Antilichaamopnametest voor het volgen van notch / delta-endocytose tijdens de asymmetrische deling van radiale glia-voorlopers van zebravissen

Samenvatting

Dit werk ontwikkelt een antilichaamopnametest voor beeldvorming intra-lineage Notch / DeltaD-signalering bij delende radiale glia-voorlopers van de embryonale zebravishersenen.

Samenvatting

Asymmetrische celdeling (ACD), die twee dochtercellen van verschillende lotgevallen produceert, is fundamenteel voor het genereren van cellulaire diversiteit. In de zich ontwikkelende organen van zowel ongewervelde als gewervelde dieren genereert asymmetrisch delende voorlopers een Notch^hi zelfvernieuwende en een Notch^lo differentiërende dochter. In de embryonale zebravishersenen ondergaan radiale glia-voorlopers (RGP's) - de belangrijkste neurale stamcellen van gewervelde dieren - meestal ACD om één RGP en één differentiërend neuron te baren. De optische helderheid en gemakkelijke toegankelijkheid van zebravisembryo's maken ze ideaal voor in vivo time-lapse beeldvorming om direct te visualiseren hoe en wanneer de asymmetrie van Notch-signalering wordt vastgesteld tijdens ACD. Recente studies hebben aangetoond dat dynamische endocytose van de Notch ligand DeltaD een cruciale rol speelt bij het bepalen van het lot van cellen tijdens ACD, en het proces wordt gereguleerd door de evolutionair geconserveerde polariteitsregulator Par-3 (ook bekend als Pard3) en het dyneïnemotorcomplex. Om de in vivo smokkelpatronen van Notch-signalerende endosomen in mitotische RGP's te visualiseren, hebben we deze antilichaamopnametest ontwikkeld. Met behulp van de test hebben we de dynamiek van DeltaD-bevattende endosomen tijdens RGP-deling blootgelegd.

Inleiding

Notch-signalering controleert de beslissing over het lot van cellen en patronen tijdens de ontwikkeling in metazoën¹, en recente studies hebben aangetoond dat Notch-signalering bij stamceldeling voornamelijk afhankelijk is van endocytische handel ^2,3. Endocytosed Notch/Delta kan Notch-signalering in de kern activeren en de transcriptie van Notch-doelgenen ^4,5,6 verbeteren. Directionele Notch/Delta endosomale handel werd voor het eerst waargenomen in Drosophila sensory organ precursor (SOP) cellen tijdens de asymmetrische celdeling (ACD), wat resulteerde in een hogere Notch signaleringsactiviteit in pIIa dan in pIIb ^7,8. Antilichaamopnametests met anti-Delta- en anti-Notch-antilichamen zijn toegepast om het endocytische proces in mitotische SOP-cellen te controleren. Inkeping/DeltaD-endosomen bewegen samen met een kinesinemotoreiwit naar de centrale spil tijdens cytokinese en worden asymmetrisch getransloceerd in de pIIa-cel als gevolg van de antiparallel array van de asymmetrische centrale spil op het laatste moment van celdeling ^3,8. Deze studies hebben licht geworpen op de moleculaire mechanismen die de asymmetrische deling in Drosophila SOP-cellen reguleren, maar het is onduidelijk of vergelijkbare endocytische processen optreden bij gewervelde radiale glia-voorlopercellen (RGP's).

