Methodenartikel

Kwantificering en karakterisering van het hele genoom van SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters

DOI:

10.3791/65053

⸱

30 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol heeft tot doel SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters te kwantificeren voor gebruik voor epidemiologische studies op basis van afvalwater en om het blootstellingsrisico aan SARS-CoV-2 in aerosolen binnen en buiten te beoordelen. Dit protocol beschrijft ook een betegelde amplicon long-template sequencing-benadering voor de karakterisering van het hele genoom van SARS-CoV-2.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Op afvalwater gebaseerde epidemiologie is in veel landen naar voren gekomen als een veelbelovend en effectief bewakingssysteem voor SARS-CoV-2 en andere infectieziekten. Het proces omvat doorgaans afvalwaterconcentratie, nucleïnezuurextractie, amplificatie van geselecteerde genomische segmenten en detectie en kwantificering van het geamplificeerde genomische segment. Deze methodologie kan op dezelfde manier worden gebruikt om infectieuze agentia, zoals SARS-CoV-2, in luchtmonsters te detecteren en te kwantificeren. Aanvankelijk werd aangenomen dat SARS-CoV-2 zich voornamelijk verspreidde door nauw persoonlijk contact met druppeltjes die door een besmet persoon werden gegenereerd tijdens het spreken, niezen, hoesten, zingen of ademen. Een groeiend aantal onderzoeken heeft echter melding gemaakt van de aanwezigheid van SARS-CoV-2-RNA in de lucht van zorginstellingen, waardoor overdracht via de lucht een levensvatbare route voor het virus is. Deze studie presenteert een samenstelling van gevestigde protocollen om de detectie, kwantificering en sequentiebepaling van virussen uit zowel afvalwater- als luchtmonsters in het milieu te vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In december 2019 dook een nieuwe ziekte op, COVID-19 genaamd, veroorzaakt door een voorheen onbekend coronavirus, SARS-CoV-21. De resulterende wereldwijde pandemie vormt een grote uitdaging voor klinische en volksgezondheidslaboratoria over de hele wereld, aangezien een groot aantal personen moet worden getest om de overdracht en prevalentie van virussen in de gemeenschap nauwkeurig te beoordelen. In veel regio's is het echter economisch onhaalbaar om tijdig en ruimtelijk alomvattend het noodzakelijke testniveau te bereiken 2,3. De huidige surveillancesystemen op basis van individuele klinische diagnostiek zijn sterk afhankelijk van de ernst van de symptomen en individuele rapportage, evenals de mate waarin deze symptomen overlappen met bestaande ziekten die in de populatie circuleren 4,5,6,7,8,9,10. Bijgevolg draagt een groot aantal asymptomatische gevallen bij tot een aanzienlijke onderschatting van de ziektelast 7,11.

Vanwege deze uitdagingen werd op afvalwater gebaseerde epidemiologie (WBE) voor COVID-19-surveillance voorgesteld als aanvullende surveillancestrategie. WBE werd voor het eerst beschreven in 200112 en werd aanvankelijk gebruikt om cocaïne en andere illegale drugs op te sporen13. Deze benadering is gebaseerd op de veronderstelling dat het mogelijk is om de beginconcentratie te berekenen van elke stof die stabiel is in afvalwater en door de mens wordt uitgescheiden 8,12. WBE is in veel landen met succes geïmplementeerd als een aanvullend en efficiënt surveillancesysteem voor SARS-CoV-2 3,8,14,15,16. De meeste methoden om menselijke virussen in aquatische omgevingen te detecteren, volgen deze stappen: concentratie, nucleïnezuurextractie, amplificatie van het gekozen genomische segment (of segmenten) en detectie/kwantificering van het geamplificeerde genomische segment3.

Een andere belangrijke omgeving voor de detectie en kwantificering van SARS-CoV-2 is in luchtmonsters. Aanvankelijk werd gedacht dat SARS-CoV-2 voornamelijk werd overgedragen door nauw persoonlijk contact met ademhalingsdruppeltjes van aerosolen die door een geïnfecteerde persoon werden gegenereerd tijdens het spreken, niezen, hoesten, zingen of ademen17. Verschillende onderzoeken begonnen echter de aanwezigheid van SARS-CoV-2-RNA in de lucht te melden, vooral in zorginstellingen en andere gesloten ruimtes 18,19,20,21. Bewijs van de levensvatbaarheid van SARS-CoV-2 in luchtmonsters die binnenshuis in ziekenhuizen en andere gesloten ruimten zijn genomen, is gevonden wanneer de virusconcentratie voldoende hoog was22,23,2 4. Buitenstudies hebben over het algemeen geen bewijs van SARS-CoV-2 gevonden, behalve in drukke buitenruimtes 21,25,26,27,28,29. Vanaf nu is overdracht van SARS-CoV-2 via de lucht erkend als een wijze van overdracht30,31. Een recente overzichtsstudie toont de verschillen tussen buiten, waar de risico's van overdracht via de lucht minimaal zijn buiten drukke gebieden, en binnenshuis, waar grotere risico's aanwezig kunnen zijn in slecht geventileerde omgevingen waarin sterke bronnen (d.w.z. het aantal geïnfecteerde mensen) aanwezig kunnen zijn. Een recente uitgebreide overzichtsstudie heeft de substantiële verschillen aangetoond tussen de risico's van overdracht via de lucht in buiten- en binnenomgevingen, met name in drukke gebieden met slechte ventilatie. De studie geeft aan dat het risico op overdracht via de lucht minimaal is in buitenomgevingen, waar een grotere hoeveelheid lucht beschikbaar is voor de verdunning en verspreiding van virusdeeltjes32. Deze bevindingen hebben belangrijke implicaties voor het volksgezondheidsbeleid en de richtlijnen met betrekking tot COVID-19. Door de aanzienlijke verschillen in transmissierisico's tussen binnen- en buitenomgevingen te erkennen, kunnen beleidsmakers effectievere strategieën ontwikkelen om de verspreiding van het virus te beperken en de volksgezondheid te beschermen.

