Vestiging, onderhoud, differentiatie, genetische manipulatie en transplantatie van muis en menselijke traanklier organoïden

Samenvatting

Dit protocol beschrijft hoe traanklierorganoïden afgeleid van primair muis- en menselijk weefsel kunnen worden vastgesteld, onderhouden, genetisch gemodificeerd, gedifferentieerd, functioneel karakteriseren en transplanteren.

Samenvatting

De traanklier is een essentieel orgaan voor oculaire oppervlaktehomeostase. Door het waterige deel van de traanfilm te produceren, beschermt het het oog tegen uitdrogingsstress en externe beledigingen. Er is weinig bekend over traanklier (patho)fysiologie vanwege het ontbreken van adequate in vitro modellen. Organoïde technologie heeft zich bewezen als een nuttig experimenteel platform voor meerdere organen. Hier delen we een protocol om muis- en menselijke traanklierorganoïden vast te stellen en te onderhouden, beginnend met traanklierbiopten. Door de kweekomstandigheden aan te passen, verbeteren we de organoïde functionaliteit van de traanklier. Organoïde functionaliteit kan worden onderzocht door middel van een "huilende" assay, waarbij de traanklierorganoïden worden blootgesteld aan geselecteerde neurotransmitters om traanafgifte in hun lumen te veroorzaken. We leggen uit hoe je dit fenomeen in beeld kunt brengen en kwantificeren. Om de rol van genen van belang in traanklierhomeostase te onderzoeken, kunnen deze genetisch worden gemodificeerd. We beschrijven grondig hoe traanklierorganoïden genetisch kunnen worden gemodificeerd met behulp van basiseditors - van gids-RNA-ontwerp tot organoïde kloongenotypering. Ten slotte laten we zien hoe we het regeneratieve potentieel van menselijke traanklierorganoïden kunnen onderzoeken door orthotopische implantatie in de muis. Samen biedt deze uitgebreide toolset middelen om maan en menselijke traanklierorganoïden te gebruiken om traanklier (patho) fysiologie te bestuderen.

Inleiding

De traanklier is het klierepitheel dat verantwoordelijk is voor de productie van het grootste deel van de waterige laag van de traanfilm¹. De waterige laag van de traanfilm bevat niet alleen water om het oculaire oppervlak te smeren, maar ook een groot repertoire van antimicrobiële componenten die het oculaire oppervlak beschermen tegen infecties². Wanneer de traanklier beschadigd of ontstoken is, treedt droge ogen op, wat resulteert in ongemak voor patiënten en uiteindelijk kan leiden tot verlies van gezichtsvermogen³. In de loop der jaren zijn modelsystemen om de traanklier te bestuderen, met name de menselijke klier^{, beperkt 4,5,6}. Dit heeft bijgedragen aan een kenniskloof met betrekking tot de traanklierfunctie onder fysiologische en pathologische omstandigheden.

Onlangs zijn in vitro modellen ontwikkeld om de traanklier in een schaal ^7,8,9 te bestuderen. Deze traanklierorganoïden zijn afgeleid van volwassen stamcellen die als driedimensionale structuren zijn gekweekt in een extracellulaire matrix aangevuld met een cocktail van groeifactoren die hun regeneratieve capaciteiten in vitro⁷ ondersteunen. Het voordeel van volwassen stamcel (ASC) -afgeleide organoïden is dat ze zeer lang kunnen worden gehandhaafd terwijl ze gezonde weefselkenmerken samenvatten. Dit type organoïde bestaat uitsluitend uit epitheelcellen, in tegenstelling tot geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSC)-afgeleide organoïden, die bijvoorbeeld ook stromale cellen kunnen bevatten. In tegenstelling tot pluripotente stamcel (PSC)-afgeleide organoïden, worden ASC-organoïden rechtstreeks uit volwassen weefsel gemaakt en vereisen ze geen genetische modificaties om te worden uitgebreid. ASC-organoïden drukken volwassen kenmerken^{uit 10}.

Dit protocol bevat een gereedschapskist om traanklierorganoïden af te leiden uit primair weefsel van muizen en mensen. Het protocol beschrijft hoe de functionaliteit van de organoïden verder kan worden verbeterd door eenvoudige groeifactorterugtrekking en hoe de organoïden kunnen worden uitgelokt om traanvocht af te scheiden door een zwellingstest uit te voeren. Dit protocol bevat bovendien een op elektroporatie gebaseerde transfectiemethode om muisorganoïden genetisch te manipuleren met behulp van CRISPR-afgeleide basiseditors. In tegenstelling tot conventionele Cas9, maakt het gebruik van base editors de modificatie van enkele basen in het genoom mogelijk zonder een dubbelstrengs breuk^{te genereren 11,12}. Ten slotte wordt de orthotopische transplantatie van menselijke traanklierorganoïden in immunodeficiënte muizen en de daaropvolgende histologische beoordeling van de engraftment beschreven. Deze traanklier organoïde toolkit kan worden gebruikt in onderzoek naar traanklierregeneratie en -functie en voor genetische en ontstekingsziektemodellering.

Protocol

De muizenexperimenten zijn goedgekeurd door de Commissie Dierethiek van de Koninklijke Nederlandse Akademie van Wetenschappen (KNAW) onder projectvergunning AVD8010020151. De organoïden waren afgeleid van muizenovertollig materiaal. De menselijke traanklierbiopten zijn verzameld uit het afvalmateriaal van patiënten die geopereerd worden in het Universitair Medisch Centrum Utrecht (UMCU) na goedkeuring door de medisch-ethische commissie onder protocolnummer 18-740. Het protocol bevat verschillende secties die worden beschreven in figuur 1.

Figuur 1: Overzicht van het protocol. Deze figuur belicht de verschillende stappen van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OPMERKING: Alle medium- en buffersamenstellingen worden beschreven in aanvullende tabel 1.