Bovendien zijn de moleculaire mechanismen die asymmetrische Notch / DeltaD-signalering reguleren tijdens de RGP-deling van gewervelde dieren niet goed begrepen. Bij zebravissen is gemeld dat de interactie van Notch en Delta de endocytose van de DeltaD-ligand⁹ vergemakkelijkt. Het is onbekend of DeltaD-endocytose van invloed kan zijn op de celbestemming van dochtercellen in de zich ontwikkelende gewervelde hersenen. Recente studies tonen aan dat het injecteren van fluorescerend geconjugeerde anti-DeltaD-antilichamen in de neurale buis Sara-endosomen specifiek in neuro-epitheliale cellen kan labelen, en anti-DeltaD bevattende Sara-endosomen bij voorkeur scheiden in prolifererende dochtercellen¹⁰. Er is gesuggereerd dat Notch-signalering van de endosomen het lot van de dochtercel zou kunnen reguleren. Eerdere resultaten hebben aangetoond dat de meeste RGP-cellen van zebravissen in de zich ontwikkelende voorhersenen ACD ondergaan en dat de bepaling van het lot van de dochtercel afhankelijk is van intralineage Notch / DeltaD-signalering¹¹. Om de aard van de intralineage Notch / DeltaD-signalering in zebravis RGP's op te helderen, hebben we de anti-DeltaD-antilichaamopnametest ontwikkeld in de hersenen van de zebravis. Met behulp van dit protocol hebben we met succes live labeling en beeldvorming van DeltaD endocytische handel in mitotische RGP's uitgevoerd.

Het fluorescerend gelabelde anti-DeltaD-antilichaam wordt efficiënt geïnternaliseerd in de RGP's langs de voorhersenen. Het heeft de ontdekking van directionele handel in DeltaD-endosomen in de asymmetrisch verdelende RGP's^{aanzienlijk vergemakkelijkt 12,13}. Vergeleken met eerdere antilichaamopnameprotocollen die zijn ontwikkeld voor Drosophila notumculturen en het ruggenmerg van de zebravis 10, heeft dit protocol langdurige en zeer efficiënte anti-DeltaD-etikettering in de hersenventrikelcellaag bereikt, met name met minder dan¹⁰ nL micro-geïnjecteerd antilichaammengsel. De achterhersenen ventrikel injectie is erg handig voor het toepassen van de antilichaam opname assay in de zich ontwikkelende hersenen, omdat de achterhersenen ventrikel goed is uitgebreid in zebravis embryo's en gevuld met cerebrospinale vloeistof in de vroege ontwikkelingsfase¹⁴. Door het antilichaammengsel in de achterhersenkamer te injecteren zonder cruciale ontwikkelende weefsels te verwonden, heeft het protocol mogelijke schade aan de beeldvormingszone in de voorhersenen zoveel mogelijk geminimaliseerd. De verlaagde dosering van het geïnjecteerde primaire antilichaam heeft ook mogelijke bijwerkingen van het interfereren met endogene Delta-Notch-signalering in vivo vermeden. Dit protocol kan gemakkelijk worden gecombineerd met andere farmacologische of genetische verstoringen, gebruikt in verschillende ontwikkelingsstadia en mogelijk aangepast aan het volwassen brein en menselijke pluripotente stamcel-afgeleide 2D / 3D-hersenorganoïden. Alles bij elkaar heeft het protocol het mogelijk gemaakt om te begrijpen hoe en wanneer Notch-signaleringsasymmetrie wordt vastgesteld tijdens ACD. De belangrijkste uitdaging voor een succesvolle implementatie van dit protocol is het bereiken van nauwkeurige afgifte van geschikte concentraties van het antilichaam op basis van specifieke experimentele omstandigheden.

Protocol

We hebben de AB wild type lijn en transgene lijn Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] gebruikt voor de studie. Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de University of California, San Francisco, VS (goedkeuringsnummer: AN179000).

