeten ze nog verder worden verbeterd op het gebied van standaardisatie in cultuur. Er zijn met name verschillende protocollen gepubliceerd voor het genereren van leverorganoïden, en deze verschillen in hun complexiteit en reproduceerbaarheid2. De leverknoporganoïden die door Takebe et al. zijn ontwikkeld, nemen bijvoorbeeld de vorm aan van dichte, meercellige structuren die de volgende geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) bevatten: endodermale voorlopercellen van de lever, endotheelcellen van de menselijke navelstrengader (HUVEC's) en mesenchymale stamcellen (MSC's). Die organoïden hebben echter geen zelfvernieuwend vermogen op lange termijn 3,4.

Vanuit een historisch perspectief rapporteerden Huch et al. voor het eerst de productie van menselijke hepatische epitheelorganoïden afgeleid van volwassen weefsel, waarin de cellen polariseren en zich specialiseren om aspecten van het natieve epitheel te reproduceren5. Vervolgens gebruikten Guan et al. iPSC-afgeleide leverorganoïden om het syndroom van Alagille (ALGS) te modelleren, een zeldzame genetische aandoening die verband houdt met galwegreductie in de lever6. Beide organoïden hebben een zelfvernieuwend vermogen en kunnen volwassen hepatocytenfuncties krijgen, zoals gal- en albuminesecretie, glycogeenopslag en leverspecifieke medicijnontgifting. In een recente studie introduceerden Ramli et al. een PSC-afgeleid leverorganoïdemodel met functionele galcanaliculi-netwerken tussen gepolariseerde hepatocytachtige cellen (HLC's) die cholestatische geneesmiddelen legen in galcysten die zijn samengesteld uit cholangiocytachtige cellen (CLC's)7.

Deze studie presenteert een unieke cultuur voor het genereren van iPSC-afgeleide endodermale leverorganoïden, eHEPO's genaamd. De iPSC-cultuur en differentiatie tot endoderm worden stap voor stap beschreven en het genereren van eHEPO's uit verrijkte EpCAM+-voorlopercellen wordt gedemonstreerd. Ten slotte wordt de karakterisering van de functionaliteit en structurele organisatie van de eHEPO's, evenals de cryopreservatie van de organoïden, beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toestemmingen met betrekking tot experimentele stappen werden verkregen van de lokale Clinical Research Ethics Committee van de Medische Faculteit van de Dokuz Eylul University (2013/25-4, 12 mei 2013; 2016/30-29, 24 november 2016).

1. Oplossingen voor celcultuur voorbereiden

  1. Bereid het endodermdifferentiatiemedium voor door de volgende componenten in een laminaire stromingskap te mengen: 1% B27, 100 ng/ml activine A, Wnt3a of 30% wnt3a-CM en R-spo1 of 10% R-spo1-CM (zie de materiaaltabel).
  2. Bereid de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) buffer voor met de volgende samenstelling: PBS, 1 mM EDTA, 25 mM HEPES, 1% FBS.
  3. Bereid het expansiemiddel (EM) voor: 1% N2, 1% B27, 1,25 mM N-acetyl-L-cysteïne, 50 ng/ml EGF, 10% R-spo1 geconditioneerd medium, 100 ng/ml FGF 10, 10 mM nicotinamide, 5 μM A8301 en 10 μM forskolin (FSK) in geavanceerde DMEM/F-12. Voeg 10 nM Y-27632 en 0,3 nM WNT3a toe (zie de materiaaltabel).
    LET OP: Bewaar het volledige medium maximaal 2 weken bij 2-8 °C.
  4. Bereid het differentiatiemedium (DM) voor: 1% N2, 1% B27, 10 nM gastrine, 50 ng/ml EGF, 100 ng/ml FGF 10, 25 ng/ml HGF, 500 nM A8301, 10 μM DAPT, 25 ng/ml BMP7 en 30 μM dexamethason in Ad-DMEM/F-12 (zie de materiaaltabel).
    LET OP: Bewaar het volledige medium 2 weken bij 2-8 °C.