Er zijn verschillende methoden en protocollen voor de detectie, kwantificering en sequentiebepaling van SARS-CoV-2 uit verschillende omgevingsmonsters. Dit methodeartikel is bedoeld om een combinatie van gevestigde protocollen te presenteren waarmee laboratoria met verschillende capaciteitsniveaus omgevingsdetectie, kwantificering en sequencing van virussen uit afvalwater- en luchtmonsters kunnen uitvoeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle hier beschreven methoden zijn elders gepubliceerd en bevatten kleine wijzigingen ten opzichte van de oorspronkelijke methoden.

1. Inzameling van afvalwater en voorbehandeling van monsters

OPMERKING: Vanwege de lage concentraties SARS-CoV-2-RNA in omgevingsmonsters is de implementatie van een concentratiestap cruciaal voor een succesvolle detectie33,34,35. Hier wordt de eerste gerapporteerde methode beschreven voor de detectie van SARS-CoV-2 in afvalwater36.

  1. Verzameling en concentratie van afvalwatermonster(s)
    1. Verzamel 1 L van 24 uur samengesteld afvalwatermonster. Bewaar het monster bij 4 °C en ga binnen 24 uur verder met het protocol.
    2. Homogeniseer het monster door de fles voorzichtig te schudden. Verzamel 70 ml in een centrifugaalbuis van 100 ml of verdeel het monster in twee centrifugaalbuisjes van 50 ml.
    3. Piek 20 μL mengovirus (3,2 x 103 kopieën/μL) tot 70 ml van elk monster als interne controle van het concentratieproces. U kunt ook 10 μL mengovirus (3,2 x 103 kopieën/μL) in elke centrifugebuis van 50 ml prikken.
    4. Homogeniseer het monster en centrifugeer gedurende 10 minuten op 700 x g om grote deeltjes en organismen (pellet) te verwijderen.
    5. Gebruik het resulterende supernatans voor concentratie met centrifugale ultrafiltratie-apparaten met een grenswaarde van 10 KDa door te centrifugeren bij 4.000 x g gedurende 40 minuten bij 4 °C. Eliseer het concentraat door gedurende 40 minuten te centrifugeren bij 700 x g en de positie van het ultrafiltratie-apparaat om te keren.
    6. Meet het volume van het resulterende concentraat. Het volume zal veranderen afhankelijk van de hoeveelheid vaste stoffen in het monster die de centrifugaalfilters verstoppen. In deze studie lagen de verkregen concentraatvolumes tussen 200-1.200 μL.
    7. Gebruik het resulterende concentraat voor RNA-extractie met behulp van een commerciële kit of een interne methode. Voor de monsters die in deze studie zijn gebruikt, wordt een specifieke commerciële kit voor virale RNA-extractie met een elutievolume van 50 μL gebruikt.
    8. Meet de concentratie van het geëxtraheerde RNA met een fluorometrische RNA-kwantificeringskit. Verdeel het geëxtraheerde RNA in aliquots en vries in bij -80 °C tot verdere analyse.
      OPMERKING: Voor elke RNA-isolatieprocedureset moet een negatieve isolatiecontrole (NCI) worden opgenomen, die alleen buffers bevat om mogelijke besmetting tijdens de extractie te detecteren.
  2. Afname van luchtmonsters met behulp van een Coriolis-compact-luchtmonsternemer
    1. Kies een bemonsteringsstrategie op basis van het onderzoeksdoel door de bemonsteringsfrequentie en bemonsteringslocaties te definiëren.
    2. Stel het debiet in op de luchtmonsternemer (hier 50 l/min gedurende 30 min). Houd er rekening mee dat een debiet van meer dan 200 l/min viraal RNA kan afbreken, dus het wordt aanbevolen om een debiet van minder dan 200 l/min te gebruiken.
    3. Plaats een steriele kegel in de luchtmonsternemer voordat u met de verzameling begint door de start te pulseren. Zodra de bemonstering is voltooid, voegt u 5-15 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe aan de kegel. Draai of schud het monster voorzichtig met de hand gedurende 15 s. Bewaar de monsters maximaal 24 uur bij 4 °C of bij -80 °C in cryobuizen.
    4. Optioneel kan een concentratiestap worden uitgevoerd. Reinig en ontsmet de kegels na elk experiment met bleekmiddel.
    5. Extraheer RNA met behulp van een commerciële kit of een interne methode. Voor de monsters in deze studie wordt een specifieke commerciële kit voor virale RNA-extractie met een elutievolume van 50 μL gebruikt.
    6. Meet de concentratie van het geëxtraheerde RNA met een fluorometrische RNA-kwantificeringskit. Verdeel het geëxtraheerde RNA in aliquots en vries in bij -80 °C tot verdere analyse.
      OPMERKING: Voor elke RNA-isolatieprocedureset moet een negatieve isolatiecontrole (NCI) worden opgenomen, die alleen buffers bevat om mogelijke besmetting tijdens de extractie te detecteren.

