Geautomatiseerde multimodale stimulatie en gelijktijdige neuronale opname van meerdere kleine organismen

Samenvatting

We presenteren een methode voor de flexibele chemische en multimodale stimulatie en registratie van gelijktijdige neurale activiteit van veel Caenorhabditis elegans-wormen . Deze methode maakt gebruik van microfluïdica, open-source hardware en software en gecontroleerde geautomatiseerde gegevensanalyse om de meting van neuronale verschijnselen zoals aanpassing, temporele remming en stimulusoverspraak mogelijk te maken.

Samenvatting

Fluorescerende genetisch gecodeerde calciumindicatoren hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van neurale dynamica van het niveau van individuele neuronen tot hele hersencircuits. Neurale reacties kunnen echter variëren als gevolg van eerdere ervaring, interne toestanden of stochastische factoren, waardoor de behoefte aan methoden ontstaat die de neurale functie bij veel individuen tegelijk kunnen beoordelen. Terwijl de meeste opnametechnieken een enkel dier tegelijk onderzoeken, beschrijven we het gebruik van breedveldmicroscopie om neuronale opnames op te schalen naar tientallen Caenorhabditis elegans of andere organismen op submillimeterschaal tegelijk. Open-source hardware en software bieden grote flexibiliteit bij het programmeren van volledig geautomatiseerde experimenten die de intensiteit en timing van verschillende soorten stimulus regelen, waaronder chemische, optische, mechanische, thermische en elektromagnetische stimuli. In het bijzonder bieden microfluïdische stroomapparaten nauwkeurige, herhaalbare en kwantitatieve controle van chemosensorische stimuli met een tijdsresolutie van minder dan een seconde. De NeuroTracker semi-geautomatiseerde data-analysepijplijn extraheert vervolgens individuele en populatiebrede neurale reacties om functionele veranderingen in neurale prikkelbaarheid en dynamiek te ontdekken. Dit artikel presenteert voorbeelden van het meten van neuronale aanpassing, temporele remming en stimulus crosstalk. Deze technieken verhogen de precisie en herhaalbaarheid van stimulatie, maken de verkenning van populatievariabiliteit mogelijk en zijn generaliseerbaar naar andere dynamische fluorescerende signalen in kleine biosystemen van cellen en organoïden tot hele organismen en planten.

Inleiding

Calciumbeeldvormingstechnieken hebben de niet-invasieve registratie van in vivo neurale dynamiek in realtime mogelijk gemaakt met behulp van fluorescentiemicroscopie en genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in doelcellen ^1,2,3. Deze sensoren gebruiken meestal een groen fluorescerend eiwit (GFP), zoals de GFP-calmodulin-M13 peptide (GCaMP) familie, om de fluorescentie-intensiteit te verhogen bij neuronale activering en verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Calciumbeeldvorming is vooral krachtig geweest in de nematode C. elegans voor het onderzoeken hoe neuronen en neurale circuits functioneren in levende, zich gedragende dieren 4,5,6,7,8,9,10, omdat hun transparante aard betekent dat er geen chirurgisch proces nodig is voor optische toegang^, en celspecifieke genpromotors richten zich op expressie naar de cellen van belang. Deze technieken maken vaak gebruik van microfluïdische apparaten, die nauwkeurig gecontroleerde omgevingen bieden om biologische, chemische en fysische verschijnselen op kleine fysieke schaal te bestuderen^11,12. Microfluïdische apparaten zijn er in overvloed voor het meten van neurale activiteit, met nieuwe ontwerpen die voortdurend in ontwikkeling zijn, en ze worden gemakkelijk vervaardigd in het onderzoekslaboratorium. Veel ontwerpen vangen echter één dier tegelijk, waardoor de experimentele doorvoer ^7,9,13 wordt beperkt. Neurale reacties variëren vaak aanzienlijk tussen dieren als gevolg van verschillen in eerdere ervaring, interne toestanden zoals stress of honger, of stochastische factoren zoals genexpressieniveaus. Deze verschillen creëren een behoefte aan methoden die tegelijkertijd veel dieren kunnen stimuleren en observeren en informatie van individuen kunnen extraheren⁴.