2. Ontdooien van de iPSC's op de feedervrije plaat

  1. Smeer de celkweekplaat in met basaalmembraanmatrix (BMM).
    1. Ontdooi een injectieflacon met een hoeveelheid BMM een nacht op ijs of ten minste 2 uur voordat u met het coaten begint. Voeg 6 ml koude DMEM/F-12 toe aan een conische buis van 15 ml, voeg onmiddellijk 80 μl ontdooide BMM toe en meng goed.
    2. Gebruik met weefselkweek behandelde putplaten, bedek de kweekplaat met BMM-oplossing en doseer deze om het oppervlak van de putplaat te bedekken. Incubeer de plaat in een broedmachine van 37 °C gedurende ten minste 1 uur voor gebruik. Gooi na de incubatietijd de BMM-oplossing weg en voeg onmiddellijk het iPSC-specifieke medium toe.
  2. Verwijder één injectieflacon iPSC's uit de opslag van vloeibare stikstof met behulp van cryogene handschoenen. Plaats de injectieflacon onmiddellijk op een drijvend buisrek en dompel het rek onder in een waterbad van 37 °C totdat de ijskristallen zijn gesmolten.
    1. Haal de injectieflacon uit het waterbad en veeg de buitenkant grondig af met 70% ethanol. Plaats hem vervolgens in de laminaire kap. Het is belangrijk om snel te zijn bij deze stap.
    2. Breng onder aseptische omstandigheden in een laminaire kap de ontdooide cellen over in een steriele conische buis van 15 ml met 5 ml iPSC-specifiek medium.
      1. Centrifugeer de cellen bij 200 × g (bij kamertemperatuur) gedurende 3 min. Gooi het bovenstaande langzaam weg, suspendeer de cellen in 2 ml iPSC-specifiek medium door een paar keer heel voorzichtig te pipetteren met een serologische pipet van 5 ml en zaai de cellen op de gecoate putjes.
    3. Verplaats de plaat snel om de cellen over het putoppervlak te verspreiden. Incubeer de plaat in de 37 °C, 5% CO2 incubator.
    4. Ververs het kweekmedium elke dag.

3. Endoderm differentiatie

  1. Smeer een nieuwe putplaat in met BMM 1 uur voordat u de iPSC's splitst, zoals vermeld in hoofdstuk 2.
  2. Controleer de integriteit en levensvatbaarheid van de iPSC's onder lichtmicroscopie. Ongedifferentieerde iPSC's zijn cellen met grote kernen, klein cytoplasma en compacte celkolonies met duidelijke randen.
    OPMERKING: Er zijn twee enzymatische oplossingen voor het splitsen van cellen. In het geval van het gebruik van dispase (1 E/ml) moeten gebieden met gedifferentieerde cellen worden verwijderd. Als een specifiek enzym wordt gebruikt, is het niet nodig om de regio's handmatig te differentiëren door te schrapen of te zuigen. Bewaar het specifieke enzym op kamertemperatuur.
  3. Verwarm de iPSC medium tot kamertemperatuur. Zuig het medium op en spoel de iPSC-plaat af met DMEM/F-12 of D-PBS. Voeg 1 ml van het specifieke enzym toe aan een putje van een plaat met 6 putjes, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en zuig vervolgens het specifieke enzym op en incubeer de plaat 5-7 minuten bij 37 °C.
    OPMERKING: De optimale behandelingstijd met enzymen moet worden geoptimaliseerd op basis van de gebruikte iPSC-lijn.
  4. Voeg na de incubatietijd 1 ml voorverwarmd iPSC-medium toe en tik zachtjes op de zijkant van de plaat om ongedifferentieerde kolonieaggregaten los te maken van het oppervlak van de plaat. De optimale grootte van de aggregaten is 50-200 μM.
    1. Meng met een serologische pipet van 5 ml de suspensie voorzichtig en zaai vervolgens de celsuspensie met de gewenste dichtheid op de met BMM beklede put. Incubeer de cellen gedurende 3-5 dagen bij 37 °C om een samenvloeiing van 70% te bereiken.
  5. Voordat u met de differentiatie begint, vervangt u het iPSC-medium door het endoderm-medium (stap 1.1). Ververs het medium elke dag. Beheers de morfologische veranderingen van de cellen tijdens de differentiatiestappen. Cel-celinteracties beginnen te verschijnen na differentiatie en de cellen krijgen een stekelige vorm.