1. Vestiging van organoïden uit traanklieren van muizen en menselijke traanklieren

1. Ontleden van de traanklier van de muis
   1. Bereid de dissectiegereedschappen voor, inclusief scharen, tangen en dissectiepads. Euthanaseer een muis door O 2/CO₂ inademing¹³.
   2. Plaats de geëuthanaseerde muis op zijn buik op het snijkussen en speld zijn ledematen vast. Maak het haar tussen de oren van de muis en op het voorhoofd nat met 70% ethanol.
   3. Maak met een dissectieschaar een opening achter de schedel tussen de oren. Verleng deze opening over het voorhoofd tot aan de neus. Gebruik nog steeds een schaar en knip de huid achter de oren om twee flappen te genereren.
   4. Trek de flappen stevig naar de neus totdat de traanklieren bloot liggen, zoals weergegeven in figuur 2A. Pin de flappen vast aan het snijblok. Maak met een schaar een kleine incisie in het membraan boven de traanklier om de traanklier volledig bloot te leggen.
   5. Trek met de tang aan de traanklier. Er moet enige weerstand zijn totdat de belangrijkste traankanaal is gescheurd. Knip indien gewenst het hoofdtraankanaal rechtstreeks met een schaar af.
   6. Plaats de traanklier van de muis in PBS van weefselkweekkwaliteit totdat deze verder wordt verwerkt. Ga verder met het verwerken van de traanklier binnen 2-4 uur om celdood te beperken. Als dit langer duurt, plaats dan de traanklier van de muis in het biopsieverzamelmedium (aanvullende tabel 1).
      OPMERKING: Verschillende traanklieren kunnen worden samengevoegd als grote aantallen organoïden onmiddellijk nodig zijn.
2. Het verzamelen van menselijke traanklierbiopten
   1. Bereid vóór de operatie 20 ml aliquots biopsiemiddel (aanvullende tabel 1) voor in een buis van 50 ml en geef dit aan de chirurg voorafgaand aan de operatie. Dit medium is enkele maanden houdbaar bij 4 °C.
   2. Laat de chirurg op de dag van de operatie een stuk van de traanklier (meestal <1 mm³) bemonsteren en bewaar het in het biopsie-verzamelmedium (aanvullende tabel 1) bij 4 °C.
   3. Verzamel de biopsie om deze zo snel mogelijk te verwerken. Idealiter zou dit dezelfde dag moeten zijn binnen 2 uur na biopsiebemonstering.
3. Organoïde afleiding
   1. Bereid van tevoren het volgende voor: ontdooide extracellulaire matrix (ECM), muis op kamertemperatuur (RT) of menselijk expansiemedium (aanvullende tabel 1), ontdooid collagenase, basismedium (aanvullende tabel 1), twee scalpels, een petrischaal van 10 cm, een zeef van 70 μm gemonteerd op een buis van 15 ml en 12-well suspensieplaten voorverwarmd op 37 °C gedurende 30 minuten.
   2. Bereid het digestiemedium door alle in aanvullende tabel 1 vermelde bestanddelen te combineren. Maak de scalpels in dit medium voor om te voorkomen dat er stukjes weefsel aan blijven plakken.
   3. Haal het weefsel van de muis of de menselijke traanklier uit het medium en plaats het in de petrischaal.
   4. Gebruik de voorbevochtigde scalpels om het weefsel te hakken. Zodra de stukjes weefsel erg klein zijn (d.w.z. <0,5 mm³), plaats je ze in het verteringsmedium door ze met het scalpel van de petrischaal te schrapen. Als de menselijke biopsie al erg klein is, plaats deze dan direct in het verteringsmedium zonder gehakt te maken om weefselverlies te voorkomen.
   5. Incubeer de weefselstukken gedurende maximaal 15 minuten in een waterbad van 37 °C. Keer de buis van 15 ml regelmatig om om de stukken te resuspenderen. Controleer de celdissociatie onder een tafelmicroscoop om het weefsel niet te oververteren.
   6. Vernauw ondertussen een Pasteur-pipet door de punt tijdens het draaien in een vlam te plaatsen en maak hem voor in het basismedium. Om het weefsel efficiënt te dissociëren, moet u ervoor zorgen dat het gat iets kleiner is dan de grootste stukken weefsel die overblijven. Om het dissociatieproces te vergemakkelijken, pipet u het mengsel elke 5 minuten op en neer met de voorbevochtigde versmalde Pasteur-pipet.
   7. Wanneer veel afzonderlijke cellen en kleine klonten zichtbaar zijn onder de microscoop, stop dan de dissociatie door 10 ml van het basismedium toe te voegen. Draai gedurende 5 minuten op 400 x g om de cellen te pelleteren.
   8. Verwijder het supernatant en resuspensie van de pellet in 10 ml van het basismedium om de was te herhalen. Filter het door een zeef van 70 μm om de grote onverteerde weefselstukken en resterende collageenvezels te verwijderen, wat adequate polymerisatie van de ECU zou voorkomen. Draai het eluaat op 400 x g gedurende 5 min.
      OPMERKING: Een rode cel pellet duidt op de aanwezigheid van rode bloedcellen, die normaal gesproken niet interfereren organoïde afleiding. Voor sommige toepassingen, zoals flowcytometrie, moeten de rode bloedcellen echter worden gelyseerd. Incubeer daarvoor de cellen in 5 ml verse rode bloedcellysisbuffer bij RT gedurende 5 minuten en pellet de cellen gedurende 5 minuten op 400 x g .
   9. Verwijder het supernatant en resuspensie van de celkorrel in 100 μL koude ECM voor een enkele traanklier van de muis en in 50 μL koude ECM voor een menselijke biopsie. Wees bij resuspensie voorzichtig om geen bellen te maken, omdat deze ook de ECM-polymerisatie en stabiliteit zouden beïnvloeden.
   10. Zaai tot 100 μL cellen per put van een 12-well suspensieplaat. Gebruik een P200 om ~20 μL druppels in de put te maken. Hoe kleiner de druppels, hoe beter de diffusie van de groeifactoren en voedingsstoffen door de matrix.
   11. Plaats de plaat ondersteboven in een bevochtigde incubator bij 37 °C gedurende 20-30 minuten om de ECU te laten stollen.
   12. Zodra de ECU is gestold, voegt u ~ 1 ml RT-muis of menselijk expansiemedium toe per put van een 12-putplaat. Ververs het medium elke 2-3 dagen totdat de organoïden een grootte van 300 μm bereiken. Zuig daarvoor het medium in de put op en voeg voorzichtig expansiemedium toe aan de zijkant van de put zonder de ECM-druppels aan te raken om ze niet te verstoren.
       OPMERKING: Primocin (100 mg / ml; 1: 1.000 uit commerciële voorraad) kan worden toegevoegd bij isolatie als bacteriële besmetting optreedt. Omdat het echter ook de groei van organoïden vertraagt, is het beter om het niet toe te voegen of na een of twee passages te verwijderen.

2. Uitbreiding van de muis en menselijke traanklier organoïden

1. Na ~ 7 dagen voor muisorganoïden en ~ 10 dagen voor menselijke organoïden, wanneer de organoïden een grootte van ~ 300 μm bereiken, verwijdert u het kweekmedium.
2. Resuspendeer de ECM-druppels die de organoïden bevatten in 1 ml trypsine-oplossing door krachtig op en neer te pipetten met een P1.000 totdat de druppels uit elkaar vallen. Breng dit mengsel over in een buis van 15 ml en incubeer het kort in een waterbad van 37 °C.
3. Gebruik na 2-3 minuten een versmalde en voorbevochtigde Pasteur-pipet om de organoïde suspensie 10x-15x op en neer te pijpen. Controleer de dissociatiestatus van de organoïden onder een tafelmicroscoop; Kleine klonten van ~ 20 cellen moeten worden verkregen. Incubeer langer in het waterbad van 37 °C en herhaal de pipetteerstap totdat de dissociatie bevredigend is.
   OPMERKING: Deze stap kan langer duren voor menselijke organoïden omdat ze meerlagig zijn. Er worden afzonderlijke cellen gegenereerd; Dit heeft geen invloed op de uitgroei van organoïden zolang het grootste deel van de organoïde suspensie uit kleine klontjes bestaat.
4. Stop de dissociatie door 10 ml van het basismedium toe te voegen. Pellet vervolgens de cellen op 400 x g gedurende 5 minuten.
5. Na het verwijderen van het supernatant en de ECU die bovenop de organoïden kunnen liggen (transparante, geleiachtige laag zonder organoïden), resuspensie van de cellen in een geschikt volume koude ECU voordat ze in een suspensieplaat worden geplateerd, zoals aangegeven in stap 1.3.10.
   OPMERKING: Over het algemeen worden traanorganoïden van muizen gesplitst in een verhouding van 1: 5 en menselijke organoïden in een verhouding van 1: 3. Dit betekent dat, wanneer wordt begonnen met organoïden in 100 μL ECM, ze na de splitsing moeten worden geresuspendeerd in respectievelijk 500 μL en 300 μL.
6. Incubeer de plaat ondersteboven in een incubator van 37 °C tot de stolling van de ECU gedurende 30 minuten en bedek de organoïden met de muis of het menselijke expansiemedium bij RT.