Bovendien worden bepaalde neuromodulerende verschijnselen alleen duidelijk onder specifieke stimulatieomstandigheden, zoals temporele remming¹⁴, die verwijst naar de korte onderdrukking van reacties wanneer stimulatie snel achter elkaar plaatsvindt. Elektrofysiologische systemen kunnen voor dit doel neurale activiteit over een brede stimulusruimte sturen, waarbij bijvoorbeeld de elektrische pulsstroom, spanning, frequentie, golfvorm, duty cycle en timing van periodieke stimulustreinen worden gemoduleerd. Indirecte stimulatie door natuurlijk gedetecteerde stimuli of optogenetische systemen zou baat hebben bij een vergelijkbare breedte van controlemechanismen. Momenteel worden veel natuurlijke stimuli gepresenteerd op een eenvoudige "aan-uit" manier, zoals geurpresentatie en -verwijdering, met behulp van commerciële systemen die traag zijn geweest om flexibiliteit toe te voegen. Goedkope microcontrollers kunnen nu echter de levering van verschillende soorten stimuli automatiseren op een manier die kan worden aangepast aan de behoeften van de onderzoekers. In combinatie met microfluïdica hebben deze systemen het doel bereikt van verhoogde experimentele doorvoer en flexibiliteit, waardoor neurale reacties op een verscheidenheid aan nauwkeurige stimuli tegelijkertijd kunnen worden gemeten bij veel dieren ^4,6. Multimodale stimulatie kan worden gebruikt om het neuronale circuit verder te ondervragen, bijvoorbeeld door veranderingen in neurale prikkelbaarheid te volgen bij consistent stimuleren voor, tijdens en na een orthogonale verstoring zoals blootstelling aan geneesmiddelen⁴. De voordelen van goedkope, open microscopiesystemen zijn duidelijk voor het bevorderen van wetenschappelijk onderzoek, maar in de praktijk kan de behoefte aan onderdeelinkoop, constructie en prestatievalidatie de adoptie van deze technieken belemmeren.

Dit protocol is bedoeld om een aantal van deze technische uitdagingen te verlichten. Terwijl eerdere protocollen zich richtten op het gebruik van microfluïdische apparaten en basisstimulatie 9,15,17, beschrijven we hier de constructie en het gebruik van een flexibel, geautomatiseerd^, multimodaal stimulusafgiftesysteem voor neurale beeldvorming in C. elegans of andere kleine organismen met behulp van eerder beschreven microfluïdische apparaten⁴. Het open-source systeem is geprogrammeerd via eenvoudige tekstbestanden om de experimenten te definiëren, en het NeuroTracker data-analyseprogramma extraheert semi-automatisch de neurale activiteitsgegevens uit de microscoopvideo's. We demonstreren dit systeem met voorbeelden van het beoordelen van temporele remming, ontremming en stimulus crosstalk met behulp van het chemosensorische neuron AWA, dat depolariseert als reactie op verschillende voedselgeuren of als reactie op licht bij het tot expressie brengen van optogenetische lichtgevoelige ionkanalen ^5,6.

Protocol

1. Neurale beeldvormingsapparatuur

OPMERKING: Zie Lawler en Albrecht¹⁵ voor gedetailleerde instructies over het bouwen van het beeldvormings- en stimulatiesysteem, dat de timing van de microscoopverlichting, beeldacquisitie en stimulusafgifte regelt (figuur 1). Een goedkope Arduino Nano-stimulusregelaar bedient de vloeistofkleppen via digitale signalen naar een klepregelaar en regelt de optogenetische verlichting via analoge spanningssignalen naar een LED-controller. Andere prikkels, zoals trilmotoren en thermische verwarmers, kunnen worden aangestuurd met behulp van digitale of analoge signalen. De stimuluscontroller synchroniseert de stimulatie en beeldopname via camerasignalen, zoals gespecificeerd door de open-source Micro-Manager microscoopbesturingssoftware (μManager)¹⁶. Zie de Tabel met materialen voor details met betrekking tot alle materialen, reagentia, apparatuur en organismen die in dit protocol worden gebruikt.