4. eHEPO-vestiging

  1. Voer de verrijking van de EpCAM+ endodermale cellen uit met FACS.
    1. Ontdooi een flesje organoïde-specifieke BMM (zie de Tabel met materialen) op ijs vóór het celsorteerexperiment. Verwarm de weefselkweekplaten een nacht voor op 37 °C vóór het celsorteerexperiment.
    2. Spoel de endodermcellen met 1x PBS. Voeg 300 μL trypsine toe en incubeer gedurende 5 minuten in de incubator. Voeg 3 ml koude DMEM-F12 toe en pipetter met 1.000 μL filtertips om afzonderlijke cellen te genereren.
    3. Vang de celsuspensie op in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de cellen op 300 x g (bij kamertemperatuur) gedurende 5 min. Gooi de bovenstaande weg en was de pellet met 10 ml FACS-buffer (stap 1.2).
    4. Om een eencellige suspensie te maken, filtreert u de cellen eerst met een zeef met mazen van 100 μm en vervolgens met een zeef met mazen van 40 μm.
      NOTITIE: Voordat u de zeef gebruikt, spoelt u het oppervlak van de zeef af met 1 ml FACS-buffer.
    5. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 5 minuten bij 300 x g (bij kamertemperatuur). Tel het celnummer met Trypan Blue8.
    6. De verhouding voor kleuring is 1:11. Resuspendeer bijvoorbeeld 15 x 106 cellen met 105 μL FACS-buffer en voeg 45 μL FcR en 15 μL EpCAM toe (zie de Materiaaltabel). Incubeer de cellen gedurende 10 minuten bij 40 °C en bescherm de buis tegen licht. Voeg na de incubatie 500 μL FACS-buffer toe om de celsuspensie te wassen. Centrifugeer de cellen op 300 x g (bij kamertemperatuur) gedurende 5 min.
    7. Resuspendeer de pellet in 500 μL FACS-buffer. Voeg DAPI (0,5 μM/1 ml, eindconcentratie) toe aan de celsuspensie om de dode cellen te kwantificeren. Houd de cellen op ijs totdat u begint met het sorteren van de cellen.
  2. Sluit de EpCAM en gesorteerde cellen in BMM in. Na het sorteren van de cellen centrifugeren de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g om de FACS-buffer op te nemen. Verwijder de supernatant en suspendeer 3.000-5.000 cellen in 20 μL BMM.
    1. Zaai de cellen door een druppel BMM toe te voegen aan het midden van elke plaat met 48 putjes. Incubeer de cellen gedurende 2 minuten bij 37 °C totdat de BMM gestold is. Keer de plaat voorzichtig terug en bewaar deze nog 10 minuten in de broedmachine. Bedek de druppel met het expansiemedium (250 μL per putje voor een plaat met 48 putjes).
    2. Ververs het organoïde medium elke 3 dagen. Op dag 10-11 zal de organoïde groter zijn dan 100 μm.
  3. Voer eHEPO mechanische dissociatie en differentiatie uit.
    1. Splits elke organoïde druppel in een verhouding van 1:4. Om te splitsen, gooit u het organoïde medium weg en voegt u 500 μL koude Ad-DMEM/F12 toe. Met 1.000 μL filtertips pipetteer je de BMM-druppels krachtig.
    2. Verzamel maximaal 10 BMM-druppels in conische buisjes van 15 ml en voeg 5 ml koude Ad-DMEM/F12 toe. Houd de tube 3-5 minuten op ijs.
    3. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het bovenstaande weg totdat er 1 ml overblijft. Pipipet de celpellet 30-40 keer krachtig met behulp van 200 μL filtertips. Controleer de grootte van de organoïde onder lichtmicroscopie en vermijd zorgvuldig de vorming van een eencellige suspensie.
    4. Voeg na mechanische dissociatie 5 ml koude Ad-DMEM/F12 toe en centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Gooi de supernatant weg en bewaar de suspensie op het ijs totdat de cellen zijn gezaaid.
    6. Zaai een druppel van 50 μL BMM (met 35 μL BMM + 15 μL cellen en Ad-DMEM/F-12 per putje voor een plaat met 24 putjes).
    7. Voeg BMP7 (25 ng/ml, zie de materiaaltabel) toe aan het EM-medium en kweek gedurende 3 dagen. Vervang op dag 4 het medium door het differentiatiemedium (stap 1.4). Ververs het medium elke 3 dagen en kweek de cellen gedurende minimaal 14 dagen.