3. Cryopreserving van de muis en menselijke traanklier organoïden

1. Om de organoïden te cryopreserveren, splitst u eerst de organoïden in het expansiemedium volgens de instructies in rubriek 2.
2. Ongeveer 3-4 dagen later, wanneer de organoïden zich in een groeifase bevinden, verwijdert u het medium en resuspenseert u 100 μL van de ECU met organoïden in 10 ml koud basismedium. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs om de ECU te helpen dissociëren. Draai de buis regelmatig om om dit proces te vergemakkelijken.
3. Pellet de organoïden op 500 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspensie van de organoïde pellet in 1 ml cryopreservatiemedium (overgebleven ECM heeft geen invloed op cryopreservatie). Breng de organoïde suspensie over in een cryoviaal en onmiddellijk in een vriezer van −80 °C.
   OPMERKING: Bij gebruik van het cryopreservatiemedium zoals beschreven in de materiaaltabel kunnen de cryovialen voor onbepaalde tijd worden bewaard in een vriezer van −80 °C. Als een ander cryopreservatiemedium wordt gebruikt, breng het cryoviaal dan na 24 uur over in een tank met vloeibare stikstof om een optimale conservering te garanderen.
4. Om de organoïden te ontdooien, haalt u de cryovial uit de vriezer en transporteert u deze op droogijs naar een waterbad van 37 °C. Houd de cryovial in het water totdat het grootste deel van de inhoud is ontdooid. Breng de inhoud over in een buis van 15 ml met 10 ml basismedium en draai de cellen gedurende 5 minuten op 400 x g naar beneden.
5. Plaats de organoïden in 100 μL ECM met het expansiemedium, zoals beschreven in stap 2.5 en stap 2.6.

4. Het onderscheiden van traanklierorganoïden en het beoordelen van hun functionaliteit

1. Organoïde differentiatie
   1. Om traanklierorganoïden te onderscheiden, splitst u eerst de organoïden in het expansiemedium volgens de instructies in rubriek 2.
   2. Vervang het expansiemedium na 2 dagen door een differentiatiemedium voor muizen of mensen, zoals beschreven in stap 1.3.12. Ververs het medium elke 2-3 dagen om de muisorganoïden gedurende 5 dagen in dat medium te houden en de menselijke organoïden gedurende 9 dagen.
   3. Om de differentiatie van organoïden na 5 dagen of 9 dagen in het differentiatiemedium te beoordelen, verzamelt u 100 μL ECM met organoïden om het RNA te extraheren. Om dit te doen, resuspensie de ECM-druppels in 1 ml medium in de put met behulp van een P1.000, en breng de organoïde suspensie over in 3 ml ijskoud basismedium. Pellet de organoïden op 500 x g gedurende 5 min.
   4. Gooi het supernatant weg en resuspensie van de pellet in de RNA-extractiebuffer. Voer de downstream RNA-extractie uit volgens de instructies van de RNA-extractiekit. Gebruik het verkregen RNA bijvoorbeeld voor RT-qPCR-analyse van de expressie van stamcellen (TP63, KRT5, KRT14) en gedifferentieerde celmarkers (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...) ¹⁴.
      OPMERKING: Om de relevante expressieanalyse te verkrijgen, meet u de expressie van de gekozen markers in een of meer weefselmonsters. Organoïden gekweekt onder differentiatieomstandigheden hebben de neiging om minder RNA te bevatten.
2. Functionele zwellingstest
   OPMERKING: Gebruik voor dit deel van het protocol menselijke traanklierorganoïden die gedurende ten minste 7 dagen zijn gedifferentieerd. De minimaal vereiste tijd is 7 dagen om voldoende markerexpressie te garanderen voor functionele tearing. Elke put van een plaat met 12 putten vormt één voorwaarde. Het minimum aantal voorwaarden is drie: een positieve controle, een negatieve controle en een testconditie.
   1. Bereid vers 1 ml menselijk differentiatiemedium met afzonderlijke componenten die secretie door de traanklierorganoïden induceren. Voeg bijvoorbeeld 100 μM noradrenaline en 1 μM forskolin toe en meng grondig.
      OPMERKING: Forskolin dient als een positieve controle die meestal maximale zwelling induceert.
   2. Stel met een geautomatiseerde brightfield time-lapse microscoop de posities in die in de plaat moeten worden weergegeven, het tijdsinterval (5 min) en de duur (4 uur). Zorg ervoor dat op elke positie een hele ECM-druppel zichtbaar is.
   3. Vlak voordat u begint met het maken van het beeld en zonder de plaat van de microscoop te verplaatsen, verwijdert u het kweekmedium uit de putjes die zullen worden afgebeeld en vervangt u het door het goed geresuspendeerde medium dat is voorbereid in stap 4.2.1. Neem als negatieve controle een put op met differentiatiemedium dat alleen door differentiatiemedium is vervangen, omdat mediumverfrissing enige organoïde zwelling kan veroorzaken.
   4. Na maximaal 4 uur is de zwellingstest voorbij. Analyseer de resultaten.
      OPMERKING: Deze stappen worden uitgevoerd met een EVOS M7000-microscoop die geautomatiseerde brightfield time-lapse-beeldvorming mogelijk maakt. Raadpleeg voor die microscoop de gedetailleerde handleiding van de fabrikant om de time-lapse-beeldvorming in te stellen. Van belang is dat elke andere microscoop met vergelijkbare kenmerken kan worden gebruikt.
   5. Om de zwelling van organoïden te kwantificeren, meet u de diameter van elke individuele organoïde op 0 h en 4 h. Open de afbeeldingen van een enkele organoïde druppel op 0 h en 4 h in ImageJ.
   6. Klik op het pictogram Rechte lijn in de werkbalk en teken eerst de diameter van een organoïde op 0 h. Gebruik vervolgens het gereedschap Meten in ImageJ (Analyseren > meten) om de lengte van deze lijn en dus de organoïdediameter te meten voordat u gaat zwellen. Herhaal het proces op dezelfde organoïde na 4 uur om de organoïde diameter na zwelling te verkrijgen.
   7. Meet de organoïde diameter van ~20 organoïden per aandoening voor en na de zwellingstest.

