Methodenartikel

Isolatie van extracellulaire blaasjes met een laag endotoxinegehalte afgeleid van kankercellijnen

DOI:

10.3791/65062

⸱

17 februari 2023

 ,  , 
1Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, 2Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, 3Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het voorgestelde protocol bevat richtlijnen over hoe besmetting met endotoxine kan worden voorkomen tijdens de isolatie van extracellulaire blaasjes uit celkweeksupernatanten en hoe deze op de juiste manier kunnen worden geëvalueerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn een heterogene populatie van membraanblaasjes die door cellen in vitro en in vivo worden vrijgegeven. Hun alomtegenwoordigheid en belangrijke rol als dragers van biologische informatie maken hen tot intrigerende studieobjecten, die betrouwbare en repetitieve protocollen vereisen voor hun isolatie. Het realiseren van hun volledige potentieel is echter moeilijk omdat er nog steeds veel technische obstakels zijn die verband houden met hun onderzoek (zoals de juiste acquisitie). Deze studie presenteert een protocol voor de isolatie van kleine EV's (volgens de MISEV 2018-nomenclatuur) uit het kweeksupernatant van tumorcellijnen op basis van differentiële centrifugatie. Het protocol bevat richtlijnen over hoe besmetting met endotoxinen tijdens de isolatie van EV's kan worden voorkomen en hoe deze goed kunnen worden geëvalueerd. Endotoxinebesmetting van EV's kan latere experimenten aanzienlijk belemmeren of zelfs hun ware biologische effecten maskeren. Aan de andere kant kan de over het hoofd geziene aanwezigheid van endotoxinen leiden tot onjuiste conclusies. Dit is van bijzonder belang wanneer wordt verwezen naar cellen van het immuunsysteem, waaronder monocyten, omdat monocyten een populatie vormen die bijzonder gevoelig is voor endotoxineresiduen. Daarom wordt het ten zeerste aanbevolen om EV's te screenen op endotoxinebesmetting, vooral bij het werken met endotoxinegevoelige cellen zoals monocyten, macrofagen, van myeloïden afgeleide suppressorcellen of dendritische cellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's), volgens de MISEV 2018-nomenclatuur, zijn een verzamelnaam die verschillende subtypen van door cellen uitgescheiden vliezige blaasjes beschrijft die een cruciale rol spelen in tal van fysiologische en pathologische processen 1,2. Bovendien zijn EV's veelbelovend als nieuwe biomarkers voor verschillende ziekten, evenals therapeutische middelen en voertuigen voor medicijnafgifte. Het realiseren van hun volledige potentieel is echter moeilijk omdat er nog steeds veel technische obstakels zijn met betrekking tot hun overname3. Een van die uitdagingen is de isolatie van endotoxinevrije EV's, die in veel gevallen is verwaarloosd. Een van de meest voorkomende endotoxinen is lipopolysaccharide (LPS), dat een belangrijk onderdeel is van gramnegatieve bacteriële celwanden en een acute ontstekingsreactie kan veroorzaken, als gevolg van de afgifte van een groot aantal inflammatoire cytokines door verschillende cellen 4,5. LPS induceert een respons door binding aan LPS-bindend eiwit, gevolgd door interactie met het CD14/TLR4/MD2-complex op myeloïde cellen. Deze interactie leidt tot de activering van MyD88- en TRIF-afhankelijke signaalroutes, die op hun beurt de nucleaire factor kappa B (NFkB) activeren. Translocatie van NFkB naar de kern initieert de productie van cytokines6. Monocyten en macrofagen zijn zeer gevoelig voor LPS en hun blootstelling aan LPS resulteert in een afgifte van inflammatoire cytokines en chemokines (bijv. IL-6, IL-12, CXCL8 en TNF-α)7,8. De CD14-structuur maakt de binding van verschillende LPS-soorten met vergelijkbare affiniteit mogelijk en dient als co-receptor voor andere toll-like receptoren (TLRs) (TLR1, 2, 3, 4, 6, 7 en 9)6. Het aantal studies dat wordt uitgevoerd naar de effecten van EV's op monocyten/macrofagen neemt nog steeds toemet 9,10,11. Vooral vanuit het perspectief van het bestuderen van de functies van monocyten, hun subpopulaties en andere immuuncellen, is de aanwezigheid van endotoxine en zelfs hun gemaskeerde aanwezigheid in EV's van groot belang12. De over het hoofd geziene besmetting van EV's met endotoxinen kan leiden tot misleidende conclusies en hun ware biologische activiteit verbergen. Met andere woorden, het werken met monocytische cellen vereist vertrouwen in de afwezigheid van endotoxinebesmetting13. Potentiële bronnen van endotoxinen kunnen water, commercieel verkregen media en sera, mediacomponenten en additieven, laboratoriumglaswerk en plasticwarezijn 5,14,15.