2. Kwantificering van SARS-CoV-2 RNA door real-time-kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)

OPMERKING: Het onderstaande protocol is in overeenstemming met het CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) RT-PCR-diagnostisch panel37. Verdeel het primer/sondemengsel in verschillende aliquots om bevriezings- en dooicycli te voorkomen.

  1. Bereid de reactiemastermix voor elk doelwit (mengovirus; SARS-CoV-2 [N1- en N2-genen]) zoals in tabel 1, in een schone kap in de ruimte voor het instellen van reagens. Meng de primers/sondemix en het enzym vijf keer door inversie. Als alternatief kunt u de primers/sondemix en het enzym vijf keer licht maken.
    NOTITIE: Houd alle reagentia koud tijdens bereiding en gebruik. Om vries-dooicycli tot een minimum te beperken, wordt het ten zeerste aanbevolen om in aliquots in te vriezen.
  2. Draai de buisjes naar beneden (1.000 x g gedurende 15-30 s) om de inhoud op de bodem op te vangen en plaats de buisjes in een koud rek of op ijs.
  3. Label 1,5 ml microcentrifugebuisjes voor elk doelwit. Voeg aan elke microcentrifugebuis de benodigde hoeveelheid van elk reagens toe (volume per reactie, maal het aantal reacties, inclusief de benodigde controles). Meng door op en neer te pipetteren en centrifugeer gedurende 5 s om de inhoud op de bodem op te vangen.
  4. Bewaar de microcentrifugebuisjes in een koud rek en doseer 15 μl in PCR-stripbuisjes of een plaat met 96 putjes in een koelrek. Bedek de plaat en verplaats deze naar de nucleïnezuurverwerkingsruimte (bewaar deze in een koelrek).
  5. Ontdooi een aliquot van geëxtraheerd RNA en draai zachtjes gedurende 5 s. Pipetteer 5 μl RNA (naast 5 μl niet-sjablooncontrole [NTC], negatieve isolatiecontrole [NCI] en positieve controle [PC]) op elke reactieput of buis die de eerder bereide mastermix bevat. Vervang handschoenen vaak als dat nodig is om kruisbesmetting te voorkomen.
  6. Bedek de hele reactieplaat of -buizen en draai zachtjes mee. Centrifugeer (1.000 x g gedurende 15-30 s) de plaat of PCR-buisjes.
  7. Start de 25 μL RT-qPCR met de volgende cyclusomstandigheden: reverse transcriptase bij 45 °C gedurende 10 min; polymerase-activering bij 95 °C gedurende 10 minuten; 45 cycli denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s; en gloeien/verlengen bij 60 °C gedurende 45 seconden.
  8. Bereken de herstelefficiëntie van mengoviruscontroles zoals gerapporteerd door Conte et al.38:
    figure-protocol-1 × 100

3. Sequentiebepaling van varianten in afvalwater en data-analyse

OPMERKING: Het beschreven protocol is een aangepast protocol gemaakt door Quick et al.39,40. Het maakt gebruik van twee sets primers voor SARS-CoV-2-genoomamplificatie door PCR-tegelmethodologie - ARTIC-primers en VarSkip-primers. Een combinatie van primers wordt gebruikt om de beste genoomdekking te garanderen en om de kans te minimaliseren dat nieuwe mutaties ervoor zorgen dat primers van één type falen. Over het algemeen is het protocol verdeeld in drie delen: reverse transcriptie (RT) en amplicongeneratie, voorbereiding van de sequencingbibliotheek en sequencing en data-analyse.

