Methodenartikel

Voorbereiding van 3D gedecellulariseerde matrices van foetale muis skeletspieren voor celkweek

DOI:

10.3791/65069

⸱

3 maart 2023

 ,  ,  , 
1Centre for Ecology, Evolution and Environmental Changes and Global Change & Sustainability Institute, Department of Animal Biology, Faculty of Sciences, University of Lisbon

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk werd een decellularisatieprotocol geoptimaliseerd om gedecellulariseerde matrices van foetale skeletspieren van muizen te verkrijgen. C2C12-myoblasten kunnen deze matrices koloniseren, prolifereren en differentiëren. Dit in vitro model kan worden gebruikt om celgedrag te bestuderen in de context van skeletspierziekten zoals spierdystrofieën.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De extracellulaire matrix (ECM) speelt een cruciale rol bij het bieden van structurele ondersteuning voor cellen en het overbrengen van signalen die belangrijk zijn voor verschillende cellulaire processen. Tweedimensionale (2D) celcultuurmodellen vereenvoudigen de complexe interacties tussen cellen en de ECU te veel, omdat het ontbreken van een volledige driedimensionale (3D) ondersteuning het celgedrag kan veranderen, waardoor ze ontoereikend zijn voor het begrijpen van in vivo processen. Tekortkomingen in de samenstelling van ECM en cel-ECM interacties zijn belangrijke bijdragen aan een verscheidenheid van verschillende ziekten.

Een voorbeeld is LAMA2-congenitale spierdystrofie (LAMA2-CMD), waarbij de afwezigheid of vermindering van functionele laminine 211 en 221 kan leiden tot ernstige hypotonie, detecteerbaar bij of kort na de geboorte. Eerder werk met behulp van een muismodel van de ziekte suggereert dat het begin ervan optreedt tijdens foetale myogenese. De huidige studie was gericht op het ontwikkelen van een 3D in vitro model dat de studie van de interacties tussen spiercellen en de foetale spier-ECM mogelijk maakt, waarbij de inheemse micro-omgeving wordt nagebootst. Dit protocol maakt gebruik van diepe rugspieren ontleed van E18.5 muizenfoetussen, behandeld met een hypotone buffer, een anionisch reinigingsmiddel en DNase. De resulterende gedecellulariseerde matrices (dECM's) behielden alle geteste ECM-eiwitten (laminine α2, totale laminines, fibronectine, collageen I en collageen IV) in vergelijking met het inheemse weefsel.

Toen C2C12-myoblasten bovenop deze dECM's werden gezaaid, drongen ze de dECM's binnen en koloniseerden ze, wat hun proliferatie en differentiatie ondersteunde. Bovendien produceerden de C2C12-cellen ECM-eiwitten, wat bijdroeg aan de remodellering van hun niche binnen de dECM's. De oprichting van dit in vitro platform biedt een nieuwe veelbelovende aanpak om de processen te ontrafelen die betrokken zijn bij het ontstaan van LAMA2-CMD, en heeft het potentieel om te worden aangepast aan andere skeletspierziekten waarbij tekortkomingen in de communicatie tussen de ECM en skeletspiercellen bijdragen aan de progressie van de ziekte.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De extracellulaire matrix (ECM) is een belangrijk bestanddeel van weefsels, die hun niet-cellulaire component vertegenwoordigen. Deze driedimensionale (3D) structuur biedt niet alleen fysieke ondersteuning voor cellen, maar speelt ook een cruciale rol in de biochemische processen die betrokken zijn bij de ontwikkeling van organismen1. De vorming van een weefselspecifieke ECM vindt plaats tijdens de ontwikkeling, als gevolg van de complexe interacties tussen cellen en hun niches, beïnvloed door verschillende intra- en extracellulaire stimuli. De ECM is een zeer dynamische structuur die chemische en mechanische herschikkingen ondergaat op een temporeel-ruimtelijke manier en direct van invloed is op het lot van de cel2. Een van de meest opvallende kenmerken van de ECM is de functionele diversiteit, omdat elke weefsel-ECM een unieke combinatie van moleculen vertoont die verschillende topologieën en eigenschappen bieden die zijn afgestemd op de cellen die het bevat1.