5. Karakterisering van eHEPO's

  1. Histologisch onderzoek uitvoeren.
    1. Voer paraffine-inbedding uit.
      1. Verwijder het medium, voeg 1-2 ml koude 1x PBS toe en suspendeer de BMM voorzichtig opnieuw in de koude 1x PBS. Breng de organoïden voorzichtig over in een centrifugebuis van 15 ml. Laat de organoïden onder de zwaartekracht bezinken en zuig de PBS dan voorzichtig op. Herhaal de wasstap drie keer.
      2. Voeg 10 ml vers fixeermiddel (10% neutraal gebufferde formaline) toe aan de organoïden en incubeer gedurende 30 minuten. Verwijder voorzichtig het fixeermiddel, voeg 10 ml koude 1x PBS toe en incubeer gedurende 10 minuten. Zuig de PBS voorzichtig op.
      3. Kleur de organoïden in 0,5% eosine (zie tabel met materialen) oplossing opgelost in 96% ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
        OPMERKING: Als immunokleuring moet worden uitgevoerd, kleurt u niet met eosine.
      4. Dehydrateer de organoïden door ze te wassen met een alcoholserie (70% ethanol, 80% ethanol en 96% ethanol) gedurende 5 minuten op kamertemperatuur. Week de organoïden 30 minuten in 100% ethanol (absolute ethanol).
      5. Wis de organoïden met xyleen (zie de materiaaltabel) driemaal gedurende 20 minuten, telkens9.
        LET OP: Xyleen is een zeer giftige en ontvlambare verbinding, dus behandel het met de juiste veiligheidsuitrusting. Vermijd het werken in grote hoeveelheden.
      6. Breng de organoïden voorzichtig over naar een voorverwarmde metalen basisvorm (zie de tabel met materialen) met gesmolten paraffine met behulp van een plastic pipet. Houd de organoïden in gesmolten paraffine driemaal gedurende 30 minuten in een incubator van 65 °C (vervang deze bij elke vervanging door nieuwe, vers gesmolten paraffine).
      7. Veranker de organoïden vervolgens in nieuwe, verse paraffine. Beweeg de organoïden voorzichtig in het midden van de metalen basisvorm.
        OPMERKING: Voor deze stap is het cruciaal om snel te werken, omdat paraffine stolt bij kamertemperatuur.
      8. Breng de metalen basisvorm 10-20 s over op de koude plaat om de organoïden te stabiliseren. Giet vervolgens gesmolten paraffine om de metalen basisvorm te bedekken en voeg een tissuecassette (zie de materiaaltabel) toe aan de bovenkant van de metalen basisvorm voor etikettering. Zorg ervoor dat er voldoende paraffine in de vorm zit en laat ze stollen op de koude plaat. Verwijder de metalen basisvorm.
      9. Snijd secties van 5-7 μm dik met behulp van een standaard microtoom (zie de materiaaltabel). Plaats seriële paraffinesecties op zelfklevende microscoopglaasjes. Laat de dia's een nacht drogen.
    2. Voer hematoxyline en eosine (H&E) en periodieke zuur-Shiff (PAS) kleuring uit.
      1. Plaats de in paraffine ingebedde objectglaasjes een nacht in een broedmachine van 63 °C voor deparaffinisatie. Plaats de dia's de volgende dag drie keer in xyleen gedurende 20 minuten per keer. Laat de dia's niet uitdrogen.
      2. Rehydrateer de dia's met een serie gesorteerde alcohol (100% ethanol, 96% ethanol, 80% ethanol en 70% ethanol) gedurende 2 minuten. Plaats de dia's vervolgens 1 minuut in het gedestilleerde water.
      3. Voer voor H&E-kleuring de volgende stappen uit.
      4. Leg de glaasjes 5 minuten in hematoxylineoplossing. Spoel de dia's 5 minuten af met stromend kraanwater. Kleur de objectglaasjes gedurende 10 s aan met 1% eosine Y-oplossing (zie materiaaltabel).
      5. Dehydrateer de secties met een reeks van 80% ethanol, 96% ethanol en twee veranderingen van 100% ethanol gedurende elk 30 s.
      6. Plaats de dia's in het xyleen om ze drie keer te klaren gedurende 20 minuten per keer.
      7. Monteer de dekglaasjes voorzichtig op de secties van de glasdia's met een montagemedium (zie de materiaaltabel). Zorg ervoor dat er geen bubbels meer zijn.
      8. Voer voor de PAS-kleuring de stappen 5.1.2.4-5.1.2.6 uit, gevolgd door de procedures voor PAS-kleuring zoals gerapporteerd door Akbari et al.10. Monteer vervolgens de dekglaasjes voorzichtig op de secties van de glasgeleiders met het montagemedium. Zorg ervoor dat er geen bubbels meer zijn.
    3. Voer immunohistochemie (IHC) kleuring uit.
      1. Voer stap 5.1.2.1 en stap 5.1.2.2 uit in het H&E-kleuringsprotocol.
      2. Verwarm de glaasjes in 0,1 M citraatbuffer (pH 6,0) gedurende 10 minuten in de magnetron.
      3. Houd vast totdat de dia's zijn afgekoeld tot kamertemperatuur (ongeveer 20 min) en spoel de dia's af met gedestilleerd water.
      4. Zet de glaasjes 10 minuten in vers bereide 3% H2O2 in methanol bij kamertemperatuur. Spoel de dia's vervolgens 1 minuut af in gedestilleerd water.
      5. Blokkeer de niet-specifieke binding van primer-antilichamen door de secties gedurende 1 uur te incuberen met een blokkerende oplossing (2% serum + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) bij kamertemperatuur.
      6. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing en voeg de primaire antilichamen (E-CAD, ALB, EpCAM, A1AT, CK19) toe (zie de materiaaltabel) verdund in de blokkeeroplossing bij 4 °C gedurende een nacht.