1. Stel de neurale beeldvormingsapparatuur in, waaronder een epifluorescentiemicroscoop met GFP-optica, een sCMOS-camera met een digitaal blootstellingsuitgangssignaal en een stimuluscontroller¹⁵.
2. Sluit de stimulusregelaar aan op de gewenste systemen via digitale of analoge signalen. Voor de onderstaande voorbeelden worden de volgende systemen gebruikt:
   1. Gebruik een klepregelaar voor chemische stimulatie. Sluit de klepregelaar aan op fluidic solenoïde of knijpventielen (figuur 1)¹⁵.
   2. Gebruik een 615 nm rode LED en controller voor optogenetische stimulatie, gemonteerd boven het microscoopstadium.
3. Stel de computer in met de microscoopbesturingssoftware, maak een configuratievoorinstelling met apparatuurinstellingen en zorg voor een goede werking van de stimulusregeling¹⁵.

2. Fabricage van microfluïdische apparaten

OPMERKING: Zie Lagoy et ^al.17 voor gedetailleerde informatie over het verkrijgen of fabriceren van de hoofdmallen en de productie, het gebruik en de reiniging van de microfluïdische apparaten. Deze stappen worden hieronder samengevat.

1. Verkrijg of fabriceer een mastermal met behulp van het meegeleverde microfluïdische ontwerpbestand (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Voor jongvolwassen C. elegans, zorg ervoor dat de kanaalhoogte 55-70 μm is.
2. Combineer de PDMS-basis en het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10:1 en meng grondig met transferpipetten.
3. Ontgast gedurende 30-60 minuten in een vacuüm exsiccator totdat de bubbels verdwijnen.
4. Plaats de hoofdvorm in een grote petrischaal (150 mm diameter) en giet het ontgaste PDMS tot een diepte van 4-5 mm (~ 100 g). Inspecteer en verwijder stof of bubbels met een transferpipet.
5. Bak op 65 °C op een vlakke ovenplank gedurende 3 uur tot een nacht.
6. Eenmaal uitgehard, gebruik een scalpel om het PDMS uit de mal te snijden en een recht scheermesje om de apparaten te scheiden.
7. Pons inlaat- en uitlaatgaten met een dermale pons van 1 mm en reinig ze met dH 2O, ethanol en opnieuw met dH₂O. Droog het apparaat in een luchtstroom (zie figuur 2A).
8. Reinig beide zijden van het PDMS-apparaat met plakband en verwijder stof of vuil.
9. Bereid de glasglaasjes voor om het microfluïdische apparaat te voltooien zoals beschreven¹⁷. Boor inlaatgaten in de bovenste dia met behulp van een diamantbit en maak de onderste dia hydrofoob door blootstelling aan TFOCS-dampen of door waterafstotende glasbehandeling toe te passen (figuur 2B).
10. Monteer de sandwich van het glazen PDMS-apparaat in een klem (figuur 2C).

3. Voorbereiding van dieren

1. Verkrijg of creëer dieren met genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in de neuronen van belang.
   OPMERKING: Bijvoorbeeld lijn NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) drukt GCaMP en het roodlichtgevoelige kationkanaal Chrimson uit in het AWA-sensorische neuronenpaar⁶. Beide transgenen zijn geïntegreerd in het genoom voor stabiele expressie in elk dier.
2. Plaats een dag voor het experiment ten minste 20 L4 larvale stadium C. elegans per experiment op een nematodengroeimedium (NGM) agarplaat bezaaid met een OP50 E. coli-gazon. Wanneer dit op 20 °C wordt gehouden, worden de wilde dieren de volgende dag in het jongvolwassen stadium gesynchroniseerd.
   OPMERKING: Kies voor arraytransgenen dieren met behulp van een fluorescentiestereoscoop om transgenexpressie bij de gekozen dieren te garanderen.