1. Bereiding van zebravisembryo's

1. Zet 's middags voor 17.00 uur visoversteektanks op, met één vrouwelijke wildsoort vis en één mannelijke Tg [ef1a:Myr-Tdtomato] vis door verdelers te gebruiken om ze in elke tank te scheiden.
2. Verwijder de scheidingswanden voor 11:00 uur van alle kruisende tanks de volgende ochtend. Blijf rustig en stoor de vissen niet terwijl ze paren. Paaien vindt meestal plaats binnen 30 minuten na het verwijderen van de verdelers. De bevruchte eieren blijven op de bodem van de tank.
   1. Verzamel bevruchte eieren uit de tanks met een gaasfilter. Breng de eieren over door ze af te wassen in een petrischaaltje vol eiwater en onderzoek de embryo's onder een ontleedmicroscoop met een vergroting van 10x tot 20x.
3. Breng de bevruchte embryo's over in een schone petrischaal met ongeveer 20 ml embryomedium (100 ml 1.000x stockoplossing bevat 29,4 g NaCl, 1,27 g KCl, 4,85 g CaCl 2,2H 2 O en 8,13 g MgSO_{4,7H 2}O) met pasteurpipetten met grote boring. Bewaar de embryo's bij 28 °C. Bewaar 50 bevruchte embryo's per petrischaaltje met 30 ml embryomedium bij 28,5 °C.
   OPMERKING: Een paar vissen produceert normaal gesproken 100-300 embryo's en de bevruchting en overlevingskans van gezonde embryo's is meer dan 95% voor elke paring.
4. Haal de volgende ochtend de embryo's om 8:00 uur uit de couveuse, wanneer de embryo's het ontwikkelingsstadium van ~ 18-20 uur na de bevruchting (hpf) hebben bereikt. Observeer ze onder een epifluorescentiemicroscoop met een vergroting van 20x, in eerste instantie met wit licht. Op dat moment bevinden de zebravisembryo's zich in het 20 somietstadium.
   1. Gooi dode embryo's weg die troebel zijn of onder de microscoop zijn gescheurd met behulp van een glazen pipet.
5. Schakel de fluorescentielamp in en kies de RFP-filterinstelling van de microscoop. Selecteer vervolgens de embryo's met sterke rode fluorescentie en breng ze over naar een nieuw gerecht met eiwater.
   1. Dechorioneer de embryo's handmatig met twee fijne tangen (de uiteinden van de tang moeten scherp en onbeschadigd zijn) onder wit licht (tabel met materialen).
   2. Houd het chorion vast met één tang en maak een scheur in het chorion met de andere tang. Open de scheur voorzichtig met de tang en maak deze groot genoeg voor het embryo om door te gaan door het embryo voorzichtig te duwen met de uiteinden van de andere tang.
6. Breng de gedechorioneerde embryo's over in een nieuwe petrischaal met vers embryonaal medium voor een snelle spoeling voor micro-injectie.

2. Bereiding van micro-injectie

1. Gebruik de haarvaten (1,2 mm OD, 0,9 mm ID, met filament) voor het trekken van fijne injectienaalden op een trekker. Ontwerp en optimaliseer het trekprogramma volgens het handboek.
2. Open de punt van de naald met een tang onder een stereodissectiemicroscoop. Maak de diameter van de punt ongeveer 10 μm en de conische hoek ongeveer 30°.
3. Conjugaat het monoklonale anti-Dld-antilichaam van de muis met het anti-Mouse-IgG-Atto647N vóór injectie.
   1. Meng voor elk injectie-experiment 0,5 μl van het anti-Dld-antilichaam (0,5 mg/ml) met 2 μl van het anti-Mouse-IgG-Atto647N-antilichaam (1 mg/ml) door 5-10 keer te pipetteren. Incubeer vervolgens bij kamertemperatuur gedurende ten minste 30 minuten (of op ijs gedurende 2-3 uur).
   2. Voeg na incubatie 2,5 μL blokkeringsbuffer (10 mg/ml muis IgG) en 0,5 μL 0,5% fenolrood toe aan het antilichaammengsel en pipet 10x om grondig te mengen, om eventuele niet-geconjugeerde antilichamen die in het mengsel achterblijven te blokkeren.
      OPMERKING: Bereid voor elk onderzoek een extra mengsel zonder het anti-Dld-antilichaam en gebruik het als controle.
4. Bereid 1% agarose met een laag smeltpunt in het embryomedium. Verwarm het agarosemengsel op 70 °C totdat het mengsel transparant wordt.
   1. Aliquot de agarose-oplossing in microcentrifugebuizen van 2 ml. Bewaar de aliquots in een hitteblok bij ~40 °C.
5. Spoel het embryo gedurende 3 s in de buis met 1% agarose met een laag smeltpunt.
6. Plaats het embryo op een omgekeerd plastic petrischaaldeksel samen met afzonderlijke druppels agarose (~ 30-40 μL) om elk embryo afzonderlijk op het deksel te monteren, zoals weergegeven in figuur 1. Leg de embryo's plat zijdelings in de agarose en houd deze positie aan totdat de agarose bij kamertemperatuur is gestold.
7. Monteer 12 embryo's in drie rijen één voor één zoals hierboven. Bedek alle gemonteerde embryo's in de agarose met eimedium.