Daarom was deze studie gericht op het ontwikkelen van een protocol voor de isolatie van laag-endotoxine-bevattende EV's. Het protocol geeft eenvoudige tips over hoe endotoxinebesmetting tijdens EV-isolatie kan worden voorkomen in plaats van endotoxinen uit EV's te verwijderen. Eerder zijn veel protocollen gepresenteerd over het verwijderen van endotoxinen uit bijvoorbeeld gemanipuleerde nanodeeltjes die worden gebruikt in de nanogeneeskunde; geen van hen is echter nuttig voor biologische structuren zoals EV's. De effectieve depyrogenering van nanodeeltjes kan worden uitgevoerd door ethanol- of azijnzuurspoeling, verwarming bij 175 °C gedurende 3 uur, γ bestraling of triton X-100-behandeling; deze procedures leiden echter tot de vernietiging van EV's16,17.

Het gepresenteerde protocol is een baanbrekend onderzoek gericht op het vermijden van endotoxine onzuiverheden in EV's, in tegenstelling tot eerdere studies over het effect van EV's op monocyten9. Het toepassen van voorgestelde principes op de laboratoriumpraktijk kan helpen om betrouwbare onderzoeksresultaten te verkrijgen, wat cruciaal kan zijn bij het overwegen van het potentiële gebruik van EV's als therapeutische middelen in de kliniek12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van ultracentrifugebuizen

  1. Gebruik steriele buizen voor eenmalig gebruik. Als dit niet mogelijk is, hergebruik de ultracentrifugebuizen dan nadat u ze met een reinigingsmiddel hebt gewassen met een steriele Pasteur-pipet of andere applicators voor eenmalig gebruik. Vergeet niet dat ultracentrifugebuizen moeten worden gewijd aan één type gecentrifugeerd materiaal (celkweeksupernatant / serum / plasma) en soorten (mens / muis / enz.).
  2. Spoel na een wasmiddelwasbeurt de ultracentrifugebuizen 3x af met gedeïoniseerd, LPS-vrij water.
    OPMERKING: Gebruik geen water van lage kwaliteit.
  3. Droog de ultracentrifugebuizen en vul ze vervolgens met 70% ethanol. Laat de buizen met 70% ethanol staan voor nachtelijke desinfectie. Verwijder de ethanol en droog de buisjes opnieuw.
  4. Plaats de tubes en doppen in een sterilisatieverpakking en sluit ze goed af. Gebruik de plasma- of gassterilisatiemethode (ethyleenoxide)18,19. Bewaar de ultracentrifugebuizen in de sterilisatieverpakking op een droge plaats en gebruik ze vóór de vervaldatum.
    OPMERKING: Voer maandelijkse monitoring uit van het LPS-niveau in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en het water dat wordt gebruikt voor ev-isolatie. De controle moet ook de buizen omvatten (bijvoorbeeld door het water [wascontrole] te testen dat 's nachts bij kamertemperatuur [RT] in de ultracentrifugebuizen is opgeslagen).

