Methodenartikel

Geautomatiseerde multimodale stimulatie en gelijktijdige neuronale opname van meerdere kleine organismen

DOI:

10.3791/65042

⸱

3 maart 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, 2Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, 3Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren een methode voor de flexibele chemische en multimodale stimulatie en registratie van gelijktijdige neurale activiteit van veel Caenorhabditis elegans-wormen . Deze methode maakt gebruik van microfluïdica, open-source hardware en software en gecontroleerde geautomatiseerde gegevensanalyse om de meting van neuronale verschijnselen zoals aanpassing, temporele remming en stimulusoverspraak mogelijk te maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fluorescerende genetisch gecodeerde calciumindicatoren hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van neurale dynamica van het niveau van individuele neuronen tot hele hersencircuits. Neurale reacties kunnen echter variëren als gevolg van eerdere ervaring, interne toestanden of stochastische factoren, waardoor de behoefte aan methoden ontstaat die de neurale functie bij veel individuen tegelijk kunnen beoordelen. Terwijl de meeste opnametechnieken een enkel dier tegelijk onderzoeken, beschrijven we het gebruik van breedveldmicroscopie om neuronale opnames op te schalen naar tientallen Caenorhabditis elegans of andere organismen op submillimeterschaal tegelijk. Open-source hardware en software bieden grote flexibiliteit bij het programmeren van volledig geautomatiseerde experimenten die de intensiteit en timing van verschillende soorten stimulus regelen, waaronder chemische, optische, mechanische, thermische en elektromagnetische stimuli. In het bijzonder bieden microfluïdische stroomapparaten nauwkeurige, herhaalbare en kwantitatieve controle van chemosensorische stimuli met een tijdsresolutie van minder dan een seconde. De NeuroTracker semi-geautomatiseerde data-analysepijplijn extraheert vervolgens individuele en populatiebrede neurale reacties om functionele veranderingen in neurale prikkelbaarheid en dynamiek te ontdekken. Dit artikel presenteert voorbeelden van het meten van neuronale aanpassing, temporele remming en stimulus crosstalk. Deze technieken verhogen de precisie en herhaalbaarheid van stimulatie, maken de verkenning van populatievariabiliteit mogelijk en zijn generaliseerbaar naar andere dynamische fluorescerende signalen in kleine biosystemen van cellen en organoïden tot hele organismen en planten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Calciumbeeldvormingstechnieken hebben de niet-invasieve registratie van in vivo neurale dynamiek in realtime mogelijk gemaakt met behulp van fluorescentiemicroscopie en genetisch gecodeerde calciumindicatoren uitgedrukt in doelcellen 1,2,3. Deze sensoren gebruiken meestal een groen fluorescerend eiwit (GFP), zoals de GFP-calmodulin-M13 peptide (GCaMP) familie, om de fluorescentie-intensiteit te verhogen bij neuronale activering en verhoogde intracellulaire calciumspiegels. Calciumbeeldvorming is vooral krachtig geweest in de nematode C. elegans voor het onde....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Neurale beeldvormingsapparatuur

OPMERKING: Zie Lawler en Albrecht15 voor gedetailleerde instructies over het bouwen van het beeldvormings- en stimulatiesysteem, dat de timing van de microscoopverlichting, beeldacquisitie en stimulusafgifte regelt (figuur 1). Een goedkope Arduino Nano-stimulusregelaar bedient de vloeistofkleppen via digitale signalen naar een klepregelaar en regelt de optogenetische verlichting via analoge spanningssignalen naar een LED-controller. Andere prikkels, zoals trilmotoren en thermische verwarmers, kunnen worden aangestuurd met behulp van digit....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteren verschillende voorbeelden van stimuluspatronen die verschillende neurale verschijnselen beoordelen, waaronder temporele remming, aanpassing en ontremming. Temporele remming is de kortstondige onderdrukking van een neurale respons op een tweede stimuluspresentatie die kort na de eerste presentatie optreedt14. Om dit fenomeen te testen, werden in een paarpulsexperiment acht patronen gepresenteerd die bestonden uit twee 1 s odorantpulsen gescheiden door een interval va.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol beschrijven we een open-access microscopiesysteem voor de beoordeling van neurale activiteitsverschijnselen met behulp van de temporeel nauwkeurige levering van verschillende stimuluspatronen. Het microfluïdische platform levert herhaalbare stimuli terwijl het tientallen dieren in het gezichtsveld van de microscoop houdt. Weinig commerciële microscopiesoftwarepakketten maken het eenvoudig programmeren van verschillende stimulustimingpatronen mogelijk, en degenen die dat wel doen, vereisen vaak de handmati.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken Fox Avery voor het testen van deze protocollen en het beoordelen van het manuscript en Eric Hall voor programmeerhulp. Financiering voor de hierin gepresenteerde methoden werd gedeeltelijk verstrekt door de National Science Foundation 1724026 (D.R.A.).