4. Bereiding van de oplossing

1. Bereid 1x S Basale buffer (100 mM NaCl en 0,05 M KPO₄, pH 6,0) uit een 10x stockoplossing.
2. Bereid 1 mM tetramisole buffer door 1 M bouillon te verdunnen in 1x S Basal. Gebruik deze verlammende buffer om alle prikkels voor te bereiden. Een experiment gebruikt meestal ongeveer 150 ml.
3. Voeg 0,1-1 μg/ml fluoresceïne toe aan de "controle" bufferreservoirs om de stroming te visualiseren.
4. Creëer stimulusoplossingen door seriële verdunning tot de gewenste eindconcentratie. Maak bijvoorbeeld een 10−⁷ verdunning van diacetyl lokstof door eerst een 10⁻³ voorraad te maken.
   OPMERKING: Een kleine hoeveelheid fluoresceïne (0,1-1 μg / ml) kan aan de stimulus- of bufferoplossing worden toegevoegd om de timing van de stimulus te controleren, maar de concentratie moet minimaal zijn om artefacten in neurale fluorescentie te voorkomen.

5. Voorbereiding van microfluïdische apparaten

OPMERKING: Zie Reilly et ^al.9 voor een videoprotocol met de reservoirgeneratie, apparaatinstellingen en het laden van de dieren. Zie ook Lagoy et ^al.17 voor een geschreven protocol met veel nuttige tips.

1. Bereid drie of meer vloeistofreservoirs voor. Bevestig voor elk een spuitreservoir van 30 ml of 60 ml, een aanzuigspuit van 3 ml en een naaldstomp op een drieweg Luer-klep (figuur 2D). Sluit de naald aan op microbore buizen die aan het uiteinde zijn voorzien van een metalen buis. Label de reservoirs, monteer ze op een rek dat aan een ringstandaard is bevestigd en vul ze met de bijbehorende buffer of stimulusvloeistoffen (figuur 2E).
2. Ontgast het geassembleerde microfluïdische apparaat in een vacuüm exsiccator gedurende ~ 1 uur.
3. Vul en verwijder de luchtbellen uit de reservoirslang met behulp van de primingspuit. Vul de uitstroomslangen met buffer.
4. Verwijder het microfluïdische apparaat uit het vacuüm en plaats snel de uitlaatslang en injecteer de vloeistof door het apparaat totdat er een druppel uit één inlaat komt.
5. Gebruik bij deze inlaat een "drop-to-drop" -aansluiting¹⁷ om de overeenkomstige vloeistofinlaatbuis in te brengen (figuur 2F). Zorg ervoor dat er vloeistofdruppels aanwezig zijn op zowel de inlaatslang als het poortgat van het apparaat om te voorkomen dat er een bel wordt geïntroduceerd.
6. Injecteer meer vloeistof uit de uitlaat, sluit de volgende inlaatbuis aan en herhaal dit totdat alle inlaten zijn gevuld. Plaats een stevige blokkeringspen bij ongebruikte inlaten en de wormlaadpoort.
7. Start de stroming door de in- en uitlaatkleppen van Luer te openen. Inspecteer het apparaat op lekken bij de inlaten en de glazen basis. Inspecteer het apparaat op eventuele bellen in de stroomkanalen of inlaten met behulp van de microscoopbeeldopnamesoftware in de live-modus.
   OPMERKING: Als er bubbels aanwezig zijn, wacht dan tot ze in het PDMS-materiaal zijn opgenomen.

6. Laden van dieren

OPMERKING: Zie Lagoy et ^al.17.

1. Breng jongvolwassen dieren over op een niet-gezaaide NGM-agarplaat met behulp van een draadvormige "pick".
2. Overspoel de plaat met ongeveer 5 ml 1x S Basale buffer zodat de dieren zwemmen.
3. Zuig de wormen op in een laadspuit (1 ml of 3 ml spuit met aangehechte slang die is voorgevuld met 1x S Basal).
   1. Beweeg met behulp van een stereoscoop het uiteinde van de slang met één hand onder het vloeistofoppervlak naar elk gewenst dier en trek het in de slang met behulp van de spuit in de andere hand.
   2. Trek de wormen alleen in de slang, niet in de spuit.
      OPMERKING: De slang bevat meestal slechts ongeveer 100 μL. De dieren kunnen in een lokaal gebied worden verdreven en vervolgens met een klein volume weer in de buis worden getrokken.
4. Sluit de uitlaatleiding, verwijder de wormlaadpen en sluit de wormlaadspuit aan op het apparaat met behulp van een drop-to-drop-verbinding.
5. Laat de dieren voorzichtig in de arena stromen, stel een bufferstroom in en laat tot 1 uur immobilisatie door tetramisol toe.
   OPMERKING: Zorg er tijdens de immobilisatieperiode voor dat alleen buffervloeistof de arena binnenkomt. De stimulus- en controlereservoirs kunnen tijdens deze periode worden uitgeschakeld, maar open ze en controleer de juiste stroom voordat de stimulatieproeven worden uitgevoerd.