3. Micro-injectie

1. Leg de ingebedde embryo's onder de stereomicroscoop en bedek de agarose met eiwater.
2. Stel de luchtdrukinjector samen met micromanipulatoren in en plaats ze dicht bij de microscopen zoals weergegeven in figuur 1. Gebruik de stalen gasfles met gasvormige stikstof (N₂) onder hoge druk als luchtbron.
   1. Open de gasklep pas nadat de embryo's in de agarose zijn gemonteerd. Vervolgens laadt u de voorbereide glazen naald met 2 μL antilichaammengsel op de micromanipulator, zoals weergegeven in figuur 1, bij gebruik van de voorste vulmodule van de micro-injector.
   2. Stel de ingangsdruk af op ~80-90 psi en de injectiedruk op ~20 psi.
3. Kalibreer het injectievolume met behulp van een micrometer onder de microscoop, zoals eerder beschreven¹⁵. Stel de duur van de insteltijd in op 10 ms tot 120 ms, afhankelijk van de grootte van de naaldopening. Geef elke injectiepuls af door op de peddel te tikken. Stem het injectievolume van elke toediening af op ~ 4-5 nL.
4. Prik de punt van de micro-injectienaald door de dorsale dakplaat van de achterste hersenen naar het r0 / r1-scharnierpunt en injecteer ongeveer 10 nL (twee of drie pulsen) antilichaammengsel zonder het hersenweefsel te raken. Observeer de stroom van rode vloeistoffen in de hersenkamer.
   OPMERKING: De achterhersenkamer bevindt zich posterieur aan de achterhersengrens van de middenhersenen. Het geïnjecteerde fenolroodbevattende antilichaammengsel vult de hersenkamer van de achterhersenen naar de voorhersenen onmiddellijk door te diffunderen met hersenvocht.
5. Verwijder na injectie snel de punt van de naald uit het embryo door aan de knop van de micromanipulator te draaien. Voor een succesvolle injectie blijft de rode kleurstof van het geïnjecteerde mengsel stabiel in de hersenkamer zonder in de omringende agarose te lekken.
6. Beweeg de montageplaat onder de microscoop om een ander gemonteerd embryo op een geschikte positie voor herhalingen te lokaliseren.
   1. Na het injecteren van zes tot acht embryo's, pel de agarose met een microchirurgisch mes om de embryo's uit de ingebedde agarose te bevrijden. Breng de micro-geïnjecteerde embryo's over in een verse schaal met 30 ml embryomedium en plaats ze op kamertemperatuur voor de volgende stappen.