ECM-signalering en -ondersteuning zijn cruciaal voor ontwikkeling en homeostase en kunnen bij verstoring leiden tot meerdere pathologische aandoeningen 3,4. Een voorbeeld is LAMA2-deficiënte congenitale dystrofie (LAMA2-CMD), de meest voorkomende vorm van congenitale spierdystrofie. Het LAMA2-gen codeert voor de laminine α2-keten, die aanwezig is in laminine 211 en laminine 221, en wanneer gemuteerd kan leiden tot LAMA2-CMD 5. Laminine 211 is de belangrijkste isovorm die wordt aangetroffen in het keldermembraan rond skeletspiervezels. Wanneer laminine 211 abnormaal of afwezig is, wordt de verbinding tussen het keldermembraan en spiercellen verstoord, wat leidt tot het begin van de ziekte6. Patiënten met LAMA2-CMD vertonen een mild tot ernstig fenotype, afhankelijk van het type mutatie in het LAMA2-gen.

Wanneer de functie van het laminine α2-eiwit wordt beïnvloed, kunnen patiënten bij de geboorte ernstige spierhypotonie ervaren en chronische ontsteking, fibrose en spieratrofie ontwikkelen, wat leidt tot een verminderde levensverwachting. Tot op heden zijn er geen gerichte behandelingen ontwikkeld en zijn therapeutische benaderingen beperkt tot het verlichten van de symptomen van de ziekte7. Daarom is het begrijpen van de onderliggende moleculaire mechanismen die betrokken zijn bij het ontstaan van deze ziekte cruciaal voor het ontwikkelen van geschikte therapeutische strategieën 6,8. Eerder werk met behulp van de dyW-muis 9, een model voor LAMA2-CMD, suggereert dat het begin van de ziekte begint in utero, met name tijdens foetale myogenese10. Een beter begrip van hoe het foetale myogenesedefect ontstaat, zou een game changer zijn bij het genereren van nieuwe therapeutische benaderingen voor LAMA2-CMD.

In vitro systemen bieden een gecontroleerde omgeving voor het bestuderen van cel-cel en cel-ECM interacties, maar 2D-cultuurmodellen missen de complexiteit van inheemse weefsels. Decellularisatie van weefsels produceert weefsel- en ontwikkelingsstadiumspecifieke acellulaire ECM-scaffolds die de natuurlijke celmicro-omgeving nauwkeuriger nabootsen in vergelijking met 2D-modellen en gemanipuleerde / synthetische steigers. Gedecellulariseerde matrices (dECM's) hebben het potentieel om de moleculaire en mechanische signalen van het gastheerweefsel te behouden, waardoor ze betere alternatieve modellen zijn voor het begrijpen van in vivo processen11.

Er zijn verschillende technieken, reagentia en aandoeningen die kunnen worden gebruikt voor decellularisatie12,13. In deze studie wordt een decellularisatieprotocol voor het foetale muizenhart, beschreven door Silva et al.14,15, aangepast aan de skeletspieren van de foetale muis en blijkt het alle geteste ECM-componenten (laminine α2, totale laminines, fibronectine, collageen I en collageen IV) te behouden. Het protocol omvat drie stappen: cellyse door osmotische shock (hypotone buffer), plasmamembraanoplossing en eiwitdissociatie (0,05% natriumdodecylsulfaat [SDS]) en enzymatische vernietiging van DNA (DNase-behandeling). Voor zover wij weten, is dit het eerste vastgestelde protocol voor het decellulariseren van foetale skeletspieren van muizen.

Om dit 3D in vitro systeem te gebruiken voor het bestuderen van LAMA2-CMD, is het cruciaal om de laminine α2 keten te behouden na decellularisatie. Daarom werd een optimalisatieprotocol geïmplementeerd waarbij verschillende detergentia (SDS en Triton X-100) en concentraties (0,02%, 0,05%, 0,1%, 0,2% en 0,5%) werden getest (gegevens niet getoond). De optimale keuze voor celverwijdering en conservering van het laminine α2-eiwit bleek 0,05% SDS te zijn. C2C12-cellen, een gevestigde myoblastcellijn16,17, werden gebruikt om de dECM's te zaaien. Deze cellen dringen de dECM binnen, prolifereren en differentiëren in deze steigers, waardoor nieuwe ECM-eiwitten worden gesynthetiseerd. De succesvolle productie van dit 3D in vitro model biedt een nieuwe benadering voor het begrijpen van de moleculaire en cellulaire processen die betrokken zijn bij foetale myogenese, het begin van LAMA2-CMD, en kan worden uitgebreid naar andere spierziekten waar de communicatie tussen de ECM en skeletspiercellen wordt verstoord.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven methodologieën zijn goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn (ORBEA) van de Faculteit Wetenschappen, Universiteit van Lissabon en Direção Geral de Veterinária (DGAV; ref. 0421/000/000/2022) en zijn in overeenstemming met de Europese richtlijn 2010/63/EU.