5. Een plasmide bouwen om Pax6 uit te schakelen

1. gRNA-ontwerp om uit te schakelen Pax6 met behulp van C > T base editors
   OPMERKING: Er zijn tal van softwareprogramma's beschikbaar voor gRNA-ontwerp. Hier werd Benchling gebruikt omdat dit een geïntegreerd gRNA-ontwerp, annotatie en de uitlijning van Sanger-sporen mogelijk maakt. Alle volgende stappen kunnen dus ook worden uitgevoerd met behulp van alternatieve softwareprogramma's.
   1. Start het gRNA-ontwerpproces door het doelgen in Benchling te visualiseren door op Nieuw (+) te klikken > DNA-sequentie > DNA-sequenties importeren.
   2. Typ op het tabblad Importeren uit database het gen van interesse, Pax6, en druk op Zoeken.
   3. Selecteer de nieuwste build van het muisreferentiegenoom GRCm38 (mm10, Mus musculus) en druk op Importeren.
   4. Selecteer het exon waar het knock-out gRNA kan worden ontworpen door zich aan de volgende regels te houden:
      1. Vermijd het plaatsen van een gRNA in het eerste coderende exon, omdat alternatieve startplaatsen in volgende exonen door de cel kunnen worden gebruikt om het vroeg geïnduceerde stopcodon te omzeilen.
      2. Ontwerp gRNA's in exonen die aanwezig zijn in alle alternatieve transcripten die kunnen optreden door splicing van het Pax6-mRNA . Om dit te garanderen, visualiseert u Pax6 in de Ensembl-genoombrowser en selecteert u het exon dat in alle transcripties wordt gebruikt.
      3. Om alternatieve splicing verder te omzeilen, richt u zich op een exon met een onvolledig codon (een of twee resterende basen van een triplet). Dit is van minder belang maar geeft meer zekerheid over de effecten van geïnduceerde indels. Voor Pax6 zijn exon 4 tot exon 11 een goed doelwit. Kies bovendien een exon dat tryptofaan (W), glutamine (Q) of arginine (R) residuen bevat.
         OPMERKING: Standaard C- > T-basiseditors die SpCas9 gebruiken, hebben een bewerkingsvenster dat zich uitstrekt van nucleotide 4 tot nucleotide 8 vanaf het begin van het gRNA (het verst verwijderd van de PAM). C- > T-base-editors kunnen stopcodons introduceren op alle tryptofaan (W) residuen (TGG tot TGA, TAG of TAA) met een gRNA op de omgekeerde streng, op glutamine (Q) residuen (CAG naar TAG of CAA naar TAA), en ten slotte op arginine (R) residuen (CGA tot TGA) op de voorste streng.
   5. Selecteer het exon + 20 bases stroomopwaarts en stroomafwaarts. Klik aan de rechterkant van het scherm op het doelteken CRISPR en klik op Ontwerp- en analysegidsen.
   6. Vink in het nieuw geopende menu, onder het tabblad Ontwerptype, de Handleidingen voor "basisbewerking" aan (Komor et al., 2016). Houd de richtlengte op 20 nucleotiden en selecteer onder Genoom voor muis GRCm38 (mm10, Mus musculus).
   7. Nadat u op het groene + teken hebt geklikt, detecteert het softwareprogramma automatisch alle protospacer adjacent motif (PAM) -sequenties en maakt aan de rechterkant van het scherm een lijst met alle potentiële gRNA's in het gebied rond het exon van belang.
   8. Blader door de lijst tot het stopcodonteken (*) in een rood vak, dat aangeeft voor een gRNA dat mogelijk een aminozuur in een stopcodon kan veranderen en dus kan resulteren in een knock-out.
   9. In de eerste kolom aan de rechterkant van de gRNA-sequentie worden voor elke doel"C" rond het bewerkingsvenster de in silico voorspelde bewerkingsefficiënties berekend. Zorg ervoor dat de C- > T-bewerking die resulteert in het stopcodon een bewerkingsefficiëntie heeft van ten minste ~ 10.
   10. Klik op de waarde in de kolom Off-Target om te controleren aan welke off-target loci het gRNA kan binden. Vermijd het kiezen van een gRNA dat bindt aan extra genen om de specificiteit te vergroten. Een goed gRNA om Pax6 te bewerken met een C > T base editor richt zich bijvoorbeeld op exon 7 en is 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
   11. Maak een annotatie in het Benchling-bestand door op het pictogram Annotaties in de rechterbovenhoek van het scherm te klikken, gevolgd door Nieuwe annotatie. Geef de annotatie een naam en zorg ervoor dat de juiste gRNA-richting is geselecteerd in het vervolgkeuzemenu Streng .
2. gRNA plasmide generatie
   OPMERKING: Er zijn verschillende vectoren beschikbaar voor gRNA-afgifte in organoïden. Het volgende plasmide werd gebruikt als basis voor gRNA-constructie: pFYF1320 (Addgene #47511, een vriendelijk geschenk van Keith Joung).
   1. Om de gRNA's in pFYF1320 te klonen, implementeert u een inverse PCR-strategie met behulp van de standaard forward primer: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Om de omgekeerde primer te ontwerpen, plakt u het omgekeerde complement van de gRNA-spacersequentie (controleer de gRNA-oriëntatie [+ of - streng]) voor het volgende universele omgekeerde primeronderdeel: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Om exon 7 van muis Pax6 te targeten met behulp van de C > T-basiseditor, is de omgekeerde primer als volgt: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Bestel beide primers.
   2. Voer een inverse PCR-reactie uit met behulp van 1 ng pFYF1320 als sjabloon met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase gedurende 35 cycli bij een gloeitemperatuur van 61 °C.
   3. Voer de PCR-reactie uit op een 1% agarose-gel in TAE-buffer bij 100 V gedurende ~ 45 minuten om het verwachte fragment van 2.281 basenparen (bp) te visualiseren. Voer een gelreiniging uit met behulp van de kit van uw keuze.
   4. Stel de volgende ligatiereactie in: 100 ng opgeschoond PCR-product, Dpn1-enzym om het initiële pFYF1320-sjabloon-DNA te verwijderen en T4-ligase. Incubeer het mengsel gedurende 15 minuten bij 20 °C, 30 min bij 37 °C en 20 minuten bij 80 °C.
   5. Transformeer het reactiemengsel in chemisch competente DH5α-bacteriën en verspreid de bacteriën op agarplaten die ampicilline¹⁵ bevatten.
   6. Pluk en breid de volgende dag drie individuele kolonies uit in 3 ml lysogene bouillon (LB) medium aangevuld met 50 μg / ml ampicilline.
   7. Voer de dag erna een miniprep uit op 1 ml van elk van de drie miniculturen met behulp van een miniprep-kit en bewaar de rest bij 4 °C. Onderwerp het verkregen plasmide aan Sanger-sequencing met de U6_Forward primer om ervoor te zorgen dat het gRNA correct in de vector¹⁶ wordt ingebracht.
   8. Na het identificeren van een enkele bacteriekolonie met het juiste plasmide, ent u 500 μL van de overeenkomstige minicultuur in 50 ml LB aangevuld met ampicilline om het plasmide-DNA 's nachts te versterken. Voer een midi-prep uit de dag na het gebruik van een midiprep-kit. Dit plasmide zal worden gebruikt voor de elektroporatie in rubriek 6.