2. Bereiding van EV-uitgeput foetaal runderserum met laag endotoxine (EE-FBS)

  1. Zorg ervoor dat u ultralaag endotoxine FBS gebruikt (in de handel verkrijgbaar; zie materiaaltabel; <0,1 EU/ml).
  2. Plaats een fles ultra-laag endotoxine FBS in een waterbad en incubeer gedurende 30 minuten bij 56 °C. Deze stap is nodig om het complementsysteem te deactiveren.
  3. Pipetteer de geïnactiveerde FBS naar ultracentrifugebuizen en centrifugeer deze gedurende 4 uur bij 4 °C op 100.000 x g . Verzamel het supernatant in steriele buizen van 50 ml en zorg ervoor dat het niet meer dan 45 ml per buis overschrijdt om verontreiniging van de dop en bevochtiging van de ring van de buis te voorkomen.
  4. Bewaar het aldus bereide EE-FBS-serum bij -20 °C. Controleer de concentratie LPS in EE-FBS (stap 6). De LPS-concentratie moet op hetzelfde niveau liggen als vóór ultracentrifugatie.

3. Celkweek

  1. Voor deze studie kweekte SW480 en SW620 cellijnen in Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 4,5 g/L glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat en gentamicine (50 μL/ml) aangevuld met 10% EE-FBS dienovereenkomstig in 75 cm2 kweekkolven met behulp van aseptische techniek. Zaai bijna 4,5 x 10 6 cellen en 6,5 x 106 cellen per kolf voor respectievelijk SW480 en SW620.
  2. Verzamel de supernatanten twee keer per week (~ 10 ml per kolf) wanneer de cellen volledige confluentie bereiken (~ 13,5 x 10 6 en 20 x 106 cellen per kolf voor respectievelijk SW480 en SW620) en splits. Zorg ervoor dat de levensvatbaarheid van de cellen niet minder dan 99% is en dat de cellen bij 37 °C in een CO 2-atmosfeer van 5% worden gekweekt.
  3. Verzamel supernatanten uit de celcultuur in correct gelabelde buisjes van 15 ml. Centrifugeer de verzamelde supernatanten op 500 x g gedurende 5 minuten bij RT om celresten te verwijderen.
  4. Verzamel de supernatanten zorgvuldig, vermijd aanzuigend vuil, plaats in geëtiketteerde buizen en centrifugeer opnieuw bij 3.200 x g gedurende 12 minuten bij 4 °C.
  5. Verzamel supernatanten van de tweede centrifugatiestap in steriele, gelabelde buizen van 50 ml. Vermijd het bevochtigen van de randen van buizen. Zorg ervoor dat het volume van het supernatant niet groter is dan 45 ml en dat de buizen verticaal worden gehouden.
  6. Wikkel de dop van de buis met een steriele transparante film en bewaar supernatanten in de verticale positie bij -80 °C.
    OPMERKING: Voer maandelijkse controle van Mycoplasma spp. en LPS-besmetting in verse kweeksupernatanten (stap 6). Als het niveau van endotoxine in de supernatanten hoger is dan 0,05 EU/ml, controleer dan in welk stadium besmetting kan hebben plaatsgevonden en start het proces opnieuw vanaf het begin. Als besmetting van de celkweek door Mycoplasma spp. wordt gedetecteerd, moet de isolatie van de EV's van dergelijke supernatanten worden gestaakt.