      7. Spoel de glaasjes de volgende dag twee keer zorgvuldig af gedurende 10 minuten (.
      8. Voeg de secundaire antilichamen (Geit Anti-Konijn, Geit Anti-Muis) (zie de Materiaaltabel) toe gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en spoel de glaasjes 5 minuten (driemaal) af in gedestilleerd water.
      9. Bereid 3'3 diaminobenzidinetetrahydrochloride (DAB, zie de materiaaltabel) oplossing (dit moet 30 minuten voor gebruik worden bereid).
      10. Breng de DAB-oplossing 1-5 minuten aan op de objectglaasjes en spoel de dia's 5 minuten (drie keer) af in gedestilleerd water.
      11. Bestig de secties gedurende 1 minuut met hematoxyline en spoel de dia's 1 minuut af met stromend kraanwater.
      12. Dehydrateer de secties met een reeks van 80% ethanol, 96% ethanol en twee veranderingen van 100% ethanol gedurende elk 30 s.
      13. Zet de glaasjes 20 minuten (drie keer) in xyleen.
      14. Monteer het dekglaasje voorzichtig op het gedeelte van de glasplaat met een montagemedium. Zorg ervoor dat er geen bubbels meer zijn.
    4. Voer OCT-inbedding uit.
      1. Fixeer de organoïden met vers bereide koude 4% PFA een nacht bij 4 °C. Verwijder voorzichtig het fixeermiddel en was met 1x PBS gedurende 15 minuten (drie keer).
      2. Bereid een 30% sucrose-oplossing (w/v) met gedestilleerd water. Verwijder de 1x PBS en voeg de 30% sucrose toe om de organoïden te dehydrateren.
      3. Incubeer de organoïden een nacht bij 4 °C. Aanvankelijk zullen de meeste weefsels drijven in 30% sucrose en zinken zodra de permeatie is voltooid. De cryoprotectie kan op dit moment als voltooid worden beschouwd.
      4. Bereid droogijs of vloeibare stikstof voor het inbeddingsproces.
      5. Doe twee tot drie druppels OCT (zie de tabel met materialen) in plastic cryomallen. Plaats de organoïden erop in de juiste richting om te snijden.
      6. Giet langzaam en voorzichtig de OCT over de organoïden. Pas op dat u luchtbellen vermijdt. Laat de organoïden 10-15 minuten onder de zwaartekracht bezinken bij kamertemperatuur.
      7. Label de cryomallen voor de vriesstap. Plaats de vormpjes op droogijs of vloeibare stikstof om ze snel in te vriezen. Breng de cryomallen over naar -80 °C en bewaar ze daar tot het sectieproces.
    5. Voer immunofluorescentie (IF) kleuring uit.
      1. Voer bevroren sectiekleuring uit.
        1. Laat de cryo-secties 20-30 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur. Rehydrateer de dia's gedurende 5 minuten (drie keer) met gedestilleerd water. Omring het weefsel met een hydrofobe barrière met behulp van een pap-pen (zie de materiaaltabel).
        2. Voeg 200-300 μL 0,2 % Triton X-100 per sectie toe. Was de dia's voorzichtig gedurende 5 minuten (drie keer). Zorg ervoor dat de secties tijdens de wasstappen niet van de dia's vallen.
        3. Voeg blokkeeroplossing (2% serum + 0,1% Triton X-100 + 0,1% BSA) toe gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
        4. Verwijder voorzichtig de blokkeeroplossing, voeg de primaire antilichamen (E-CAD, A1AT, HNF4α) verdund in de blokkeeroplossing toe (zie de materiaaltabel) en incubeer de objectglaasjes een nacht bij 4 °C.Spoel de objectglaasjes de volgende dag zorgvuldig gedurende 10 minuten (twee keer).
        5. Voeg geschikte secundaire antilichamen toe (Alexa Fluor 488 [Muis], Alexa Fluor 594 [Muis], Alexa Fluor 594 [Konijn]) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur (zie de materiaaltabel) en spoel de objectglaasjes gedurende 5 minuten (driemaal) af in gedestilleerd water.
        6. Voeg 100-200 μL Hoechst of DAPI nucleaire kleurstof per sectie toe gedurende 3 minuten, was de dia's met 1x PBS en herhaal de wasstap drie keer.
        7. Monteer de dekglaasjes op de secties op glazen geleiders met een anti-fade montagemedium. Bewaar de objectglaasjes een nacht bij 4 °C en bescherm ze tegen licht tot het beeldvormingsproces.
      2. Voer kleuring in de hele houder uit.
        1. Voer stap 5.1.1.1 en stap 5.1.1.2 uit in de procedure voor het inbedden van paraffine.
        2. Voeg blokkeeroplossing toe (0,1%-1% Triton X-100, 1% DMSO, 1% BSA en 1% geitenserum in 1x PBS, zie de materiaaltabel) en incubeer de organoïden met blokkeeroplossing gedurende 2-3 uur bij kamertemperatuur.
        3. Verwijder voorzichtig de blokkerende oplossing en voeg de primaire antilichamen (CK19, CK18, ZO-1, ALB) toe die een nacht in de blokkeeroplossing zijn verdund bij 4 °C (zie de materiaaltabel).
        4. Verwijder de volgende dag voorzichtig de oplossing en voeg 1x PBS toe. Laat de organoïden maximaal 10 minuten onder de zwaartekracht bezinken. Verwijder de oplossing voorzichtig en herhaal de wasstap drie keer.
        5. Incubeer de organoïden met de secundaire antilichamen (Alexa Fluor 594 [Muis], Alexa Fluor 488 [Konijn], Alexa Fluor 488 [Muis]) gedurende minimaal 1 uur bij kamertemperatuur. Verwijder de oplossing voorzichtig en herhaal de wasstap vier keer.
        6. Voor nucleaire kleuring incubeer de organoïden gedurende 10 minuten met Hoechst of DAPI nucleaire kleurstof. Was de organoïden door 1x PBS toe te voegen en herhaal de wasstap drie keer. Laat de organoïden naar de bodem van de buis zakken.