6. Generatie van Pax6 KO-klonen

1. Organoïde elektroporatie
   1. Begin met muisorganoïden die maximaal 5 dagen eerder zijn gesplitst, zodat ze zich in een proliferatieve toestand bevinden. Gebruik ~300-400 μL organoïde druppeltjes per knock-out. Neem een extra voorwaarde op voor het selecteren van een negatieve controle die geëlektropoeerd zal worden zonder plasmide.
   2. Voer stap 2.1-2.4 uit om de organoïden te dissociëren, maar dissocieer de organoïden langer zodat ze afzonderlijke cellen zijn. Gooi het supernatant weg.
   3. Resuspendeer de cellen in 80 μL van de elektroporatiebuffer.
   4. Bereid in een buis van 1,5 ml de volgende plasmiden voor maximaal 20 μl: 2,5 μg pFYF1320-gRNA-plasmide, 2,8 μg transposasebevattend plasmide, 7,2 μg hygromycineresistentietransposonbevattend plasmide en 7,5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      OPMERKING: Het pFYF1320-gRNA-plasmide codeert voor het eerder ontworpen gRNA, dat de basiseditor naar de doellocus leidt. De pCMV_ABEmax_P2A_GFP plasmide codeert de basiseditor, evenals een GFP-reporter, die kan worden gebruikt om de cellen te controleren die de basiseditor uitdrukken na elektroporatie. Het transposase-bevattende plasmide codeert voor het transposase, dat de hygromycine-resistentiecassette van de hygromycineresistentie transposon-bevattend plasmide ergens willekeurig in het genoom plakt. Cellen die deze cassette in hun genoom hebben opgenomen, worden resistent tegen hygromycine en kunnen positief worden geselecteerd door de toevoeging van hygromycine. Aangezien de co-integratie van verschillende plasmiden zeer waarschijnlijk is, vormt hygromycineresistentie een functionele selectie om te verrijken voor cellen die zijn bewerkt voor Pax6.
   5. Voeg de plasmiden toe aan de cellen en meng goed door op en neer te pipetteren.
   6. Stel de elektroporator in met de volgende parameters voor poringpuls (spanning: 175 V; pulslengte: 5 ms; pulsinterval: 50 ms; aantal pulsen: 2; vervalsnelheid: 10%; polariteit: +) en voor overdrachtspuls (spanning: 20 V; pulslengte: 50 ms; pulsinterval: 50 ms; aantal pulsen: 5; vervalsnelheid: 40%; polariteit: +/-).
   7. Plaats de cellen met de plasmiden in een elektroporatiecuvet. Meet onmiddellijk de weerstand (Ω), die tussen 0,30 A en 0,55 A moet liggen, en elektroporate meteen. Het snel uitvoeren van deze stap is vereist om te voorkomen dat de cellen zich op de bodem van de cuvette nestelen en de elektroporatie-efficiëntie verminderen.
   8. Breng de cellen over in een buis van 1,5 ml en voeg 400 μL elektroporatiebuffer toe, aangevuld met een Rho-kinaseremmer. Laat de cellen zich gedurende 30 minuten herstellen bij RT.
   9. Pellet de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en plaats de cellen in 200 μL ECM. Voeg na het stollen het muisexpansiemedium toe.
   10. Cystische organoïden groeien na 2-3 dagen uit. Bewaak het GFP-signaal, dat de aanwezigheid van C > T-basiseditor onthult, dagelijks.
2. Organoïde selectie
   1. Na ~ 3 dagen, wanneer de organoïden zijn hersteld, voegt u 100 μg / ml hygromycine toe aan het muisexpansiemedium om te selecteren op organoïden die de hygromycineresistentiecassette hebben geïntegreerd. Er is een grote kans dat cellen die één plasmide opnemen, meerdere plasmiden opnemen. Door te selecteren op hygromycine-resistente organoïden worden bewerkte organoïden op de Pax6-locus verrijkt.
   2. Wanneer alle cellen in de negatieve controle dood zijn en overlevende organoïden ~ 300 μm zijn, kies dan de hygromycine-resistente organoïden.
3. Organoïde plukken en genotypering
   1. Bereid steriele P20-tips naast de microscoop en buisjes van 1,5 ml met elk 100 μL trypsine-oplossing op ijs.
   2. Buig een P20 tip met een tang. Observeer de plaat met de overlevende organoïden op een tafelmicroscoop. Wanneer een overlevende organoïde in focus is, verwijder dan het deksel van de plaat. Gebruik de gebogen P20-punt en nog steeds onder de microscoop en zuig elke overlevende organoïde afzonderlijk op en plaats elk van deze in een aparte buis met trypsine-oplossing.
   3. Pak tot 20 klonen. Het aantal klonen dat moet worden gekozen, hangt af van het aantal klonen dat nodig is voor elk experimenteel ontwerp en van de bewerkingsefficiëntie, die varieert afhankelijk van elk gRNA en elke locus.
   4. Wanneer alle klonen zijn geplukt, plaatst u de buizen van 1,5 ml gedurende maximaal 5 minuten in een waterbad van 37 °C. Vortex elke buis regelmatig om de dissociatiesnelheid te verhogen en controleer de organoïden onder de tafelmicroscoop. Wanneer de organoïden worden gedissocieerd in kleine klonten en / of enkele cellen, stop dan de spijsvertering door 1 ml basismedium toe te voegen.
   5. Houd voor elke geplukte kloon ~400 μL tot genotype in een aparte buis van 1,5 ml. Draai de ~ 600 μL links op 500 x g gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant, resuspendien de cellen in 20 μL ECM, plaats ze als een enkele druppel in een put van een 24-wells plaat en voeg muisexpansiemedium toe zonder hygromycine.
   6. Om de klonen te genotyperen, draait u de buizen met ~ 400 μL celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten, verwijdert u het supernatant en resuspenseert u de cellen in 50 μL DNA-extractiebuffer om het DNA te extraheren.
   7. Incubeer de cellen onmiddellijk als volgt: 6 min bij 60 °C, vortex en 4 min bij 95 °C. Dit DNA kan tot 7 dagen worden bewaard bij −20 °C, maar het onmiddellijk uitvoeren van de downstream PCR is het meest optimaal.
   8. Om de locus gericht met het nuclease te versterken, voert u een PCR uit op 2 μL van het geëxtraheerde DNA met behulp van adequate genotyperingsprimers die vooraf zijn besteld en een low-fidelity polymerase. De genotyperingsprimers zijn AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) en TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Het amplicon moet ongeveer 100 bp beginnen vanaf de verwachte bewerkte locus om ervoor te zorgen dat het efficiënt wordt gesequenced.
   9. Voer het PCR-product uit op een agarosegel om de PCR-efficiëntie te beoordelen, zoals vermeld in stap 5.2.3. Wanneer een band van de juiste grootte wordt gedetecteerd, knipt u deze uit de gel om een DNA-gelextractie uit te voeren met behulp van een kit.
   10. Sequentieer het geëxtraheerde DNA van elke organoïde kloon die eerder is gekozen met de genotyperingsprimers.
   11. Stem de verkregen sequenties af op het Pax6-gen in Benchling. Open de geïmporteerde gensequentie uit stap 4.1. Klik op Uitlijningen aan de rechterkant en vervolgens op Nieuwe uitlijning maken. Upload de .ab1-bestanden die zijn verkregen van de sequencingprovider, selecteer DNA als nucleotidetype en druk op Volgende.
   12. Selecteer in het volgende venster Multisequence en het uitlijningsprogramma Auto (MAFFT) voordat u op Uitlijning maken klikt.
   13. Identificeer de genotypen die een homozygoot voortijdig stopcodon hebben (zoals verkregen met base-editors) op beide allelen. Houd de overeenkomstige organoïde klonen om uit te breiden en cryopreserveer deze voor verdere analyse. Idealiter moeten drie verschillende organoïde klonen naast elkaar worden geanalyseerd om potentiële nuclease off-target effecten te omzeilen.