4. Montage en time-lapse live imaging

1. Breng na 30 minuten de geselecteerde embryo's over naar 10 ml embryomedium. Voeg 420 μL tricaïnebouillon (4 mg/ml) toe aan 10 ml embryomedium om de embryo's te verdoven.
2. Om de embryo's te monteren, bereidt u agarose met een laag smeltpunt van 0,8% met dezelfde concentratie tricaïne in de buis. Bewaar de aliquots in een hitteblok bij ~40 °C.
3. Gebruik een glazen pipet om de geïnjecteerde embryo's gedurende 3 s onder te dompelen in de warme agarose. Verwijder vervolgens onmiddellijk de embryo's uit de agarose met dezelfde glazen pipet en plaats de embryo's op het midden van 35 mm glazen bodemkweekschalen met een druppel agarose uit de buis. Plaats slechts één embryo per druppel op het glas.
4. Oriënteer de embryo's voorzichtig met een vezelsonde of laadpunt om de dorsale kant van de embryonale hersenen zo dicht mogelijk bij de glazen bodem te houden. Stem de positie van het embryo voorzichtig af om het embryo uit te breiden zonder te krullen, terwijl de agarose geleidelijk stolt.
5. Controleer daarna de positie van het embryo door de glazen bodemschaal om te draaien. Zorg ervoor dat de hele dorsale voorhersenen met de correct gemonteerde embryo's onder de microscoop kunnen worden gezien.
6. Voeg 2-3 ml voorverwarmd embryonaal medium van 28,5 °C met tricaïne toe om het embryo te bedekken. Plaats de schaal op de juiste manier op het temperatuurgeregelde stadium van de confocale microscoop, zoals weergegeven in figuur 1. Stel de temperatuur van de beeldkamer in op 28,5 °C. Het embryo is nu klaar voor beeldvorming.
7. Voer time-lapse live imaging uit met een vast tijdsinterval met behulp van een 40x wateronderdompelingsobjectief.
   1. Gebruik de beeldvormings- en microscoopbesturingssoftware (μMANAGER: https://micro-manager.org/)¹⁶.
   2. Selecteer de beeldvormingskanalen van 564 nm en 647 nm voor het afbeelden van de membraanfluorescentie van MyR-Tdtomato transgene zebravissen en endosomale anti-Dld-Atto647N in de cel (figuur 1).
   3. Stel het laservermogen in op 30% voor beide kanalen. Gebruik een belichtingstijd per z-vlak van 200 ms voor elk kanaal.
   4. Gebruik voor elk gemonteerd zebravisembryo een scanz-stap van 1 μm voor 20 z-vlakken in totaal en een scancyclus van 100 tijdframes.
   5. Stel het tijdsinterval tussen elke scancyclus in op 20 s en de scanmodus als kanaal, segment.

Resultaten

In figuur 2A vertoonden de embryo's geïnjecteerd met Atto647N, zonder binding met het primaire antilichaam, achtergrondfluorescentie in de hersenventrikel. Zeer weinig verzwolgen fluorescerende deeltjes kunnen in de cellen worden waargenomen. De anti-Dld-Atto647N geïnjecteerde zebravisembryo's vertoonden grote hoeveelheden geïnternaliseerde fluorescerende deeltjes in de meeste cellen van de zich ontwikkelende voorhersenen (figuur 2A, rechterpaneel). Na het inzoo...

Discussie

We hebben een antilichaamopnametest ontwikkeld voor het labelen en afbeelden van endosomale notch / delta-handel in radiale glia-voorlopers van zebravissen met een hoge efficiëntie. Vergeleken met eerdere methoden die werden gebruikt voor het volgen van gelabeld anti-DeltaD-antilichaam in Drosophila SOP-cellen^7,8, gebruikte onze methode micro-injectie in plaats van incubatie van monsters in het geconjugeerde antilichaam. Fluorescerend geconjugeerde anti-Dld-antil...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
35mm glass bottom culture dish	MatTek corporation	P35GC-1.5-10-C
luchtdruk injector	Narishige	IM300
Anti-Mouse-IgG-Atto647N	Sigma-Aldrich	50185
CaCl2.2H2O	Sigma-Aldrich	C3306
Kapillaren, 1,2 mm OD, 0,9 mm ID, met gloeidraad	World Precision Instruments	1B120F-6
CSU-W1 Spinning Disk/High Speed Widefield	Nikin	N/A	Nikon Ti omgekeerde fluorescentiemicroscoop met CSU-W1 groot beeldveld confocal.
Dumont Medical Pincet Stijl 5	Thomas Scientific	72877-D
Flaming-Brown P897 puller	Sutter Instruments	N/A	https://www.sutter.com/manuals/P-97-INT_OpMan.pdf
KCl	Millipore	529552
MgSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	M2773
micromanipulators	World Precision Instruments	WPI M3301R
Muis anti-Dld	Abcam	AB_1268496
Muis IgG blokkeerbuffer van Zenon	Thermofisher Scientific	Z25008
NaCl	Sigma-Aldrich	S3014
Fenol rood	Sigma-Aldrich	P0290
Stemi 2000	Zeiss	N/A
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
UltraPureTM lage smeltpunt agarose	Invitrogen	16520050