4. Isolatie van EV's uit celkweeksupernatanten

  1. Bereid spuitfilters van 0,22 μm en spuiten met het juiste volume voor. Bereid twee buizen met kweeksupernatanten (90 ml).
  2. Vul de spuit met het supernatant en bevestig het filter aan de naaldadapter. Plaats de gevulde spuit met het filter over een tube van 50 ml. Druk op de zuigerflens en verzamel ~ 90 ml filtraat.
  3. Pipetteer het filtraat (7 ml) naar de ultracentrifugebuizen (zorg ervoor dat hetzelfde volume naar elke buis wordt gepipetteerd voor een goede balans) en centrifugeer gedurende 2 uur bij 4 °C op 100.000 x g .
    OPMERKING: De efficiëntie van EV's pelleteren hangt af van vele factoren (bijv. rotortype, k-factor, migratiepadlengte, de viscositeit van het medium, enz.), Die moeten worden geoptimaliseerd voor een beter herstel van EV's20.
  4. Gooi het supernatant weg met een steriele Pasteurpipet. Verzamel de resterende pellets met lange, gefilterde pipetpunten en bundel ze in twee ultracentrifugebuizen. Vul ze tot 7 ml met gefilterde endotoxinevrije PBS om de EV's te spoelen.
  5. Centrifugeer de PBS-geresuspendeerde pellets bij 100.000 x g gedurende 2 uur bij 4 °C. Verwijder het supernatant volledig met behulp van een steriele Pasteur-pipet en voeg 200 μL gefilterde, endotoxinevrije PBS toe aan beide buizen om de EV's te resuspenderen. Pipeteer de EV's voorzichtig om alle EV's te verzamelen.
  6. Breng de EV-suspensie over in een steriele reageerbuis van 1,5 ml (gebruik indien mogelijk een buis met een lage eiwitbinding). Bewaar 10 μl van de EV-suspensie voor het bereiden van een verdunning voor analyse van het volgen van nanodeeltjes (NTA) en voor andere doeleinden (bijv. meting van de eiwitconcentratie).
  7. Verdun de EV's met gefilterde PBS (1:1.000) voor metingen door NTA, volgens de instructies van de fabrikant. Zet de EV-buizen vast door de dop te omwikkelen met een steriele transparante folie. Bewaar de EV's bij -80 °C.

5. Specifieke markers detectie door western blotting

  1. Bepaal het eiwitgehalte in de monsters (bijvoorbeeld door Bradford-assay) en bereid de monsters (20 μg) voor met laadbuffer. Bereid de laadbuffer door 5 μL monsterbuffer (4x) en 2 μL monsterreductiemiddel (10x) te mengen tot een totaal volume van 20 μL. Incubeer de monsters bij 70 °C gedurende 10 min.
  2. Bereid polyacrylamidegels voor met SDS (10% -14%) en laad de 20 μg EV's in elke put.
  3. Voer de elektroforese met lopende buffer (30 g Tris, 144 g glycine, 10% SDS per 1 L) gedurende 45 minuten uit bij 150 V.
  4. Voer semi-droge overdracht van eiwitten van de gel uit op het polyvinylideendifluoride (PVDF) membraan in een transfermachine met Towbin-buffer (1,51 g Tris, 7,2 g glycine, 10% methanol per 0,5 L) bij 25 V gedurende 1 uur.
  5. Plaats het membraan in TBST-buffer (1 ml Tween, 100 ml Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS 10x) per 1 L) voor blokkering met 1% runderserumalbumine (BSA) in TBST-buffer en incubeer gedurende 1 uur op de rocker bij RT.
  6. Voeg verdunde (1:1.000) antilichamen, anti-CD9 1 (kloon#D8O1A) of anti-Alix 1 (kloon#3A9) toe in1% BSA en incubeer met het membraan 's nachts bij 4 °C op de rocker. Verwijder antilichamen en was het membraan 3x met 10 ml 1x TBST gedurende 10 minuten.
  7. Voeg geit anti-konijn of geit anti-muis (verdunning: 1:2.000) secundair antilichaam geconjugeerd met mierikswortelperoxidase toe, afhankelijk van het primaire antilichaam op het membraan, en incubeer gedurende 1 uur op de rocker bij RT. Verwijder antilichamen en was membraan 3x met 10 ml 1x TBST gedurende 10 minuten.
  8. Meng het substraat en luminol in een verhouding van 1:1 om een oplossing van 1 ml te verkrijgen. Giet de oplossing op het membraan. Plaats het membraan onmiddellijk in de meetkamer van het beeldvormingssysteem, kies de chemiluminescentiemodule en visualiseer eiwitbanden op het scherm.