7. Orthotopische transplantatie van menselijke traanklierorganoïden bij NSG-muizen

1. Organoïde preparaat
   1. Menselijke traanklierorganoïden moeten ~ 3 dagen vóór de transplantatiedag worden gesplitst, zoals beschreven in rubriek 2. Zorg er op de dag van transplantatie voor dat de organoïden zich in de proliferatieve fase bevinden om de kans op transplantatie te vergroten.
   2. Om de organoïden uit de ECU te extraheren, voegt u dispase toe aan het kweekmedium om een eindconcentratie van 0,125 U / ml te bereiken. Gebruik een P1.000, resuspensie van de ECM-druppels grondig om ze te verstoren en plaats de plaat gedurende 30 minuten terug in de incubator van 37 °C. Een volume van 100 μL ECM is voldoende om ~10 traanklieren te injecteren.
   3. Resuspendeer de organoïden in 10 ml basismedium om het enzym uit te spoelen. Pellet de cellen op 400 x g gedurende 5 min.
   4. Resuspendeer de cellen (~ 1.500.000) in 50 μL koud menselijk expansiemedium aangevuld met 5% ECM. Plaats de organoïde suspensie op ijs en ga onmiddellijk over tot de transplantatie.
2. Orthotopische transplantatie bij muizen
   1. In de dierenfaciliteit, heb de organoïde suspensie en insulinenaalden op ijs. Zuig de organoïde suspensie op in een koude insulinenaald.
   2. Verdoof een NOD scid gamma (NSG) immunodeficiënte muis met 3% isofluraan om anesthesie te starten. Wanneer de muis slaapt, plaats hem dan snel op zijn zij met de belangrijkste traanklier (halverwege tussen het oog en het oor) toegankelijk.
   3. Injecteer 5 μL van de organoïde suspensie rechtstreeks door de huid in de traanklier. Het maximale volume dat een traanklier van een muis kan bevatten is 5 μL.
   4. Laat de muis herstellen en controleer de muis elke dag om de aanwezigheid van enig ongemak in verband met de transplantatie te beoordelen, vooral op het oog.
3. Beoordeel engraftment
   1. Offer de muis op met O 2/CO₂ inhalatie na maximaal 90 dagen, afhankelijk van of kortdurende of lange termijn engraftment moet worden beoordeeld¹³.
   2. Ontleed de traanklier zoals beschreven in rubriek 1. Fixeer het in 4% formaline gedurende 24 uur bij RT.
   3. Plaats de traanklier in een cassette. Droog de traanklier uit door deze als volgt te incuberen: 2 uur in 70% ethanol, 2 uur in 96% ethanol, 1 uur in 100% ethanol (2x), 2 uur in xyleen en een nacht in vloeibare paraffine bij 58 °C in de oven.
   4. Oriënteer de volgende dag de traanklier naar wens in een metalen mal, vul deze aan met vloeibare paraffine en laat het blok stollen op een koud oppervlak. Dit proces kan het beste worden uitgevoerd met een inbeddingsmachine.
   5. Wanneer het paraffineblok vast is, snijdt u het hele blok in secties van 4-5 μm met behulp van een microtoom. Bewaar alle secties (in de vorm van linten) in een droge, tochtvrije omgeving. De secties kunnen onbeperkt op kamertemperatuur worden bewaard.
   6. Proef één van elke 10 secties die het hele blok beslaan.
      1. Monteer de secties als volgt op een dia: plaats een druppel water op de glijbaan, plaats het gedeelte bovenop, laat het ~ 2 minuten rusten om het uit te rekken op een hete plaat van 42 °C en verwijder het water voorzichtig met papier.
      2. Leg de glaasjes een nacht te drogen in een oven van 58 °C. De dia's kunnen na dit stadium voor onbepaalde tijd bij RT worden bewaard.
   7. Om menselijke cellen van muizencellen te onderscheiden, voert u menselijke nucleaire antigeenkleuring uit op deze secties. Rehydrateer de secties door de volgende wasbeurten uit te voeren: 3 min in xyleen (2x), 1 min in 100% ethanol (2x), 1 min elk in 96% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol, 60% ethanol en 25% ethanol, en ten slotte 1 min in demi-water (2x).
   8. Incubeer de dia's gedurende 15 minuten in PO-buffer (aanvullende tabel 1). Was de dia's 3x in ultrapuur water.
   9. Voer een op citraat gebaseerd antigeen ophalen uit in de autoclaaf:
      1. Plaats de dia's in een autoclaafbestendige schuifhouder in een mand gevuld met citraatbuffer (aanvullende tabel 1). Plaats de korf in de autoclaaf en voer een autoclaafcyclus uit (druk: 10 PSI; temperatuur: 121 °C; tijd: 15 min).
      2. Wanneer de autoclaaf onder druk is gezet, haalt u de mand met de dia's op en plaatst u deze in een RT-waterbad om de dia's naar RT te brengen.
         OPMERKING: De strategie voor het ophalen van antigeen is afhankelijk van het gebruikte antilichaam. Raadpleeg het gegevensblad van de provider om de meest adequate antigeenopvraging uit te voeren.
   10. Plaats de dia's horizontaal, met de sectiezijde naar boven, op een incubatielade. Voeg 500 μL blokkeringsbuffer met 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS toe en incubeer gedurende 1 uur. Verwijder de blokkeringsbuffer.
   11. Bereid de antilichaamoplossing door 1 μl humaan nucleolair antigeen-antilichaam toe te voegen aan 500 μl blokkeringsbuffer per te kleuren dia. Voeg de antilichaamoplossing toe aan elke dia. Incubeer een nacht in een bevochtigde incubatiebak bij 4 °C.
   12. Was de volgende dag de dia's 3x in PBS. Incubeer de dia's met onverdund HRP anti-muis secundair antilichaam gedurende 45 minuten. Was de dia's 3x in PBS.
       VOORZICHTIGHEID. Bereid in een chemische kap de DAB-buffer voor (aanvullende tabel 1). Incubeer de dia's met DAB-buffer gedurende 10 minuten. Gooi afvalmateriaal weg in containers voor organisch chemisch vloeibaar afval.
   13. Was de glijbanen met water. Incubeer de dia's gedurende 2 minuten in hematoxyline om de kernen tegen te gaan. Was de glijbanen in stromend kraanwater gedurende 10 minuten.
   14. Droog de dia's uit door ze elk 1 min te incuberen in 50% ethanol, 60% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol en 90% ethanol, 1 min in 96% ethanol (2x), 1 min in 100% ethanol (2x) en 1 min in xyleen (2x).
   15. Omsluit de dia's met montagemedium en een afdekplaat. Na ongeveer 20 minuten drogen, observeer je de dia's onder een microscoop.
   Ik>

Resultaten

Na de dissectie van de traanklier van de muis (figuur 2A) genereerde de enzymatische en mechanische spijsvertering kleine weefselfragmenten, waaronder de acini en kanalen konden worden onderscheiden (figuur 2B). De resterende grote stukken weefsel zouden de ECU destabiliseren, wat de initiële uitgroei van organoïden zou verminderen. De organoïde afleiding van de traanklier van de muis was succesvol toen cystische organoïden met een diameter van ~ 500 μm werden gevonden na ~ 7 dagen, het stadium waarin de organoïden klaar waren om te worden gesplitst (figuur 2C). Zelfs als de algehele organoïde afleiding succesvol is, kunnen sommige organoïden beginnen te groeien voordat ze uiteindelijk stoppen. Menselijke traanklierorganoïden groeiden binnen 3-4 dagen uit als cysten en bereikten de volgroeide grootte in 10-14 dagen na weefselisolatie (figuur 2D). Voor zowel muizen als mensen mislukte organoïde afleiding soms, met geen of weinig organoïden die uitgroeiden; Dit werd over het algemeen veroorzaakt door oververtering van het weefsel. De traanklierorganoïden van de muis kunnen minstens 40x worden gepasseerd en de menselijke organoïden minstens 20x. Passaging werd gemiddeld om de 7-10 dagen gedaan, afhankelijk van de organoïde groei.

Figuur 2: Oprichting van organoïden van de traanklier van muizen en mensen. (A) Foto's van de verschillende stadia van traanklierdissectie bij muizen. De pijl wijst naar de traanklier onder het beschermende membraan. (B) Brightfield-beelden van traankliercellen van muizen direct na weefselvertering, met inzetstukken die een acinus en een kanaal tonen. (C) Brightfield-beelden van een succesvolle en een mislukte malaanklier organoïde afleiding. (D) Brightfield-beelden van de uitgroei van menselijke organoïden in de loop van 14 dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De traanklierorganoïden bevatten een groot deel van de stamcellen wanneer ze in het expansiemedium worden gekweekt. Om hun differentiatieniveau te verhogen, hebben we een muis en een menselijk differentiatiemedium met een verlaagd groeifactorgehalte opgezet. Na respectievelijk 5 dagen en 7 dagen werden in het differentiatiemedium de organoïden van de muis en de menselijke traanklier dichter (figuur 3A-B). Deze morfologische verandering correleerde met verhoogde functionele eigenschappen. Het aanbrengen van de cyclische AMP-activator forskoline of de neurotransmitter noradrenaline resulteerde in organoïde zwelling (d.w.z. apicale watersecretie) binnen minder dan 3 uur (figuur 3C). Wanneer de zwelling langer dan 3-4 uur duurde, suggereerde dit dat de organoïden niet voldoende gedifferentieerd waren en/of geen functionele markers tot expressie brachten, zoals receptoren voor neurotransmitters.