  1. Reverse transcriptie en amplicon generatie
    1. Zorg ervoor dat de invoermonsters een bekende qPCR-cyclusdrempelwaarde (Ct) hebben om ze correct te verdunnen in water van PCR-kwaliteit. De Ct-waarde wordt verkregen tijdens de kwantificering met qPCR. De verdunningen zijn als volgt: als de Ct-waarde 12-15 is, verdun de monsters dan 1:100; als de Ct-waarde 15-18 is, verdun de monsters dan 1:10; als de Ct-waarde 18-35 is, verdun het monster dan niet. Monsters boven een Ct-waarde van 35 hebben een grote kans om niet te werken.
    2. In een PCR-plaat pipet u 16 μL van elk monster naar zijn positie op de plaat. Voeg 4 μL reverse transcriptie (RT) mastermix toe (5x). Dek de plaat af en start de PCR-reactie onder de volgende voorwaarden: 25 °C gedurende 2 min, 55 °C gedurende 20 min en 95 °C gedurende 1 min.
    3. Bereid verdunningen van 10 μM voor van elke primerset (ARTIC pool A en pool B, en VarSkip pool A en pool B). Bereid de mastermix voor elke set primers (ARTIC set A en B, en VarSkip set A en B) zoals in tabel 2. Hieruit zullen vier mastermixen voortkomen.
    4. Pipetteer op een nieuwe PCR-plaat 20 μl van de mastermix in elk corresponderend putje. Voeg 5 μL van het RT-monster toe aan elke mix.
      OPMERKING: Elk monster heeft vier reactiemengsels: ARTIC-pool A en B en VarSkip-pool A en B.
    5. Dek de plaat af en start de PCR-reactie als volgt: polymerase-activering bij 98 °C gedurende 30 s; 35 cycli denaturatie bij 98 °C gedurende 15 s; en gloeien/verlengen bij 65 °C gedurende 4 min. Draai de plaat naar beneden (1.000 x g gedurende 15-30 s). Combineer de ARTIC-reactiepools en combineer de VarSkip-reactiepools afzonderlijk. Elk monster heeft twee ampliconreacties van 50 μL.
    6. Voeg 50 μL reagens op basis van kralen voor PCR-zuivering toe aan elk putje en meng goed door te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
      NOTITIE: Meng voor elk gebruik het PCR-zuiveringsreagens krachtig om de korrels opnieuw te suspenderen.
    7. Plaats de plaat op een magnetische scheidingsstandaard en wacht tot de kralen een pellet vormen en de vloeistof helder is (~5 min). Pipetteer en gooi de supernatant weg. Bewaar de PCR-plaat op de magnetische standaard.
    8. Houd de PCR-plaat op de magnetische standaard en voeg 200 μL 80% ethanol toe aan elk monster zonder de parelkorrel aan te raken. Verwijder de ethanol.
    9. Herhaal de vorige stap. Laat de plaat op de magnetische standaard 30 seconden onbedekt om de ethanol te laten verdampen.
    10. Verwijder de plaat van de magnetische standaard en voeg 15 μL water van PCR-kwaliteit toe aan elk monster. Resuspendeer de pellet door te pipetteren. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 min.
    11. Plaats de plaat terug op de magnetische standaard en laat de kralen pelleteren (2 min). Pipetteer voorzichtig 15 μl van het supernatans van elk monster op een nieuwe PCR-plaat.
    12. Meet de concentratie van elk monster met een fluorometrische RNA-kwantificeringskit. Neem ongeveer 50 ng van elk monster in 12,5 μl naar de volgende stap. Verdun het monster indien nodig in water van PCR-kwaliteit.
  2. Voorbereiding van de bibliotheek
    1. Voeg 1,75 μL reactiebuffer uit de Illumina DNA-bibliotheekvoorbereidingskit en 0,75 μL enzymmix toe aan elk monster. Bedek de plaat, draai kort en draai naar beneden (1.000 x g gedurende 15-30 s). Incubeer bij 21°C gedurende 5 min en bij 65°C gedurende 5 min.
    2. In een nieuwe plaat pipetteer je 3 μL water van PCR-kwaliteit voor elk monster op een nieuwe PCR-plaat. Voeg 0,75 μl van de voorbereide monsters, 1,25 μl barcodes voor de voorbereiding van de sequencingbibliotheek en 5 μl T4-DNA-ligasemastermix toe. Goed mengen door te pipetteren, kort centrifugeren (1.000 x g gedurende 15-30 s) in een centrifuge en incuberen bij 21 °C gedurende 20 min en bij 65 °C gedurende 10 min.
      OPMERKING: Als u minder dan 25 monsters gebruikt, verdubbel dan alle volumes in deze stap.
    3. Voeg alle monsters samen door 10 μL van elk monster toe te voegen aan dezelfde buis met lage binding. Neem 480 μL mee naar de volgende stap.
    4. Voeg 192 μL reagens op basis van kralen voor PCR-zuivering toe aan het zwembad en meng goed door te pipetteren. Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Plaats de buis op een magnetische standaard en wacht tot het supernatans helder is en er een parelpellet ontstaat. Verwijder het supernatant. Verwijder de buis van de magnetische standaard.
    6. Voeg 700 μL van de korte fragmentbuffer (SFB) toe en meng door te pipetteren. Plaats terug op de magnetische standaard en wacht tot de pellet zich heeft gevormd en de vloeistof is verdwenen (~5 min). Pipetteer het supernatans eruit en gooi het weg.