1. Voorbereiding van decellularisatiebuffers en reagentia

OPMERKING: Alle oplossingen die tijdens het decellularisatieprotocol worden gebruikt, moeten door autoclaveren worden gesteriliseerd en maximaal 3 maanden worden bewaard, tenzij anders vermeld.

  1. Bereid 10x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (10x PBS) door natriumchloride (NaCl) toe te voegen bij 137 mM, kaliumchloride (KCl) bij 2,68 mM, kalium-diwaterstoffosfaat (KH 2 PO 4) bij 8,1 mM en dinatrium-waterstof-fosfaatdihydraat (Na 2 HPO4) bij 1,47 mM toe te voegen aan gedemineraliseerd water (dH2O) en de pH aan tepassen naar 6,8. Voeg 100 ml 10x PBS toe aan 900 ml gedemineraliseerd H2O om 1x PBS te genereren. Autoclaaf en bewaren bij kamertemperatuur (RT). Voeg steriele penicilline/streptomycine stockoplossing (10.000 E/ml penicilline en 10 mg/ml streptomycine [pen/streptokokken]) toe aan een uiteindelijke concentratie van 1% vóór gebruik.
  2. Bereid de hypotone buffer door 1,21 g Tris(hydroxymethyl)aminomethaan (Tris-base) en 1 g ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) op te lossen in 1 L dH2O (10 mM Tris-base 0,1% EDTA). Gebruik een magneetroerder totdat deze is opgelost en stel de pH in op 7,8 met NaOH/HCl. Steriliseer door autoclaveren en bewaar bij RT. Voeg pen/streptokokken toe tot een eindconcentratie van 1% voor gebruik.
  3. Bereid de hypotone wasbuffer door 1,21 g Tris-base op te lossen in 1 L dH2O (10 mM Tris-base). Gebruik een magneetroerder totdat deze is opgelost en stel de pH in op 7,8 met NaOH/HCl. Autoclaaf en bewaren bij RT. Voeg pen/streptokokken toe aan 1% voor gebruik.
  4. Bereid de behandeling met anionisch wasmiddel voor door 0,05 g natriumdodecylsulfaat (SDS) toe te voegen aan 100 ml hypotone wasbuffer om een 0,05% SDS-behandelingsoplossing te produceren. Filtreer door een membraanfilter van 0,22 μm. Bewaren bij RT voor maximaal 1 maand.
    OPMERKING: De SDS-oplossing mag niet worden geautoclaveerd, omdat SDS neerslaat en afbreekt bij autoclaveren.
  5. Bereid de DNase-behandelingsoplossing door 1,21 g Tris-base op te lossen in 0,5 ml dH 2 O envoeg 1 ml 1 M magnesiumchloride (MgCl2) toe. Stel de pH in op 7,8 met NaOH/HCl. Autoclaaf en bewaar bij RT. Voeg DNase I toe voor gebruik (50 U/ml).

2. Monsterverzameling

OPMERKING: Wild-type C57 / BL6-muizen werden gebruikt in de studie. Alle technieken werden uitgevoerd in een laminaire stromingskap onder steriele omstandigheden.