7. Geautomatiseerde stimulatie en neuronale opname

1. Maak een tekstbestand met stimulusdefinities met de naam "User Defined Acquisition Settings.txt" met een teksteditor (bijv. Kladblok) met de stimulatie-instellingen voor de geautomatiseerde beeldacquisitie (zie voorbeelden in afbeelding 3). De instellingen zijn verdeeld in twee secties:
   1. Microscoop acquisitie instellingen: Definieer het experimenttype (Single-Stimulus of Multi-Pattern), de belichtings- en excitatietiming, de duur en intervallen van de studie en sla de map op.
   2. Stimulatie instellingen: Definieer de parameters voor stimuluscontrole. Een "stimulatiecommando" specificeert de acties die plaatsvinden bij bepaalde videoframes met de syntaxis , waarbij de lettercodes A = klep1, B = klep2, C = klep3, L = LED-licht zijn; Bovendien zijn hoofdletters = aan en kleine letters = uit. De LED-intensiteit wordt ingesteld met de lettercode "i" en een waarde van 0 (uit) tot 255 (maximale helderheid).
      OPMERKING: De LED-intensiteitswaarde van 0 tot 255 stelt de analoge uitgangsspanning in van 0 V tot 5 V. De huidige controller die hier wordt gebruikt, heeft een lineaire intensiteitsschaling en andere moeten worden gekalibreerd met een lichtvermogensmeter.
      1. Voor een single-stimulus-experiment met slechts één herhaalde stimulatieopdracht gebruikt u de indeling in figuur 3A.
      2. Voor een multipatroonexperiment met meerdere stimulatieopdrachten gebruikt u de indeling in afbeelding 3B. Neem een "patroonreeks" van cijfers op die de volgorde van de stimuluspatronen vertegenwoordigt. Voer voor elk patroon een stimulatieopdracht in op een afzonderlijke regel.
         OPMERKING: Een pseudorandomsequentie of m-sequentie kan nuttig zijn om de afhankelijkheid van de stimulusgeschiedenis te onderzoeken.
2. Voer de microscoopbesturingssoftware uit. Controleer of alle vloeistofinlaten open zijn, de stroming naar wens is binnen de arena (zie figuur 2H) en de neuronen van belang in focus zijn binnen het live-venster.
3. Sluit het live venster en voer het script "MultiPattern_RunScript.bsh" uit in de software.
   OPMERKING: Het is nuttig om een testexperiment uit te voeren zonder dieren om de juiste doorstroming en stimulatie te verifiëren. Het vervangen van een andere fluoresceïneconcentratie voor elke stimulusvloeistof kan helpen bij het visualiseren en documenteren van nieuwe stimuluspatronen.
4. Demonteer na het experimenteren het microfluïdische apparaat en spoel alle oppervlakken, slangen en reservoirs af met water.
   OPMERKING: Alle componenten kunnen tientallen keren worden hergebruikt als ze schoon worden gehouden. Zorg ervoor dat reservoirs, slangen en microfluïdische apparaten nat of volledig gedroogd in een luchtstroom worden gehouden om zoutkristallisatie te voorkomen, die kan verstoppen en moeilijk te verwijderen is. De apparaten kunnen in ethanol worden bewaard om te steriliseren, maar moeten volledig worden gedroogd voordat ze opnieuw worden gebruikt (>1 uur bij 65 °C)¹⁷.