6. Meting van het endotoxinegehalte door de Limulus Amebocyte Lysate-test (LAL)

  1. Voer chromogene LAL-meting van het endotoxineniveau uit, volgens de aanbeveling van de fabrikant. Gebruik in het kort de methode gebaseerd op de interactie van het endotoxine met het limulus amebocyte lysaat (LAL). De detectiegrens van deze methode is 0,005 EU/ml.
    OPMERKING: LAL-test blijft, ondanks zijn beperkingen, momenteel de standaardmethode voor het detecteren en kwantificeren van endotoxinebesmetting in verschillende soorten oplossingen en andere producten die in de wetenschap of geneeskunde worden gebruikt8. De beperkende factor van deze kit is de stabiliteit van de gereconstitueerde amebocytenlysaatoplossing, die slechts 1 week stabiel is bij -20 °C indien onmiddellijk na reconstitutie bevroren.
  2. Gebruik een tienvoudige verdunning van EV's en andere monsters en een 50-voudige verdunning van serum. Gebruik voor verdere experimenten alleen reagentia met een laag endotoxinegehalte, zoals EE-FBS, DMEM, PBS, RPMI (<0,005 EU/ml) en LPS-vrije kweeksupernatanten.

7. Detectie van prokaryote 16S rRNA-gen in EV-monsters

  1. Isoleer DNA uit de EV-monsters. Probeer de reagentia en de plaats van isolatie aseptisch te houden. Meet de DNA-concentratie en -kwaliteit (bijvoorbeeld met behulp van een spectrofotometer).
  2. Voer polymerasekettingreactie (PCR) uit, zoals eerder beschreven21. Bereid 1,5% agarosegel met ethidiumbromide of SYBR-groen om de PCR-producten in ultraviolet licht (UV) te visualiseren.
  3. Voer elektroforese van het monster en de gewichtsmarker uit met TRIS-acetaat-EDTA-buffer op 75 V gedurende 45 minuten. Visualiseer DNA-banden met behulp van het beeldvormingssysteem.

8. Bepaling van de effectieve LPS-concentratie voor stimulatie in het humaan monocytenmodel

  1. Bereid 2 x 106 monocyten / ml monocytensuspensie in RPMI 1640 aangevuld met L-glutamine, glucose en 2% EE-FBS. Voeg 50 μL van de suspensie per put van een 96-well weefselkweekplaat22 toe.
  2. Voeg een geschikt volume LPS of kweekmedium toe om de volgende eindconcentraties te verkrijgen: 0 pg/ml (controle), 10 pg/ml, 50 pg/ml, 100 pg/ml, 1 ng/ml en 100 ng/ml, in 100 μl totaal volume van de celsuspensie. Maak drievouden van elke LPS-concentratie.
  3. Kweek de cellen gedurende 18 uur bij 37 °C, 5% CO2. Verzamel het supernatant.
  4. Draai het supernatant op 2.000 x g gedurende 5 minuten. Breng de supernatanten over in nieuwe buizen. Meet TNF8,23 en IL-10 23 concentratie in verzamelde supernatanten met de cytometrische kralen array (CBA) humane cytokine kit, volgens de procedure van de fabrikant, met een flowcytometer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een vereiste of verplichte stap voor dit protocol is de uitsluiting van mogelijke endotoxineverontreiniging uit reagentia. Alle reagentia die worden gebruikt, zoals FBS, DMEM, RPMI, PBS en zelfs ultracentrifugebuizen, moeten endotoxinevrij zijn (<0,005 EU / ml). Het handhaven van het regime van geen endotoxinebesmetting is niet eenvoudig, omdat bijvoorbeeld het reguliere/standaardserum voor celkweek de rijke bron kan zijn (0,364 EU/ml; zie tabel 1).