  1. Euthanaseer volwassen zwangere vrouwelijke muizen op embryonale dag (E) 18,5 van de zwangerschap met behulp van isofluraaninhalatie gevolgd door cervicale dislocatie. Onderwerp de muizen aan terminale dissectie om de foetussen te extraheren.
    1. Spuit de buik van de muis in met 70% ethanol.
    2. Til met behulp van een chirurgische tang en schaar een huidplooi in de onderbuik op en maak een U-vormige incisie om de buikholte bloot te leggen18.
    3. Verzamel de baarmoederhoorns met de E18.5-foetussen door de eileiders en baarmoederhals te snijden en breng ze onmiddellijk over naar een petrischaaltje met ijskoude 1x PBS met 1% pen / streptokokken18.
    4. Verwijder snel de foetussen uit de baarmoeder en extra-embryonale weefsels en euthanaseer ze door onthoofding met een schaar18.
  2. Breng één foetus per keer over naar een petrischaaltje met ijskoude 1x PBS. Verwijder met behulp van een stereomicroscoop de huid en snijd de ledematen af. Snijd vanaf de ventrale kant door de ribbenkast en verwijder het borstbeen en de onderliggende organen.
  3. Draai de foetale romp dorsale kant naar boven. Verwijder het cervicale deel van de wervelkolom, de dorsale vetafzettingen en het bindweefsel bovenop de diepe rugspieren.
  4. Gebruik een chirurgische tang om de ribbenkast te verankeren en schraap en maak de diepe rugspieren voorzichtig los van de omliggende weefsels met behulp van een micro-scalpel10. Deze procedure resulteert in de isolatie van twee spierstukken per foetus (links en rechts), beide voornamelijk samengesteld uit longissimus - en iliocostalisspieren , met enkele van de transversospinalis - en levator-costarumspieren inbegrepen.
  5. Bewaar de spiermonsters in 1x PBS met 1% pen/streptokokken bij 4 °C voor korte opslag (<1 week), of bij -80 °C voor langere periodes.
    OPMERKING: Gebruik vers verzamelde monsters voor de beste resultaten. Monsters die gedurende langere perioden (>3 maanden) zijn ingevroren, vertonen een lagere decellularisatie-efficiëntie en meer eiwitafbraak. Epaxiale spiermassa's werden gebruikt voor de decellularisatie-experimenten, maar andere spieren (bijv. Ledemaatspieren) kunnen worden verwerkt voor decellularisatie met behulp van hetzelfde protocol.

3. Decellularisatie van de foetale skeletspieren

OPMERKING: Alle technieken werden uitgevoerd in een laminaire stromingskap onder steriele omstandigheden. Voor een gedetailleerde schematische weergave, zie figuur 1A. Alle stappen werden uitgevoerd met roeren in een orbitale schudder met een diameter van 120 mm (165 tpm) bij 25 °C, tenzij anders vermeld. Voeg voor gebruik 1% pen/streptokokken toe aan oplossingen. Zuig bij het verwijderen van de oplossingen voorzichtig aan om beknelling van het monster in de pipet te voorkomen.

  1. Dag 1 - Bereid ongeveer 2 mm x 1 mm x 1 mm (~ 3,5 mg) weefselfragmenten van de epaxiale spiermassa's. Voeg 3 ml hypotone buffer met 1% pen/streptokokken toe aan elke put van een 12-well plaat en voeg één heel spierweefselfragment per put toe.
    1. Incubeer de weefselfragmenten in hypotone buffer met roeren gedurende 18 uur (nacht) (O / N).
  2. Dag 2 - Zuig de hypotone buffer op met behulp van een pipet met fijne punt en was de monsters 3 x 1 uur met 3 ml 1x PBS telkens met roeren.
    1. Incubeer de monsters gedurende 24 uur met 3 ml 0,05% SDS-reinigingsmiddeloplossing met roeren.
      OPMERKING: (CHECK POINT) Na SDS-incubatie moeten de monsters er transparant uitzien. De monsters vertonen een gelatine-achtige consistentie en zijn daarom meer geneigd om zich aan de pipet te hechten bij het verwijderen van de vloeistoffen.
  3. Dag 3 - Verwijder de SDS-wasmiddeloplossing met een pipet met fijne punt en was de weefselfragmenten 3 x 20 minuten met 3 ml hypotone wasbuffer telkens met roeren.
    OPMERKING: (PAUZEPUNT) De monsters kunnen gedurende 18 uur (O/N) in hypotone wasbuffer op 4 °C worden gehouden. Zorg ervoor dat SDS goed wordt verwijderd tijdens wasstappen, omdat resterende SDS cytotoxisch kan zijn.
    1. Incubeer de weefselfragmenten gedurende 3 uur met 2 ml DNase-oplossing met roeren bij 37 °C.
    2. Verwijder de DNase-oplossing met een pipet met fijne punt en was de weefselfragmenten 3 x 20 minuten met 3 ml 1x PBS telkens met roeren. Was ten slotte O/N met roeren (60 tpm).
      OPMERKING: Na de DNase-behandeling worden de dECM's kleverig door de aanwezigheid van DNA-residuen. Daarom is zorgvuldig wassen noodzakelijk.
    3. Bewaar de dECM's in 1x PBS met 1% pen/streptokokken bij 4 °C tot recellularisatie (<1 week). Voor andere toepassingen, bewaren bij -80 °C.