        7. Haal met een plastic pasteurpipet de organoïden uit het buisje en plaats ze op glasplaatjes. Zorg ervoor dat u dit doet met minimale schade aan de organoïden.
        8. Verwijder de overtollige PBS en voeg een hoeveelheid (één tot twee druppels) montagemedium toe. Monteer de dekglaasjes voorzichtig op de organoïden op de glasplaatjes met het montagemedium. Houd de objectglaasjes op 4 °C en bescherm ze tegen licht tot het beeldvormingsproces.
  2. Voer elektronenmicroscopie uit.
    1. Fixeer de organoïden met Karnovsky-oplossing (2,5% gebufferd glutaaraldehyde + 2% paraformaldehyde in 0,1 M natriumfosfaatbuffer [Sorensen's buffer], pH 7,4, zie de materiaaltabel) 's nachts bij 4 °C.
    2. Was de organoïden met 0,1 M Sorenson's buffer + 0,1 M sucrose (1:1) gedurende 15 minuten (drie keer). Vervolgens fixeren de organoïden gedurende 90 minuten in 2% natriumfosfaatgebufferd osmiumtetroxide (zie de materiaaltabel).
    3. Veranker de organoïden in 2% warme agar. Snijd de overtollige agar rond de organoïden af met een lancet. Was de organoïden 15 minuten (drie keer) in de buffer van Sorensen.
    4. Dehydrateer met 50% aceton gedurende 15 minuten (twee keer).
    5. Contrasteer 's nachts met 70% aceton + 1% fosfotentinezuur + 0,5% uranylacetaat (zie de materiaaltabel) bij 4 °C.
    6. Dehydrateer de organoïden de volgende dag met een acetonserie (80% aceton, 90% aceton, 96% aceton en 100% aceton) gedurende 15 minuten (twee keer).
    7. Reinig de organoïden 10 minuten (twee keer) met propyleenoxide en doe de organoïden vervolgens 30 minuten bij kamertemperatuur in een mengsel van epon:propyleenoxide (zie de materiaaltabel).
    8. Voeg een nieuwe epoenoplossing toe aan de organoïden en broed een nacht bij 4 °C.
    9. Doe de volgende dag een nieuwe verse epon-oplossing in de basisvorm en sluit vervolgens de organoïden in. Zet 48 uur in een broedmachine bij 65 °C voor polymerisatie.
    10. Snijd de organoïde eponblokken met een ultramicrotoom ingesteld op een doorsnededikte van 50-100 nm. Leg de secties op met elkaar bedekte roosters.
  3. Meet de enzymactiviteit van CYP3A4.
    1. Meet de CYP-activiteit met behulp van een in de handel verkrijgbare kit (zie de materiaaltabel) volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: CYP-enzymen zetten het substraat om in een detecteerbaar tussenproduct 11,12,13. Er zijn twee opties (cellytisch en niet-lytisch) om de CYP-enzymactiviteit te meten. De kit biedt een toepassing om de basale CYP-activiteiten en geïnduceerde CYP-activiteiten na samengestelde behandeling te analyseren.
    2. Voer het experiment uit in drievoud. Lees de luminescentie af met een luminometer en bereken het signaal. Voor normalisatie trypsiniseer je de organoïden en tel je het aantal cellen.
  4. Kwantificering van menselijk albumine uitvoeren.
    1. Vervang de celkweekstof 24 uur vóór de ELISA-test door een vers medium. Verzamel na 24 uur incubatie het celkweekmedium (300-500 μL) en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 500 x g (bij 4 °C) om de celresten en deeltjes te verwijderen. Aliquot de supernatant en bewaar de monsters bij -80 °C (maximaal 3 maanden).
    2. Voer de standaard uit en neem een monster in tweevoud. Gerijpte organoïden scheiden albumine af in het kweekmedium; kwantificeer dit albumine met een ELISA-kwantificeringskit (zie de materiaaltabel). Meet de extinctie met een ELISA-plaatlezer bij 450 nm binnen 30 minuten na het stoppen van de toevoeging van de oplossing. Trypsiniseer de organoïden en tel het aantal cellen dat moet worden genormaliseerd.
  5. Voer de ammoniakeliminatietest uit.
    1. Voer de ammoniakeliminatietest uit volgens de instructies van de fabrikant (zie de materiaaltabel). Voeg kort 1,5 mM NH4Cl toe aan het kweekmedium en incubeer gedurende 24 uur.
    2. Bepaal na de incubatie de ammoniakconcentratie met een ammoniakanalysekit (zie de materiaaltabel). Bereken de metingen met behulp van een multi-mode multi-plaatlezer en normaliseer de waarden naar de celnummers.
  6. Voer de cholylglycylamido-fluoresceïne (CLF)-test uit.
    1. Behandel de organoïden kort met 10 μmol/L CLF (zie de materiaaltabel) en incubeer gedurende 1 uur in een incubator van 37 °C. Was de organoïden na de incubatie met 1x PBS. Voer beeldvorming uit met behulp van fluorescentiemicroscopie.
  7. Voer genexpressie-analyse uit.
    1. Volg de instructies van de RNeasy-kit (zie de materiaaltabel) om het totale RNA uit de eHEPO's te isoleren.
    2. Stel de PCR-reactie in met behulp van een in de handel verkrijgbaar mastermengsel (zie de materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant. Nadat u het PCR-mengsel voor elke primerset hebt bereid, plaatst u 10 μL van elk monster in de qPCR-platen met 96 putjes (tabel 1).
    3. Sluit de platen af met een zelfklevende sealer en centrifugeer de platen vervolgens 2 minuten op 1.000 x g bij kamertemperatuur. Laad de platen in een PCR-machine. Normaliseer de relatieve genexpressie naar een interne controle (RPL41, Tabel 1) en analyseer met behulp van de 2−ΔΔCt-methode 14.