8. Data-analyse met NeuroTracker

OPMERKING: NeuroTracker 4,18,19 is een ImageJ/FIJI²⁰ software plugin voor het volgen van de fluorescentie-intensiteit van meerdere neuronen en dieren^, zelfs als ze bewegen tijdens proeven. Deze plug-in slaat gegevens op als tekstbestanden met de positie van elk neuron en de achtergrondgecorrigeerde fluorescentie-intensiteit (F). De fluorescentiegegevens worden genormaliseerd naar de basislijnfluorescentie (F 0), bijvoorbeeld het gemiddelde van enkele seconden voorafgaand aan stimulatie, als Δ F / F 0 = (F -F 0) / F ₀, die kan worden gemiddeld over populaties.

1. Installeer NeuroTracker-scripts volgens de instructies (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Voer NeuroTracker uit door op Plug-ins | Traceren | Neurotracker.
3. Selecteer de map met de . TIF-videobestanden die moeten worden gevolgd en selecteer de gewenste instellingen.
   OPMERKING: Als alleen een subset van de videobestanden moet worden bijgehouden, selecteert u het numerieke bereik van de bestanden die u wilt analyseren bij de prompt. Standaard trackinginstellingen zijn geschikt voor niet-beweeglijke dieren met een resolutie van 250 pix/mm. Pas de parameters proportioneel aan voor andere resoluties. Raadpleeg de gebruikershandleiding¹⁹ voor meer informatie over de instellingen.
4. Stel de intensiteitsdrempel zo in dat de neuronen zichtbaar zijn voor selectie (figuur 4).
5. Open de vensters Helderheid/contrast (B/C) en Drempel met behulp van de afbeelding | Pas het menu aan.
6. Pas in het B /C-venster de schuifregelaars Minimum en Maximum aan totdat de neuronen duidelijk te onderscheiden zijn (Figuur 4A).
7. Schakel in het venster Drempel de optie Donkere achtergrond en Bereik niet opnieuw instellen in.
8. Schuif de frameschuifregelaar om de beweging en intensiteitsveranderingen van het neuron te observeren en noteer dieren die moeten worden uitgesloten van tracking, bijvoorbeeld vanwege overlap met andere dieren.
9. Identificeer de neuronen voor tracking.
10. Pas voor elk dier het drempelniveau zodanig aan dat het rode drempelgebied boven het neuron zichtbaar is in elk frame voor, tijdens en na stimulatie.
11. Klik op het neuron om de positie en het drempelniveau vast te leggen.
12. Herhaal de drempelaanpassing en selectie voor elk dier en neuron om te volgen. Zie figuur 4C voor een goed voorbeeld van het drempelniveau en figuur 4D,E voor voorbeelden van over- en onderdrempel. Eerder geselecteerde neuronen worden aangegeven door een klein vakje.
13. Wanneer alle neuronen zijn geselecteerd, drukt u op de spatiebalk om te beginnen met volgen.
    OPMERKING: Voor aanvullende NeuroTracker-voorbeelden, zie eerdere referenties ^4,19.
14. Controleer het volgproces voor elk dier en breng de nodige correcties aan.
15. Als NeuroTracker pauzeert, is het neuron kwijt. Klik opnieuw op het neuron en pas het drempelniveau indien nodig aan.
16. Als het integratievak naar een ander dier of een niet-neuronale structuur in de buurt springt, drukt u op de spatiebalk om te pauzeren, verplaatst u de schuifregelaar terug naar het eerste foutieve frame en klikt u opnieuw op de juiste neuronlocatie.

9. Dataverkenning en visualisatie

OPMERKING: Het MATLAB-analysescript wordt gebruikt voor gegevensverwerking en visualisatie en om samenvattende PDF's voor elke analyse te genereren.