    7. Herhaal de vorige stap. Laat de buis op de magnetische standaard staan. Voeg 100 μL 80% ethanol toe zonder de kraal aan te raken. Pipetteer de ethanol eruit en laat de kraal 30 s drogen.
      NOTITIE: Laat de kraal niet te droog worden.
    8. Verwijder de buis van de magnetische standaard en voeg 35 μL water van PCR-kwaliteit toe. Meng door te pipetteren en incubeer gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buis op de magnetische standaard en laat de kraal pelleteren en de vloeistof helder worden. Pipetteer 35 μL van het supernatans op een nieuw buisje.
    9. Meet de RNA-concentratie van de gepoolde bibliotheek. Pipeteer het volume dat nodig is om een hoeveelheid van 30-50 ng RNA te bereiken en vul het met water van PCR-kwaliteit om een uiteindelijk volume van 30 μL te bereiken.
    10. Bereid de adapterligatiereactiemix voor: 30 μL van de gepoolde bibliotheek, 5 μL Adapter Mix II, 10 μL van de ligatiereactiebuffer (5x) en 5 μL T4 DNA-ligase. Pipetteren en centrifugeren (1.000 x g gedurende 15-30 s). Incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur.
    11. Voeg 20 μL van het reagens op basis van kralen toe voor PCR-zuivering en meng door middel van pipetteren. Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    12. Plaats de buis op de magnetische standaard en wacht tot de kralenkorrel zich vormt en het supernatans kleurloos wordt. Pipetteer voorzichtig de supernatant en gooi deze weg.
    13. Haal uit de magnetische standaard en voeg 125 μL SFB toe. Meng door te pipetteren en plaats terug op de magnetische standaard om de kralen te scheiden. Als de vloeistof helder is, pipetteert u de supernatant en gooit u deze weg.
    14. Herhaal de vorige stap. Laat de buis 30 seconden open op de magnetische standaard staan om een deel van de overgebleven vloeistof te laten verdampen.
    15. Verwijder de buis van de magnetische standaard en voeg 15 μL van de elutiebuffer toe. Goed mengen door te pipetteren en kort centrifugeren (1.000 x g gedurende 15-30 s). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 min. Plaats gedurende 2 minuten op de magnetische standaard.
    16. Pipetteer 15 μL van het supernatans in een nieuwe buis met lage binding. Dit is de laatste bibliotheek. Meet de concentratie met een fluorometrische DNA-kwantificeringskit.
      OPMERKING: In de volgende stap is 12 μL nodig. Als de concentratie erg hoog is en er minder dan 12 μL van de bibliotheek nodig is, vul dan tot 12 μL met het elutiebufferreagens.
  3. Laden en sequencing van flowcellen
    1. Plaats de flowcel (R9.4.1) in het real-time DNA- en RNA-sequencingapparaat.
    2. Bereid het primingmengsel voor door 30 μL flush tether (FLT)-reagens toe te voegen aan een buis met flush buffer (FB)-reagens. Vortex om te mengen en af te spinnen (1.000 x g gedurende 15-30 s).
    3. Open het deksel van de aanzuigpoort. Stel met een pipet van 1.000 μl in op 200 μl en steek de punt in de aanzuigpoort. Draai aan het volumeinstelwiel en verhoog het volume totdat de vloeistof in de punt te zien is. Gooi de tip weg.
      NOTITIE: Draai alleen aan het wiel totdat er een paar μL vloeistof in de punt te zien is. Het trekken van grotere hoeveelheden kan de stroomcel beschadigen.
    4. Voeg langzaam 800 μL van het primingmengsel toe aan de primingpoort en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Wacht 5 minuten.
    5. Bereid in de tussentijd de bibliotheken voor op het laden. Meng 37,5 μl van de sequentiebuffer, 25,5 μl van de laadbuffer en 12 μl van de bibliotheek.
      OPMERKING: Meng de laadbuffer voor het pipetteren. De parels in dit reagens bezinken zeer snel.
    6. Open het poortdeksel. Pipetteer 200 μl van het aanzuigmengsel in de aanzuigpoort.
      OPMERKING: Tijdens het pipetteren in de priming-poort met de dekselpoort open, zal men kleine druppels uit de monsterpoort zien komen. Pipeteer langzaam genoeg zodat de monsterpoort de druppels naar binnen kan trekken zonder over te lopen.
    7. Voordat u de voorbereide bibliotheek laadt, moet u goed mengen door te pipetteren. Gebruik een pipet van 100 μl die is ingesteld op 75 μl en neem de bibliotheek en pipette druppel voor druppel in de monsterpoort. Raak de poort niet aan en wacht tot elke druppel in de poort is opgenomen voordat u de volgende druppel laadt om te voorkomen dat de vloeistof overloopt.