Figuur 3: Differentiatie van muis en menselijke traanklier organoïden en functionele zwelling assay in menselijke organoïden. (A) Brightfield-beelden van traanklierorganoïden van muizen gekweekt in expansiemedium gedurende 7 dagen en in differentiatiemedium gedurende 5 dagen na 2 dagen in expansiemedium. (B) Brightfield-beelden van menselijke traanklierorganoïden gekweekt in expansiemedium gedurende 11 dagen en in differentiatiemedium gedurende 9 dagen na 2 dagen in expansiemedium. (C) Brightfield-beelden van gedifferentieerde menselijke traanklierorganoïden blootgesteld aan vers differentiatiemedium (controle), aan 1 μM forskolin en aan 100 μM noradrenaline in de loop van 3 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om Pax6 in de traanklierorganoïden van de muis uit te schakelen, werd een plasmide met het gekozen Pax6-gerichte gRNA gegenereerd door PCR en ligatie (figuur 4A). Dit gRNA-bevattende plasmide werd geëlektropoeerd samen met de Piggy-Bac plasmiden (hygromycine resistentie transposon-bevattende en transposase-bevattende plasmiden) en de C > T base editor Cas9 in muis traanklier organoïden gedissocieerd in enkele cellen. Na 3 dagen, toen de organoïden waren hersteld, werden ze blootgesteld aan hygromycine om te selecteren op klonen die de hygromycineresistentiecassette hadden opgenomen. Bij succesvolle elektroporaties groeiden organoïden uit die resistent waren tegen hygromycine (figuur 4B). De groeiende organoïde klonen die groter waren dan ~ 300 μm werden geplukt, idealiter voordat ze spontaan begonnen te differentiëren (figuur 4C). DNA werd geëxtraheerd uit een deel van de organoïde terwijl de rest in cultuur bleef. De PCR-amplificatie van de Pax6-locus waarop het gRNA zich richt, leverde een band van 367 bp op voor elk van de geplukte klonen (figuur 4D). Na sequencing van de versterkte locus werden klonen bewaard die homozygisch C > T bewerkt waren (n = 1). Aan de andere kant werden klonen die niet waren bewerkt (n = 4), heterozygously bewerkt of verkeerd bewerkt (n = 1) weggegooid (figuur 4E). Over het algemeen werd met behulp van dit gRNA gericht op Pax6 één homozygote knock-out muis traanklierkloon van de zes gesequencede verkregen. Sommige klonen groeiden goed uit, maar sommige organoïde klonen gingen verloren na het plukken of begonnen te differentiëren (figuur 4F). Van de 10 geplukte organoïde klonen groeiden er 7 goed uit.

Figuur 4: Base editing-gemedieerde knock-out van Pax6 in muis traanklier organoïden. (A) Sanger sequencing spoor van pFYF1320 na correcte integratie van het gRNA gericht op de Pax6 locus. (B) Brightfield-beelden van traanklierorganoïden van muizen 5 dagen na blootstelling aan hygromycine na elektroporatie. De organoïden werden gekweekt in muisexpansiemedium. Aan de linkerkant is een voorbeeld van een mislukte elektroporatie, waarbij geen kloon resistent is tegen hygromycine die uitgroeit. Aan de rechterkant is een voorbeeld van een succesvolle elektroporatie, waarbij verschillende hygromycine-resistente organoïde klonen overleven. (C) Brightfield-afbeeldingen van klonen die moeten worden geplukt en klonen die niet mogen worden geplukt. (D) Agarose-gel die de versterking van de Pax6-locus met het gRNA toont. In het groen is de band van de verwachte grootte van 367 bp gemarkeerd. (E) Sanger sequencing spoor van drie organoïde klonen die resistent waren tegen hygromycine. De bovenste kloon is onbewerkt. De middelste kloon is een homozygote C- > T-editie en dus een homozygote knock-out. De onderste kloon vertoont twee heterozygote puntmutaties en is ofwel een heterozygote knock-out of een gemengde kloon en is verkeerd bewerkt. (F) Brightfield-afbeeldingen van de geplukte organoïde klonen met verschillende niveaus van uitgroei. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ten slotte werden voor het uitvoeren van menselijke traanklier organoïde orthotopische transplantatie bij muizen organoïden gebruikt die 3 dagen van tevoren waren gesplitst (< 100 μm in diameter). Organoïde engraftment werd bevestigd 1 maand na het injecteren van de organoïden in de traanklier van de muis door kleuring voor een mensspecifieke marker, het menselijke nucleolaire antigeen (figuur 5). De afwezigheid van punctaatkleuring uit alle delen van de traanklier van de muis duidde op een gebrek aan menselijke organoïde engraftment.

Figuur 5: Transplantatie van menselijke traanklierorganoïden in de traanklier van de muis. Kleuring van getransplanteerde traanklieren van muizen voor de menselijke nucleolaire marker om transplantatie 1 maand na transplantatie te controleren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Samenstelling van de media en buffers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Dit protocol beschrijft de oprichting en het gebruik van traanklierorganoïden voor functionele assays, mutatiemodellering en transplantatie. Bij het vaststellen van muis- en menselijke traanklierorganoïden is weefseldissociatie cruciaal. Als het weefsel niet voldoende wordt verteerd, zal de organoïdeopbrengst laag zijn. Als het weefsel oververteerd is, zullen de cellen afsterven en niet uitgroeien als organoïden. Elk weefsel moet gedurende een bepaalde tijd worden verteerd met een specifiek enzym om een optimale uitgroei van organoïden^{te garanderen 14,17,18}. De traanklier is een vrij zacht weefsel waarvoor een collagenasevertering van 5-10 min in combinatie met op pipetteren gebaseerde mechanische dissociatie voldoende is om kleine stukjes weefsel te isoleren. Als afzonderlijke cellen moeten worden verkregen voor toepassingen zoals eencellige RNA-sequencing, kan de dissociatie langer worden uitgevoerd totdat het eencellige stadium is bereikt, maar de dissociatie moet worden gestopt zodra afzonderlijke cellen worden verkregen om een afname van de levensvatbaarheid te beperken. Omdat weefseldissociatie zo cruciaal is, is oververtering de meest waarschijnlijke reden voor het falen van de vorming van traanklierorganoïden.