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Bacterie stammen
E. coli (OP50)Caenorhabditis Genetics Center (CGC)Cat# OP50
Experimentele modellen: Organismen/stammen
C. elegans stammen die GCaMP uitdrukken (en optioneel, Chrimson) in gewenste neuronenCaenorhabditis Genetics Center (CGC) of overeenkomstige auteurs van gepubliceerd werkNZ1091, bijvoorbeeld
Chemicaliën, behandelingen en wormvoorbereidingsbenodigdheden
2,3-ButanedionSigma-AldrichCat# B85307diacetyl, voorbeeld van chemisch stimulus
Calciumchloride, CaCl2Sigma-AldrichCat# C3881
Fluoresceïne, natriumzoutSigma-AldrichCat# F6377
Glaswaterafstotend middelRain-XCat #800002250glas waterafstotende behandeling (voor eenmalig gebruik)
Magnesiumchloride, MgCl2Sigma-AldrichCat# M2393
Nematoden groeimedium (NGM) agarGeneseeCat #: 20-273NGM
Petrischalen (60 mm)TritechCat #T3305
Poly(dimethyl siloxaan) (PDMS): Sylgard 184Dow ChemicalCat# 1673921
Kaliumfosfaat monobasischSigma-AldrichCat# P5655
Kaliumfosfaat dibasischSigma-AldrichCat# P8281
Natriumchloride, NaClSigma-AldrichCat# S7653
(tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorosilaan (TFOCS)GelestCAS# 78560-45-9glas waterafstotende behandeling (duurzaam)
Software en algoritmen
Arduino IDEArduinohttps://www.arduino.cc/en/software
ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-managerMicro-managerhttps://micro-manager.org/
MicroscoopbesturingssoftwareAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker gegevensanalysesoftwareAlbrecht Labhttps://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Geautomatiseerd microscoop en stimulatiesysteem
Axio Observer.A1 omgekeerd microscoop ingesteld voor epifluorescentie (GFP filter kubussen, 5× objectief of soortgelijk)ZeissCat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED verlichterExcelitasCat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digital sCMOS cameraHamamatsuCat #C11440-22CU
Arduino nanoArduinoCat #A000005
3-weg Miniatuur Diafragma Isolatieklep (LQX12)ParkerCat #LQX12-3W24FF48-000Klep 1: Controle
2-weg normaal gesloten (NC) Pinch klepBio-Chem Valve IncCat #075P2-S432Klep 2: Uitstroom
3-weg Pinch klepNResearchCat #161P091Klep 3: Stimulus selectie
Optogenetische stimulatie LED en controller (615 nm)MightexCat #PLS-0625-030-S en #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digitale/manuele klepcontrollerAutoMate ScientificCat #01-18
Draden en connectorendiverseZie Fig. 2 van Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Voorbereiding van microfluïdisch apparaat
Dremel variabele snelheidsroterende snijder 4000 DremelCat #F0134000ABStel snelheid in op 5k RPM voor het snijden van glas
Dremel boorpers roterend gereedschapswerkstationDremelCat #220-01
DiamantboortjeDremelCat #7134
Glaze slide, 1 mm dikVWRCat #75799-268
Glas scribe (diamant scriber)Ted PellaCat #54468
Luer 3-weg stopcockCole-ParmerCat #EW-30600-07
Luer 23 G stompe naaldVWRCat #89134-100
Microfluïdisch apparaatOvereenkomstige auteur of fabriceren vanuit CAD-bestanden geassocieerd met dit artikelN/A
Microfluïdisch apparaatklemWarner Instruments (of machinewerkplaats)P-2
Microfluïdische buis, 0,02″ IDCole-ParmerCat #EW-06419-01
Buis 19 G, 0,5″New England Small TubeCat #NE-1027-12

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akerboom, J., et al. Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics. Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 2(2013).
  2. Badura, A., Sun, X. R., Giovannucci, A., Lynch, L. A., Wang, S. S. -H.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Geautomatiseerde neuronale registratiemicroflu dische apparatenwide field microscopieCaenorhabditis eleganscalcium imagingvariabiliteit in neuronale populatiesgenetisch gecodeerde indicatorenNeuroTracker analysestimuluspatroonprogrammering

Gerelateerde artikelen