    8. Sluit de afdekpoort en de aanzuigpoort. Open de software en start het sequencing-experiment. Selecteer Basecalling Aan. Voor een bibliotheek met 96 gemultiplexte samples is 10-12 uur sequencing meestal voldoende om voldoende gegevens te genereren.
      OPMERKING: Met behulp van de software kan men het voorbeeldblad in .csv formaat invoegen. Het voorbeeldblad vereist de volgende gegevens: flow_cell_id, position_id, sample_id, experiment_id, flow_cell_product_code en kit. De flowcel-ID is nodig (vermeld op de zijkant van de flowcel) samen met de gebruikte kit. Voor het voorgestelde protocol moet de LSK109-kit worden geselecteerd.
  4. Sequentiebepaling van gegevensanalyse
    1. Voeg de gecomprimeerde fastq-lezingen in de wf-arctische workflow41 in. Voer de werkstroom afzonderlijk uit met twee verschillende primerschema's (ARTIC/V4.1 en NEB-VarSkip/v1a). Twee ". Primertrimmed.rg.sorted.bam" bestanden worden gemaakt voor elk monster.
    2. Voeg de BAM-bestanden samen tot één bestand met het commando "samtools merge"42. Voeg het samengevoegde BAM-bestand in de Freyja-tool in, laat de standaardinstellingen achter om relatieve afstammingshoeveelhedente herstellen 43.
    3. Om een FASTA-bestand te maken, voegt u het samengevoegde BAM-bestand in de tools "samtools mpileup" en "ivar" in met de standaardinstellingen44,45. Voor het aanroepen van mutaties laadt u het FASTA-bestand in de Nextclade-tool46,47.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De resultaten samengevat in tabel 3 tonen voorbeelden van de detectie en kwantificering van SARS-CoV-2-RNA in afvalwater- en luchtmonsters met behulp van de methode die in dit artikel wordt beschreven. Afvalwatermonsters werden verzameld bij afvalwaterzuiveringsinstallaties in Spanje en Slovenië en werden als positief beschouwd als de Ct minder dan 40 was in ten minste twee van de drie replicaten, waarbij kwantificering als geldig werd beschouwd als de Ct een variatie van minder dan 5% had. In Spanje en ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microbiële en virale detectie en kwantificering met behulp van (RT-)qPCR-methoden zijn wijdverbreid geaccepteerd vanwege hun opmerkelijke gevoeligheid. Deze technieken staan echter voor tal van uitdagingen bij het analyseren van omgevingsmonsters. Afvalwatermonsters bevatten een overvloed aan remmende stoffen die metingen kunnen vertekenen en misleidende resultaten kunnen opleveren. Om deze beperkingen aan te pakken en de precisie te verbeteren, werd een complex protocol bedacht, ontworpen en geïmplementeerd. Dit protoco...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen concurrerende economische belangen of andere belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd uitgevoerd met financiële steun van de regionale regering van Castilla y León en het FEDER-programma (projecten CLU 2017-09, UIC315 en VA266P20).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+A2:D19Oxford NanoporeEXP-AMII001Sequencing
AllPrep PowerViral DNA/RNA KitQiagen28000-50RNA-extractiekit
AMPure XPBeckman CoulterA63880PCR-zuivering, NGS-opruiming, PCR-opruiming
ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon PanelIDT10011442SARS-CoV-2-genoomversterking
Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367SBibliotheekvoorbereiding
CENTRICON PLUS­70 10KDA.Fisher Scientific10296062Concentratiefilters
CORIOLIS COMPACT AIR SAMPLERBertin Technologies083-DU001Luchtmonsternemer
Duran laboratoriumflessenMerckZ305200-10EABemonsteringsflessen
Flow Cell (R9.4.1)Oxford NanoporeFLO-MIN106DSequencing
Algemene laboratoriummaterialen (buizen, qPCR-platen, enz.)
Ligation Sequencing KitOxford NanoporeSQK-LSK109Sequencing
LunaScript RT SuperMix KitNEBE3010 cDNA-synthese
Mengovirus extractiecontrole KitBiomérieuxKMGConcentratiecontrole
Nalgene General Long-Term Storage Cryogenic TubesThermofisher5011-0012Staalopslag
Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-freeOxford NanoporeEXP-NBD104Barcoding
NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNEBE7595DNA-reparatie
NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer MixesNEBE7658SARS-CoV-2-genoomversterking
NEBNext Quick Ligation Reaction BufferNEBB6058SSequencing 
Fosfaat gebufferde zoutoplossingMerckP4474Collectiebuffer
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS, 1X), sterieel gefilterdThermofisherJ61196.APElutie van luchtmonsters
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNEBM0494Shot start DNA-polymerase
Qubit RNA HS Assay KitThermofisherQ32852RNA-kwantificering
SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & Probe KitIDT10006713Primer-probemix en qPCR-positieve controle
TaqPath 1-Step RT-qPCR Master MixThermofisherA15299RT-qPCR-kit