1. Voer het bestand "NeuroTrackerSummary_pdf.m" uit in MATLAB en selecteer de map met de tekstbestanden van de NeuroTracker-gegevens.
2. Wacht tot er een samenvattende PDF is geproduceerd, zodat het trackingproces kan worden geverifieerd (figuur 5). Dieren worden geïdentificeerd door een getal (figuur 5A) en de neurale reacties van elk dier en elk onderzoek kunnen worden bekeken om de populatievariabiliteit te beoordelen (figuur 5B).
3. Gebruik de functie "databrowse.m" om de neurale gegevens te verkennen, bijvoorbeeld groeperen op proefnummer (figuur 5C), op diernummer (figuur 5D), op stimulatiepatroon of op een andere categorie.

Resultaten

We presenteren verschillende voorbeelden van stimuluspatronen die verschillende neurale verschijnselen beoordelen, waaronder temporele remming, aanpassing en ontremming. Temporele remming is de kortstondige onderdrukking van een neurale respons op een tweede stimuluspresentatie die kort na de eerste presentatie optreedt¹⁴. Om dit fenomeen te testen, werden in een paarpulsexperiment acht patronen gepresenteerd die bestonden uit twee 1 s odorantpulsen gescheiden door een interval va...

Discussie

In dit protocol beschrijven we een open-access microscopiesysteem voor de beoordeling van neurale activiteitsverschijnselen met behulp van de temporeel nauwkeurige levering van verschillende stimuluspatronen. Het microfluïdische platform levert herhaalbare stimuli terwijl het tientallen dieren in het gezichtsveld van de microscoop houdt. Weinig commerciële microscopiesoftwarepakketten maken het eenvoudig programmeren van verschillende stimulustimingpatronen mogelijk, en degenen die dat wel doen, vereisen vaak de handmati...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Bacterie stammen
E. coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Cat# OP50
Experimentele modellen: Organismen/stammen
C. elegans stammen die GCaMP uitdrukken (en optioneel, Chrimson) in gewenste neuronen	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) of overeenkomstige auteurs van gepubliceerd werk	NZ1091, bijvoorbeeld
Chemicaliën, behandelingen en wormvoorbereidingsbenodigdheden
2,3-Butanedion	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	diacetyl, voorbeeld van chemisch stimulus
Calciumchloride, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluoresceïne, natriumzout	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Glaswaterafstotend middel	Rain-X	Cat #800002250	glas waterafstotende behandeling (voor eenmalig gebruik)
Magnesiumchloride, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematoden groeimedium (NGM) agar	Genesee	Cat #: 20-273NGM
Petrischalen (60 mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethyl siloxaan) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Kaliumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Natriumchloride, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilaan (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	glas waterafstotende behandeling (duurzaam)
Software en algoritmen
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-manager	Micro-manager	https://micro-manager.org/
Microscoopbesturingssoftware	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker gegevensanalysesoftware	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Geautomatiseerd microscoop en stimulatiesysteem
Axio Observer.A1 omgekeerd microscoop ingesteld voor epifluorescentie (GFP filter kubussen, 5× objectief of soortgelijk)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED verlichter	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS camera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-weg Miniatuur Diafragma Isolatieklep (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Klep 1: Controle
2-weg normaal gesloten (NC) Pinch klep	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Klep 2: Uitstroom
3-weg Pinch klep	NResearch	Cat #161P091	Klep 3: Stimulus selectie
Optogenetische stimulatie LED en controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S en #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digitale/manuele klepcontroller	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Draden en connectoren	diverse	Zie Fig. 2 van Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Voorbereiding van microfluïdisch apparaat
Dremel variabele snelheidsroterende snijder 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Stel snelheid in op 5k RPM voor het snijden van glas
Dremel boorpers roterend gereedschapswerkstation	Dremel	Cat #220-01
Diamantboortje	Dremel	Cat #7134
Glaze slide, 1 mm dik	VWR	Cat #75799-268
Glas scribe (diamant scriber)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-weg stopcock	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G stompe naald	VWR	Cat #89134-100
Microfluïdisch apparaat	Overeenkomstige auteur of fabriceren vanuit CAD-bestanden geassocieerd met dit artikel	N/A
Microfluïdisch apparaatklem	Warner Instruments (of machinewerkplaats)	P-2
Microfluïdische buis, 0,02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Buis 19 G, 0,5″	New England Small Tube	Cat #NE-1027-12