6. Cryopreservatie van de eHEPO's

  1. Label cryovials met een stikstofbestendige marker. Controleer het isopropanolgehalte van de vriescontainer en houd deze 15-30 minuten op 4 °C voordat u met het experiment begint.
  2. Vries een druppel van 50 μL BMM in één cryovial in. Ga verder met de dissociatie van het organoïdemechanisme zoals beschreven in stap 4.3. Na dissociatie suspendeert u het celaggregaat opnieuw in 500 μL koud vriesmedium, brengt u de suspensie vervolgens voorzichtig over naar cryovials en bewaart u deze in de vriescontainer.
  3. Breng de celvriescontainer over naar -80 °C en breng na 24 uur de cryovials over naar vloeibare stikstof voor langdurige opslag.

7. Ontdooien van de eHEPO's

  1. Verwarm een waterbad en Ad-DMEM/F12 voor op 37 °C.
  2. Verwijder een injectieflacon eHEPO's uit de opslag van vloeibare stikstof met behulp van cryogene handschoenen. Plaats de injectieflacon in een waterbad van 37 °C totdat de ijskristallen zijn gesmolten. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g bij 4 °C.
  3. Zuig de supernatant op en ga verder met het zaaien van de eHEPO's zoals beschreven in sectie 4. Bedek de BMM-druppel met het expansiemedium aangevuld met 10 μM Y-27632 (zie de materiaaltabel). Ververs het medium elke 3 dagen en verwijder de ROCK-remmer na 3 dagen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten eerste werden menselijke fibroblastcellen of perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) gekweekt en omgezet in iPSC's via episomale herprogrammering. Het verse knock-outserum was essentieel voor het verkrijgen van gezonde iPSC's. Vervolgens werden de iPSC's in de BMM-gecoate kweekplaten gezaaid met 50%-60% confluentie. Het hebben van iPSC-kolonies van een kleine/middelgrote omvang verbeterde de differentiatie-efficiëntie. Vervolgens werden de iPSC's gedifferentieerd tot defin...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een uitgebreide methode voor het genereren, expanderen en invriezen/ontdooien van leverorganoïden vanaf iPSC's. Dit protocol omvat alle stappen, waaronder het kweken van de iPSC's op de feeder- en feedervrije cultuur, 2-dimensionale endodermdifferentiatie, verrijking van de voorlopercellen met FACS en organoïdevorming, en het genereren van functiewinnende organoïden. Bovendien worden er ook gedetailleerde instructies gegeven voor het valideren en karakteri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen. De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden. Esra Erdal is mede-oprichter van het biotechnologiebedrijf ORGANO-ID.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door de Wetenschappelijke en Technologische Onderzoeksraad van Turkije (TÜBİTAK) via de projecten SBAG-115S465 en SBAG-213S182. Figuur 1 is gegenereerd met behulp van BioRender.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL conische centrifugebuizenCorning430052
37 °C waterbadNüve210.NB9
37 °C, 5 % CO2 incubatorMemmertINCO 153
50 mL conische centrifugebuizenCorning430290
70 µm en 40 µm Cell strainerFalcon352350/ 352340
70% EthanolSigma1009832511
A1ATAbcamab166610Verdunning: 1/500 (IF), 1/50 (IHC)
A-83.01 (TGF-β inhibitor)Tocris Biosciene2939
AcetonIsolab9,01,026
Zelfklevende microscoopslideHistobondC981040
Advanced DMEM-F12Gibco12634-010
AFPAbcamab3980Verdunning: 1/25 (IHC)
AgarEMS10200
ALBAbcamab10241Verdunning: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Alexa Flour 488 (Muis)InvitrogenA11001Verdunning: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 488 (Konijn)InvitrogenA110034Verdunning: 1/1000 (IF)
Alexa Flour 594 (Muis)InvitrogenA11005Verdunning: 1/1000 (IF)
Alexa flour 594 (Konijn) InvitrogenA11037Verdunning: 1/1000 (IF)
Ammonia Assay KitSigma-AldrichMAK-310
AmmoniumchlorideSanta Cruzsc-202936
B27 Supplement 50xGibco12587010
BasisvormSakura4216
b-FGFPeprotech100-18B
Biosafety, CLASS II,SAFETY CABINETThermoSAFE 2020
Gekalibreerde pipettenGilsonF167380
CentrifugeEppendorf5702
Cholylglycylamido-fluoresceinCorning451041
Citraat Buffer pH 6.0Bio-optica15-M103
CK-18Santa Cruzsc-51582Verdunning: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
CK-19Santa Cruzsc-6278Verdunning: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
Confocal MicroscopeZeissLSM880
Cryogene werkhandschoenen en oogbeschermingCryokit5274
CryostatLeicaCM 1950
CryovialbuizenCorning430659
DABRoche11718096001
DAPTSigma-Aldricha5942
DexamethasonSigma-AldrichD4902
Dispase Stem Cell Technologies7923
DMEM F12Gibco31330038
E-CADSanta Cruzsc-8426Verdunning: 1/100 (IF), 1/20 (IHC)
EDTAInvitrogen15575-020
ElektronenmicroscoopZeissSigma500
ELISA kitFortis life sciences bethylE88-129
Embed 812 Inbedding KitEMS14121
EntellanMerck107961
Eosine Y %1Sigma-AldrichHT110332
EpCAMMiltenyi Biotec130-059-901Verdunning: 1/11 (FACS)
EthanolMerck1,00,98,32,511
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco26010066
Forskolin (FSK)Tocris Biosciene1099
Vriescontainer (Mr. Frosty)Thermo5100-0001
VriesmediumGibco12648010
Glas PasteurpipetIsolab084.01.001
Glutamax 100xGibco35050-068
Gluteraldehyde %25, EM gradeEMS16210-1L
Geit Anti-Muis HRPThermo Fisher62-6520Verdunning: 1/1000 (IHC)
Geit Anti-Konijn HRPThermo Fisher31460Verdunning: 1/1000 (IHC)
GeitenserumGibco162-10-072
H2O2Merck107209
HematoxyleineMilliporeHX86017674
HEPES, 1 MGibco15630-056
HNF-4αAbcamab55223Verdunning: 1/50 (IHC)
IJs en droogijszelfgemaaktzelfgemaakt
Incubator (65 °C)NüveEN 400
IsopropanolSigma-Aldrich24137
Leu15 Gastrin I menselijkSigma-AldrichG9145
LuminometerBerthold TechLB 960
Master mix Applied Biosystems43