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
  2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/lab-safety-practices.html (2020).
  3. Gonçalves, J., et al. Centralized and decentralized wastewater-based epidemiology to infer COVID-19 transmission - A brief review. One Health. 15, 100405(2022).
  4. Dawood, F. S., et al. Estimated global mortality associated with the first 12 months of 2009 pandemic influenza A H1N1 virus circulation: a modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 12 (9), 687-695 (2012).
  5. Gonçalves, J., Koritnik, T., Paragi, M. Assessment of weather and atmospheric pollution as a co-factor in the spread of SARS-CoV-2. Acta Bio-Medica: Atenei Parmensis. 92 (3), e2021094(2021).
  6. Gonçalves, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA in hospital wastewater from a low COVID-19 disease prevalence area. The Science of The Total Environment. 755, 143226(2021).
  7. Mizumoto, K., Kagaya, K., Zarebski, A., Chowell, G. Estimating the asymptomatic proportion of coronavirus disease 2019 (COVID-19) cases on board the Diamond Princess cruise ship, Yokohama, Japan, 2020. Eurosurveillance. 25 (10), 2000180(2020).
  8. Polo, D., et al. Making waves: Wastewater-based epidemiology for COVID-19 - approaches and challenges for surveillance and prediction. Water Research. 186, 116404(2020).
  9. Shmueli, G., Burkom, H. Statistical challenges facing early outbreak detection in biosurveillance. Technometrics. 52 (1), 39-51 (2010).
  10. Simonsen, L., et al. Global mortality estimates for the 2009 influenza pandemic from the GLaMOR project: A modeling study. PLoS Medicine. 10 (11), e1001558(2013).
  11. Oran, D. P., Topol, E. J. Prevalence of asymptomatic SARS-CoV-2 infection: a narrative reivew. Annals of Internal Medicine. 173, 362-367 (2020).
  12. Daughton, C., Jones-Lepp, T. Pharmaceuticals and Personal Care Products in the Environment: Scientific and Regulatory Issues. ACS Symposium Series. , American Chemical Society. Washington, DC. (2001).
  13. Zuccato, E., et al. Cocaine in surface waters: a new evidence-based tool to monitor community drug abuse. Environmental Health. 4, 14(2005).
  14. Aguiar-Oliveira, M. deL., et al. Wastewater-based epidemiology (WBE) and viral detection in polluted surface water: A valuable tool for COVID-19 surveillance-a brief review. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 9251(2020).
  15. García-Encina, P. A. Wastewater-based epidemiology (WBE). Water and Environment Journal. 35 (4), 1162-1163 (2021).
  16. Mao, K., Zhang, H., Pan, Y., Yang, Z. Biosensors for wastewater-based epidemiology for monitoring public health. Water Research. 191, 116787(2021).
  17. Shereen, M. A., Khan, S., Kazmi, A., Bashir, N., Siddique, R. COVID-19 infection: Origin, transmission, and characteristics of human coronaviruses. Journal of Advanced Research. 24, 91-98 (2020).
  18. Chia, P. Y., et al. Detection of air and surface contamination by SARS-CoV-2 in hospital rooms of infected patients. Nature Communications. 11 (1), 2800(2020).
  19. Lei, H., et al. SARS-CoV-2 environmental contamination associated with persistently infected COVID-19 patients. Influenza and Other Respiratory Viruses. 14 (6), 688-699 (2020).
  20. Razzini, K., et al. SARS-CoV-2 RNA detection in the air and on surfaces in the COVID-19 ward of a hospital in Milan, Italy. The Science of The Total Environment. 742, 140540(2020).
  21. da Silva, P. G., Gonçalves, J., Nascimento, M. S. J., Sousa, S. I. V., Mesquita, J. R. Detection of SARS-CoV-2 in the indoor and outdoor areas of urban public transport systems of three major cities of Portugal in 2021. International Journal of Environmental Research and Public Health. 19 (10), 5955(2022).
  22. Barbieri, P., et al. Molecular detection of SARS-CoV-2 from indoor air samples in environmental monitoring needs adequate temporal coverage and infectivity assessment. Environmental Research. 198, 111200(2021).
  23. Lednicky, J., et al. Earliest detection to date of SARS-CoV-2 in Florida: Identification together with influenza virus on the main entry door of a university building, February 2020. PLoS One. 16 (1), 0245352(2021).
  24. Santarpia, J. L., et al. Aerosol and surface contamination of SARS-CoV-2 observed in quarantine and isolation care. Scientific Reports. 10 (1), 12732(2020).
  25. Chirizzi, D., et al. SARS-CoV-2 concentrations and virus-laden aerosol size distributions in outdoor air in north and south of Italy. Environment International. 146, 106255(2021).
  26. Hadei, M., et al. Presence of SARS-CoV-2 in the air of public places and transportation. Atmospheric Pollution Research. 12 (3), 302-306 (2021).
  27. Moreno, T., et al. Tracing surface and airborne SARS-CoV-2 RNA inside public buses and subway trains. Environment International. 147, 106326(2021).
  28. Mouchtouri, V. A., et al. Environmental contamination of SARS-CoV-2 on surfaces, air-conditioner and ventilation systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 230, 113599(2020).
  29. Setti, L., et al. Airborne transmission route of COVID-19: why 2 meters/6 feet of inter-personal distance could not be enough. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17, 2932(2020).
  30. SARS-CoV-2 Transmission. Centers for Disease Control and Prevention (CDC). , Available from: https://www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/science/science-briefs/sars-cov-2-transmission.html (2021).
  31. Coronavirus Disease (COVID-19): How is it Transmitted. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/q-a-detail/coronavirus-disease-covid-19-how-is-it-transmitted (2021).
  32. Dinoi, A., et al. A review on measurements of SARS-CoV-2 genetic material in air in outdoor and indoor environments: Implication for airborne transmission. The Science of the Total Environment. 809, 151137(2022).
  33. Bosch, A., et al. Analytical methods for virus detection in water and food. Food Analytical Methods. 4, 4-12 (2011).