Het juiste onderhoud van traanklierorganoïden is belangrijk voor hun gebruik. Langdurig onderhoud is een kenmerk van volwassen stamcel-afgeleide traanklierorganoïden, vergeleken met geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide organoïden ^7,17. Om langdurig onderhoud te bereiken, moeten regelmatige organoïde splitsing en mediumveranderingen worden uitgevoerd. Zonder dit beginnen organoïden te differentiëren en ontwikkelen ze een verminderd stamcelpotentieel, wat hun onderhoud op lange termijn belemmert⁷. Bij deze stap kan oververtering de stamcellen doden en het onderhoud van organoïden schaden. Voor regelmatig onderhoud is organoïde dissociatie in afzonderlijke cellen niet vereist. Om klonale knock-out organoïde lijnen te genereren, is het echter van cruciaal belang om te beginnen met enkele cellen. Zo niet, dan zullen de organoïden bestaan uit een mozaïek van cellen met verschillende genetische achtergronden, waardoor het analyseren van het effect van een enkele, gedefinieerde mutatie onmogelijk wordt. Hier beschrijven we het gebruik van een C > T-basiseditor om stopcodons te genereren. Deze genoomeditor vertrouwt op de aanwezigheid van arginine, glutamine of tryptofaancodons binnen 12-18 basen van een NGG PAM. Wanneer bij het ontwerpen van een gRNA niet aan deze voorwaarden wordt voldaan, kunnen conventionele Cas9- of C >T-base-editors met alternatieve PAMs worden gebruikt ^7,18. Conventionele Cas9 introduceert echter dubbelstrengs breuken die resulteren in indels bij reparatie¹¹. Omdat beide allelen verschillende inzinkingen kunnen bevatten, vereist kloongenotypering extra voorzichtigheid. Deconvolutie van de aangebrachte modificaties moet worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat beide allelen out-of-frame indels bevatten en dat de organoïde klonen dus worden uitgeschakeld voor het gen dat op¹⁹ is gericht. Het voordeel van C > T base editors ligt in het feit dat ze kunnen worden gebruikt om puntmutaties te modelleren die niet noodzakelijkerwijs resulteren in stopcodons. Ze kunnen bijvoorbeeld worden gebruikt om specifieke Pax6-mutaties te modelleren die worden aangetroffen bij patiënten met aniridie om hun impact op de traanklierfysiologie^{te bestuderen 20}.

De traanklier scheidt het waterige deel van de traanfilm^{af 1}. Traansecretie kan worden samengevat in menselijke organoïden na differentiatie gemedieerd door groeifactorontwenning en NOTCH-remming. Onder deze omstandigheden ondergaan organoïden terminale differentiatie en kunnen ze niet verder worden onderhouden. Toch kunnen gedifferentieerde traanklierorganoïden de ontwikkeling van scheurende geneesmiddelen begeleiden in de context van droge ogen, mogelijk in schermen met een hoge doorvoer. De scheurtest die in dit protocol wordt gepresenteerd, is degene die momenteel de grootste verandering in organoïdegrootte in korte tijd geeft, wat het gemakkelijker maakt om te kwantificeren in de context van een medicijnscreening ^7,9,17.

Stamceltherapie is veelbelovend voor traanklierregeneratie bij droge ogen²¹. Volwassen stamcel-afgeleide traanklierorganoïden kunnen een bronmateriaal zijn voor dergelijke toepassingen. Het hier gepresenteerde protocol resulteert in menselijke traanklier organoïde engraftment, meestal als cysten. Lage organoïde engraftment kan ontstaan doordat organoïden op de verkeerde plaats worden geïnjecteerd. Het trainen van de injectieprocedure met een kleurstof maakt het volgen van de injectieplaats mogelijk en verbetert uiteindelijk de injectienauwkeurigheid. Als alternatief kan de epidermis van de muis worden ingesneden om directe toegang te hebben tot de traanklier, zoals bij ratten vóór²² uur. Deze methode duurt langer, maar kan nauwkeuriger zijn. Aan de andere kant, met het huidige protocol, integreerden de organoïden niet functioneel in de traanklier van de muis. Vergelijkbare resultaten zijn waargenomen voor iPSC-afgeleide traankliertransplantatie²². De transplantatiemethode kan verder worden verbeterd door de traanklier van tevoren te verwonden, een muismodel met droge ogen te gebruiken en / of de organoïden als enkele cellen of kleine klonten te injecteren. Niettemin kunnen volwassen stamcel-afgeleide traanklierorganoïden en de bijbehorende toolkit de basis vormen voor toekomstige toepassingen in traanklieronderzoek en regeneratieve geneeskunde.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes	Eppendorf	EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637	CAS: 868272-85-9, WAARSCHUWING, 6 g/L oplossing kan geportioneerd worden opgeslagen bij -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer	Promega	M891A	Bewaar bij -20 °C
A83-01	Tocris	2939	Bewaar bij -20 °C, stock bij 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	bewaar bij 4 °C
Agar platen met Ampicilline	Hubrecht Institute
Ampicilline natriumzout	Sigma-Aldrich	A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite	VWR chemicals
B27 supplement	Invitrogen	17504-044	Bewaar bij -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin naald 1 mL	BD Bioscience	324825
Benchtop microscoop DMI1	Leica
Bovine serum albumine (BSA)	MP biomedicals	160069	Bewaar bij 4 °C
BTXpress	BTX	MDS450805
C57BL/6 muizen	Hubrecht Institute
Cassettes	Klinipath	410-02S
CellBanker 1	amsbio	11910	Cryopreservation medium, volg de instructies
Centrifuge	Eppendorf
Citrischuur monohydraat	J.T. Baker	0088	CAS: 5949-29-1
Collageenase I	Sigma Aldrich	C9407	Porties van 20 mg/mL, 20x, bewaar bij -20 °C
Conische buisjes 15 mL	Greiner Bio-One	5618-8271
Conische buisjes 50 mL	Corning	CLS430828-500EA
Dekglasjes 24 mm x 50 mm	Menzel-Gläser	BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellulaire matrix	R&D Systems, Bio-Techne	3533-001-02	Bewaar bij -20 °C, bewaar maximaal 1 maand bij 4 °C
DAPT	Sigma Aldrich	D5942	Bewaar bij -20 °C, stock bij 10 mM, 1000x
Dinatriumwaterstoffosfaat watervrij	VWR chemicals	28026.292	CAS: 7558-79-4
Di-natriumwaterstoffosfaat dihydraat	Sigma-Aldrich	71643	CAS:10028-24-7
Dispase	ThermoFisher Scientific	17105-041	Porties van 50 U/mL, bewaar bij -20 °C tot gebruik, 400x
Disposabele schaalmesje steriel Nr. 10	Swann Morton	3033838
DM4000 microscoop	Leica
dNTPs 25 mM	Promega	U1420	Meng alle 4 nucleotiden door elkaar, bewaar bij -20 °C
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS)	Gibco	14190144	1x
Easy strainers 70 µm	Greiner	542170
Elektroporatie cuvet	Nepagene	EC002S
EnVision+/HRP muis	Agilent	K400111-2
Ethanol 100%	BOOM	84045206;5000	WAARSCHUWING, Gebruik om andere ethanol verdunningen te bereiden
Ethanol 70%	BOOM	84010059.5000	WAARSCHUWING
Ethanol 96%	BOOM	84050065.5000	WAARSCHUWING
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific		Live-imaging brightfield microscoop
FGF10	Peprotech	100-26	Bewaar bij -20 °C, stock bij 100 mg/mL in basismedium, 100x
Fiji	NIH, Fiji ontwikkelaars
Formaldehyde oplossing 4%	Sigma-Aldrich	1.00496	CAS: 50-00-0, WAARSCHUWING
Forskoline	Tocris	1099	Bewaar bij -20 °C, stock bij 10 mM, 10000x
Glutamax	Gibco	35050-061	100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7805	Bewaar bij -20 °C
Haematoxyline	VWR chemicals	10047105	Bewaar bij kamertemperatuur
HEPES	Gibco	15630-080	Bewaar bij 4 °C, 100x
Histocore H en C, Weefsel inbedding machine	Leica
Hot plate	Meidax
Human nucleolar antigeen antilichaam	Abcam	ab-190710
Zoutzuur 5 N	ThermoFisher Scientific	10605882	CAS: 7647-01-0, WAARSCHUWING
Waterstofperoxide 30%	Chem-lab	CL00.2308.1000	CAS: 7722-84-1, WAARSCHUWING
Hygromycine B-gold	InvivoGen	ant-hg	Stock bij 100 mg/µL, 1000x
Hygromycine resistentie cassette-bevattend plasmide			Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/