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huch, M., Koo, B. K. Modeling mouse and human development using organoid cultures. Development. 142 (18), 3113-3125 (2015).
  2. Marsee, A., et al. Building consensus on definition and nomenclature of hepatic, pancreatic, and biliary organoids. Cell Stem Cell. 28 (5), 816-832 (2021).
  3. Takebe, T., et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature. 499 (7459), 481-484 (2013).
  4. Takebe, T., et al. Massive and reproducible production of liver buds entirely from human pluripotent stem cells. Cell Reports. 21 (10), 2661-2670 (2017).
  5. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
  6. Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954(2017).
  7. Ramli, M. N. B., et al. Human pluripotent stem cell-derived organoids as models of liver disease. Gastroenterology. 159 (4), 1471-1486 (2020).
  8. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 21 (1), 3(1997).
  9. Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Histopathology: Methods and Protocols. 1180, 31-43 (2014).
  10. Akbari, S., et al. long-term culture of endoderm-derived hepatic organoids for disease modeling. Stem Cell Reports. 13 (4), 627-641 (2019).
  11. Meisenheimer, P. L., et al. Proluciferin acetals as bioluminogenic substrates for cytochrome P450 activity and probes for CYP3A inhibition. Drug Metabolism and Disposition. 39 (12), 2403-2410 (2011).
  12. Cali, J. J., Ma, D., Wood, M. G., Meisenheimer, P. L., Klaubert, D. H. Bioluminescent assays for ADME evaluation: dialing in CYP selectivity with luminogenic substrates. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (9), 1115-1130 (2012).
  13. Cali, J. J., et al. Luminogenic cytochrome P450 assays. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 2 (4), 629-645 (2006).
  14. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  15. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).
  16. Rowe, R. G., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Genetics. 20 (7), 377-388 (2019).
  17. Akbari, S., Arslan, N., Senturk, S., Erdal, E. Next-generation liver medicine using organoid models. Frontiers in Cell Development and Biology. 7, 345(2019).
  18. Michalopoulos, G. K., Bowen, W. C., Mule, K., Stolz, D. B. Histological organization in hepatocyte organoid cultures. American Journal of Pathology. 159 (5), 1877-1887 (2001).
  19. Shinozawa, T., et al. High-fidelity drug-induced liver injury screen using human pluripotent stem cell-derived organoids. Gastroenterology. 160 (3), 831-846 (2021).
  20. Wu, F., et al. Generation of hepatobiliary organoids from human induced pluripotent stem cells. Journal of Hepatology. 70 (6), 1145-1158 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endodermale organo denpluripotente stamcellenorgano dtechnologieziektemodelleringhepatocytdifferentiatieFACS verrijkingEpCAM positieve cellenalbuminesectiecytochroom P450 activiteit

Gerelateerde artikelen