Dit werk ontwikkelt een antilichaamopnametest voor beeldvorming intra-lineage Notch / DeltaD-signalering bij delende radiale glia-voorlopers van de embryonale zebravishersenen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Antilichaamopnametest voor het volgen van notch / delta-endocytose tijdens de asymmetrische deling van radiale glia-voorlopers van zebravissen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Asymmetrische celdeling (ACD), die twee dochtercellen van verschillende lotgevallen produceert, is fundamenteel voor het genereren van cellulaire diversiteit. In de zich ontwikkelende organen van zowel ongewervelde als gewervelde dieren genereert asymmetrisch delende voorlopers een Notchhi zelfvernieuwende en een Notchlo differentiërende dochter. In de embryonale zebravishersenen ondergaan radiale glia-voorlopers (RGP's) - de belangrijkste neurale stamcellen van gewervelde dieren - meestal ACD om één RGP en één differentiërend neuron te baren. De optische helderheid en gemakkelijke toegankelijkheid van zebravisembryo's maken ze ideaal voor in vivo time-lapse beeldvorming om direct te visualiseren hoe en wanneer de asymmetrie van Notch-signalering wordt vastgesteld tijdens ACD. Recente studies hebben aangetoond dat dynamische endocytose van de Notch ligand DeltaD een cruciale rol speelt bij het bepalen van het lot van cellen tijdens ACD, en het proces wordt gereguleerd door de evolutionair geconserveerde polariteitsregulator Par-3 (ook bekend als Pard3) en het dyneïnemotorcomplex. Om de in vivo smokkelpatronen van Notch-signalerende endosomen in mitotische RGP's te visualiseren, hebben we deze antilichaamopnametest ontwikkeld. Met behulp van de test hebben we de dynamiek van DeltaD-bevattende endosomen tijdens RGP-deling blootgelegd.
Inleiding
Notch-signalering controleert de beslissing over het lot van cellen en patronen tijdens de ontwikkeling in metazoën1, en recente studies hebben aangetoond dat Notch-signalering bij stamceldeling voornamelijk afhankelijk is van endocytische handel 2,3. Endocytosed Notch/Delta kan Notch-signalering in de kern activeren en de transcriptie van Notch-doelgenen 4,5,6 verbeteren. Directionele Notch/Delta endosomale handel werd voor het eerst waargenomen in Drosophila sensory organ precursor (SOP) cell....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
We hebben de AB wild type lijn en transgene lijn Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] gebruikt voor de studie. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California, San Francisco, VS (goedkeuringsnummer: AN179000).
1. Bereiding van zebravisembryo's
- Zet 's middags voor 17.00 uur visoversteektanks op, met één vrouwelijke wildsoort vis en één mannelijke Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] vis door verdelers te gebruiken om ze in elke tank te scheiden.
- Verwijder de scheidingswanden voor 11:00 uur van alle kruisende tanks de volgende ochtend. Bli....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In figuur 2A vertoonden de embryo's geïnjecteerd met Atto647N, zonder binding met het primaire antilichaam, achtergrondfluorescentie in de hersenventrikel. Zeer weinig verzwolgen fluorescerende deeltjes kunnen in de cellen worden waargenomen. De anti-Dld-Atto647N geïnjecteerde zebravisembryo's vertoonden grote hoeveelheden geïnternaliseerde fluorescerende deeltjes in de meeste cellen van de zich ontwikkelende voorhersenen (figuur 2A, rechterpaneel). Na het inzoo.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben een antilichaamopnametest ontwikkeld voor het labelen en afbeelden van endosomale notch / delta-handel in radiale glia-voorlopers van zebravissen met een hoge efficiëntie. Vergeleken met eerdere methoden die werden gebruikt voor het volgen van gelabeld anti-DeltaD-antilichaam in Drosophila SOP-cellen7,8, gebruikte onze methode micro-injectie in plaats van incubatie van monsters in het geconjugeerde antilichaam. Fluorescerend geconjugeerde anti-Dld-antil.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Het project werd ondersteund door NIH R01NS120218, de UCSF Mary Anne Koda-Kimble Seed Award for Innovation en Chan Zuckerberg Biohub.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 35mm glass bottom culture dish | MatTek corporation | P35GC-1.5-10-C | |
| luchtdruk injector | Narishige | IM300 | |
| Anti-Mouse-IgG-Atto647N | Sigma-Aldrich | 50185 | |
| CaCl2.2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Kapillaren, 1,2 mm OD, 0,9 mm ID, met gloeidraad | World Precision Instruments | 1B120F-6 | |
| CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield | Nikin | N/A | Nikon Ti omgekeerde fluorescentiemicroscoop met CSU-W1 groot beeldveld confocal. |
| Dumont Medical Pincet Stijl 5 | Thomas Scientific | 72877-D | |
| Flaming-Brown P897 puller | Sutter Instruments | N/A | https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf |
| KCl | Millipore | 529552 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| micromanipulators | World Precision Instruments | WPI M3301R | |
| Muis anti-Dld | Abcam | AB_1268496 | |
| Muis IgG blokkeerbuffer van Zenon | Thermofisher Scientific | Z25008 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Fenol rood | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Stemi 2000 | Zeiss | N/A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| UltraPureTM lage smeltpunt agarose | Invitrogen | 16520050 |
Referenties
- Baonza, A., Garcia-Bellido, A. Notch signaling directly controls cell proliferation in the Drosophila wing disc. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (6), 2609-2614 (2000).
- Chitnis, A. Developmental Dynamics. 235 (4), 886-894 (2006).
- Daed....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