  34. Gonçalves, J., et al. Surveillance of human enteric viruses in coastal waters using concentration with methacrylate monolithic supports prior to detection by RT-qPCR. Marine Pollution Bulletin. 128, 307-317 (2018).
  35. La Rosa, G., Muscillo, M. Molecular detection of viruses in water and sewage. Viruses in Food and Water. , Woodhead Publishing. 97-125 (2013).
  36. Medema, G., Heijnen, L., Elsinga, G., Italiaander, R., Brouwer, A. Presence of SARS-Coronavirus-2 RNA in sewage and correlation with reported COVID-19 prevalence in the early stage of the epidemic in the Netherlands. Environmental Science & Technology Letters. 7 (7), 511-516 (2020).
  37. CDC - 2019-nCoV Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Fact Sheet for Healthcare Providers. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: https://stacks.cdc.gov/view/cdc/85028 (2020).
  38. Conte, M. Airborne concentrations of SARS-CoV-2 in indoor community environments in Italy. Environmental Science and Pollution Research International. 29 (10), 13905-13916 (2022).
  39. Quick, J. nCoV-2019 sequencing protocol v3 (LoCost). protocols.io. , Available from: https://www.protocols.io/view/ncov-2019-sequencing-protocol-v3-locost-bh42j8ye (2020).
  40. Tyson, J. R. Improvements to the ARTIC multiplex PCR method for SARS-CoV-2 genome sequencing using nanopore. , (2020).
  41. ARTIC SARS-CoV-2 Workflow. , Available from: https://github.com/epi2me-labs/wf-artic (2022).
  42. Li, H., et al. The sequence alignment/map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  43. Freyja. , Available from: https://github.com/andersen-lab/Freyja (2022).
  44. Li, H. A statistical framework for SNP calling, mutation discovery, association mapping and population genetical parameter estimation from sequencing data. Bioinformatics. 27 (21), 2987-2993 (2011).
  45. Grubaugh, N. D., et al. An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar. Genome Biology. 20 (1), 8(2019).
  46. Hadfield, J., et al. Nextstrain: real-time tracking of pathogen evolution. Bioinformatics. 34 (23), 4121-4123 (2018).
  47. Aksamentov, I., Roemer, C., Hodcroft, E. B., Neher, R. A. Nextclade: clade assignment, mutation calling and quality control for viral genomes. Journal of Open Source Software. 6 (67), 3773(2021).
  48. Markt, R., et al. Detection and stability of SARS-CoV-2 fragments in wastewater: impact of storage temperature. Pathogens. 10 (9), 1215(2021).
  49. Kocamemi, B. A., et al. First Data-Set on SARS-CoV-2 Detection for Istanbul Wastewaters in Turkey. MedRxiv. , (2020).
  50. Randazzo, W., et al. SARS-CoV-2 RNA in wastewater anticipated COVID-19 occurrence in a low prevalence area. Water Research. 181, 115942(2020).
  51. Hoorfar, J., et al. Practical considerations in design of internal amplification controls for diagnostic PCR assays. Journal of Clinical Microbiology. 42 (5), 1863-1868 (2004).
  52. Parshionikar, S. U., Cashdollar, J., Shay Fout, G. Development of homologous viral internal controls for use in RT-PCR assays of waterborne enteric viruses. Journal of Virological Methods. 121, 39-48 (2004).
  53. Nalla, A. K. Comparative performance of SARS-CoV-2 detection assays using seven different primer-probe sets and one assay kit. Journal of Clinical Microbiology. 58 (6), 00557(2020).
  54. Hirotsu, Y., Mochizuki, H., Omata, M. Double-quencher probes improve detection sensitivity toward Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) in a reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. Journal of Virological Methods. 284, 113926(2020).
  55. Ahmed, W. First confirmed detection of SARS-CoV-2 in untreated wastewater in Australia: A proof of concept for the wastewater surveillance of COVID-19 in the community. The Science of The Total Environment. 728, 138764(2020).
  56. Bar-Or, I., et al. Detection of SARS-CoV-2 variants by genomic analysis of wastewater samples in Israel. The Science of the Total Environment. 789, 148002(2021).
  57. La Rosa, G., Bonadonna, L., Lucentini, L., Kenmoe, S., Suffredini, E. Coronavirus in water environments: Occurrence, persistence and concentration methods - A scoping review. Water Research. 179, 115899(2020).
  58. Wu, F., et al. SARS-CoV-2 titers in wastewater are higher than expected from clinically confirmed cases. mSystems. 5, 00614(2020).
  59. Wurtzer, S., et al. Evaluation of lockdown effect on SARS-CoV-2 dynamics through viral genome quantification in waste water, Greater Paris, France, 5 March to 23 April 2020. European Communicable Disease Bulletin. 25 (50), 2000776(2020).
  60. VATar COVID-19 | Caso de Exito - Ministerio para la Transición Ecologica y el Reto Demografico. , Available from: https://esri.es/es-es/descubre-los-gis/casos-de-exito/administracion-/vatar-covod19-miteco-cs (2022).
  61. Nemudryi, A., et al. Temporal detection and phylogenetic assessment of SARS-CoV-2 in municipal wastewater. Cell Reports. Medicine. 1 (6), 100098(2020).
  62. Rios, G., et al. Monitoring SARS-CoV-2 variants alterations in Nice neighborhoods by wastewater nanopore sequencing. The Lancet Regional Health. Europe. 10, 100202(2021).
  63. Gomes da Silva, P. Environmental dissemination of SARS-CoV-2 in a University Hospital during the COVID-19 5th wave Delta variant peak in Castile-León, Spain. International Journal of Environmental Research and Public Health. 20, 1574(2023).
  64. Gonçalves, J., et al. Exposure assessment of SARS-CoV-2 and Nov GII/GII in aerosols generated by a municipal wastewater treatment plant. , (2022).
  65. Lednicky, J. A., et al. Isolation of SARS-CoV-2 from the air in a car driven by a COVID patient with mild illness. International Journal of Infectious Diseases. 108, 212-216 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

AfvalwaterepidemiologieLuchtbemonsteringVirale RNA kwantificeringWhole Genome SequencingRT qPCRAfvalwaterconcentratieExtractie van nucle nezurenMagnetische scheidingMilieusurveillance

Gerelateerde artikelen