Hoewel dit protocol is ontw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen jaren zijn methoden voor een goede EV-isolatie steeds belangrijker geworden, waardoor hun verdere betrouwbare analyses mogelijk zijn, bijvoorbeeld in het kader van het verkrijgen van betrouwbare omica en functionele gegevens24. Op basis van eerdere onderzoekservaring lijkt het erop dat niet alleen het type isolatiemethode, maar ook andere aandoeningen tijdens deze procedure belangrijk kunnen zijn. Het gebruik van EV-uitgeputte FBS wordt algemeen erkend als een noodzaak

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in afwezigheid van commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden geconstrueerd als een potentieel belangenconflict.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Science Centre, Polen, subsidienummer 2019/33/B/NZ5/00647. We willen professor Tomasz Gosiewski en Agnieszka Krawczyk van de afdeling Moleculaire Medische Microbiologie, Jagiellonian University Medical College bedanken voor hun onschatbare hulp bij de detectie van bacterieel DNA in EV's.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Alix (3A9) Mouse mAb Cell Signaling Technology2171
1250ul Filter Universal Pipette Tips, Clear, Polypropylene, Non-PyrogenicGoogLab ScientificGBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Flow CytometrBD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Cytokine Kit IIBD Biosciences551809
CD9 (D8O1A) Rabbit mAbCell Signaling Technology13174
ChemiDoc Imaging SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 17001401
DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) Corning10-013-CV
ELX800NB, Universal Microplate ReaderBIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fetal Bovine SerumGibco16000044
Fetal Bovine Serum South America Ultra Low Endotoxin Biowest S1860-500
Gentamicin, 50 mg/mL PAN – BiotechP06-13100
Goat anti-Mouse IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2004
Goat anti-Rabbit IgG- HRPSanta Cruz Biotechnologysc-2005
Immun-Blot PVDF MembraneBio-Rad Laboratories, Inc. 1620177
LPS from Salmonella abortus equi S-form (TLRGRADE) Enzo Life Sciences, Inc.ALX-581-009-L002
Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703930
Nanoparticle Tracking Analysis Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) Invitrogen NP0007
NuPAGE Sample Reducing Agent (10x) InvitrogenNP0004
ParafilmSigma AldrichP7793transparant film
Perfect 100-1000 bp DNA LadderEURxE3141-01 
PierceTM Chromogenic Endotoxin Quant KitThermo ScientificA39552
PP Oak Ridge Tube with sealing capsThermo Scientific3929, 03613
RPMI 1640RPMI-1640 (Gibco)11875093
SimpliAmp Thermal CyclerApplied BiosystemA24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Centrifuge with T-1270 rotorThermo Scientific75000100
Sub-Cell GT Horizontal Electrophoresis SystemBio-Rad Laboratories, Inc. 1704401
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstrateThermo Scientific34577
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection(ATCC)
SW480 cell lineAmerican Type Culture Collection (ATCC)
Syringe filter 0.22 umTPP99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad Laboratories, Inc. 1703940Transfer machine
Transfer pipette, 3.5 mLSARSTEDT86.1171.001

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  2. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  3. van Niel, G., et al. Challenges and directions in studying cell-cell communication by extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 23 (5), 369-382 (2022).
  4. Ngkelo, A., Meja, K., Yeadon, M., Adcock, I., Kirkham, P. A. LPS induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells is mediated through NOX4 and Giα dependent PI-3 kinase signalling. Journal of Inflammation. 9 (1), (2012).
  5. Schwarz, H., Schmittner, M., Duschl, A., Horejs-Hoeck, J. Residual endotoxin contaminations in recombinant proteins are sufficient to activate human CD1c+ dendritic cells. PLOS ONE. 9 (12), 113840(2014).
  6. Zanoni, I., Granucci, F. Role of CD14 in host protection against infections and in metabolism regulation. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 3, 32(2013).
  7. Takashiba, S., et al. Differentiation of monocytes to macrophages primes cells for lipopolysaccharide stimulation via accumulation of cytoplasmic nuclear factor kB. Infection and Immunity. 67 (11), 5573-5578 (1999).
  8. Schwarz, H., et al. Biological activity of masked endotoxin. Scientific Reports. 7, 44750(2017).
  9. Danesh, A., et al. Granulocyte-derived extracellular vesicles activate monocytes and are associated with mortality in intensive care unit patients. Frontiers in Immunology. 9, 956(2018).
  10. Barry, O. P., Pratico, D., Savani, R. C., FitzGerald, G. A. Modulation of monocyte-endothelial cell interactions by platelet microparticles. The Journal of Clinical Investigation. 102 (1), 136-144 (1998).
  11. Sadallah, S., Eken, C., Martin, P. J., Schifferli, J. A. Microparticles (ectosomes) shed by stored human platelets downregulate macrophages and modify the development of dendritic cells. Journal of Immunology. 186 (11), 6543-6552 (2011).
  12. Soekmadji, C., et al. The future of Extracellular Vesicles as Theranostics - an ISEV meeting report. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1809766(2020).
  13. Gioannini, T. L., et al. Isolation of an endotoxin-MD-2 complex that produces Toll-like receptor 4-dependent cell activation at picomolar concentrations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (12), 4186-4191 (2004).
  14. Roslansky, P. F., Dawson, M. E., Novitsky, T. J. Plastics, endotoxins, and the Limulus amebocyte lysate test. Journal of Parenteral Science and Technology. 45 (2), 83-87 (1991).
  15. Fishel, S., Jackson, P., Webster, J., Faratian, B. Endotoxins in culture medium for human in vitro fertilization. Fertility and Sterility. 49 (1), 108-111 (1988).
  16. Schulz, E., Karagianni, A., Koch, M., Fuhrmann, G. Hot EVs - How temperature affects extracellular vesicles. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 5 (146), 55-63 (2020).
  17. Osteikoetxea, X., et al. Differential detergent sensitivity of extracellular vesicle subpopulations. Organic & Biomolecular Chemistry. 13 (38), 9775-9782 (2015).
  18. Sakudo, A., Yagyu, Y., Onodera, T. Disinfection and sterilization using plasma technology: fundamentals and future perspectives for biological applications. International Journal of Molecular Sciences. 20 (20), 5216(2019).
  19. Shintani, H. Ethylene oxide gas sterilization of medical devices. Biocontrol Science. 22 (1), 1-16 (2017).
  20. Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  21. Salamon, D., et al. Comparison of iSeq and MiSeq as the two platforms for 16S rRNA sequencing in the study of the gut of rat microbiome. Applied Microbiology and Biotechnology. 106 (22), 7671-7681 (2022).
  22. Baj-Krzyworzeka, M., Szatanek, R., Weglarczyk, K., Baran, J., Zembala, M. Tumour-derived microvesicles modulate biological activity of human monocytes. Immunology Letters. 113 (2), 76-82 (2007).
  23. Chaiwut, R., Kasinrerk, W. Very low concentration of lipopolysaccharide can induce the production of various cytokines and chemokines in human primary monocytes. BMC Research Notes. 15 (1), 42(2022).
  24. Van Deun, J., et al. The impact of disparate isolation methods for extracellular vesicles on downstream RNA profiling. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 24858(2014).
  25. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  26. Pham, C. V., et al. Bovine extracellular vesicles contaminate human extracellular vesicles produced in cell culture conditioned medium when 'exosome-depleted serum' is utilised. Archives of Biochemistry and Biophysics. 708, 108963(2021).
  27. Li, Y., Boraschi, D. Endotoxin contamination: a key element in the interpretation of nanosafety studies. Nanomedicine. 11 (3), 269-287 (2016).
  28. Álvarez, E., et al. A system dynamics model to predict the human monocyte response to endotoxins. Frontiers in Immunology. 8, 915(2017).
  29. Busatto, S., et al. Tangential flow filtration for highly efficient concentration of extracellular vesicles from large volumes of fluid. Cells. 7 (12), 273(2018).
  30. Gałuszka, A., et al. Transition metal containing particulate matter promotes Th1 and Th17 inflammatory response by monocyte activation in organic and inorganic compounds dependent manner. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (4), 1227(2020).
  31. Falagas, M. E., Kasiakou, S. K. Toxicity of polymyxins: a systematic review of the evidence from old and recent studies. Critical Care. 10 (1), 27(2006).
  32. Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Endotoxinecontaminatiedifferenti le centrifugatienanopartikeltrackingWestern blotLAL testmonocytenstimulatieCD9 markerAlix marker

Gerelateerde artikelen