4. Kwaliteitsbeoordeling van decellularisatie

OPMERKING: DNA-kwantificering, DAPI/methylgroene kleuring en falloidinekleuring werden uitgevoerd om de aanwezigheid van resterende celinhoud na decellularisatie te evalueren. Immunohistochemie en western blot-analyses werden uitgevoerd om de retentie van belangrijke ECM-eiwitten na decellularisatie te beoordelen.

  1. Kwantificering van het DNA aanwezig in de dECM
    OPMERKING: De dECM's moeten worden vergeleken met het inheemse weefsel om de aanwezigheid van DNA te detecteren.
    1. Weeg voorafgaand aan de decellularisatie een microcentrifugebuis van 1,5 ml op een zeer nauwkeurige digitale weegschaal. Voordat u het spiermonster naar de buis overbrengt, verwijdert u alle resterende 1x PBS met een papieren handdoek. Weeg de tube af met het monster. Bereken het natte gewicht van de monsters met behulp van vergelijking (1):
      Monster nat gewicht =gewichtsbuis met monsters-gewicht lege buis (1)
    2. Decellulariseer de monsters volgens het protocol beschreven in rubriek 3.
    3. Plaats de monsters in microcentrifugebuizen van 2 ml.
      OPMERKING: De monsters kunnen bij -20 °C worden bewaard tot DNA-extractie en kwantificering.
    4. Voer DNA-extractie uit van de dECM's en inheemse weefselmonsters met behulp van een op spinkolommen gebaseerde kit. Voeg de verteringsbuffer toe volgens de instructies van de fabrikant.
    5. Homogeniseer de monsters in een kralenmolen twee keer gedurende 2,5 minuten telkens (de steunen omdraaien) met behulp van één wolfraamcarbidekraal per buis (gebruik gekoelde buisbevestigingen).
    6. Voeg proteïnase K toe en incubeer O/N met langzaam roeren bij 56 °C.
    7. Ga verder met het protocol zoals beschreven in de instructies van de fabrikant.
    8. Elueer met de door de fabrikant geleverde buffer en centrifugeer 2 x 1 min bij ≥6.000 x g, telkens bij 4 °C om de DNA-opbrengst te verhogen.
      OPMERKING: DNA kan worden bewaard bij -20 °C tot kwantificering.
    9. Kwantificeer het DNA dat aanwezig is in de monsters met behulp van een fluorescerende dsDNA-detectiekit volgens de instructies van de fabrikant.
    10. Normaliseer het DNA-gehalte als nanogram DNA per milligram oorspronkelijk nat gewicht van het monster.
    11. Analyseer de gegevens met behulp van een tweezijdige student's t-test en druk uit als de gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
  2. Immunohistochemie
    OPMERKING: Oplossingen 1, 2 en 3 en de fixatieve oplossing moeten vóór gebruik worden bereid en kunnen maximaal 6 maanden bevroren worden bewaard. Alle gebruikte antilichamen en kleurstoffen en respectieve verdunningen worden vermeld in Tabel 1.
    1. Bereiding van oplossingen
      1. Bereid fixatieve oplossing door 2 g paraformaldehyde (PFA), 8 g sucrose en 24 μL 1 M CaCl 2 toe te voegen aan 77 ml 0,2 M Na 2 HPO 4 en 23 ml 0,2 M NaH2 PO 4, aan een eindvolume van 200 ml door toevoeging van dH2 O.Stel de pH in op7,4.
      2. Bereid 0,12 M fosfaatbuffer door 13,5 g Na 2 HPO 4 en 3,2 g NaH 2 PO 4 toe te voegen aan 1 L dH2O. Stel de pH in op7,4.
      3. Bereid oplossing 1 door 4 g sucrose toe te voegen aan 100 ml fosfaatbuffer van 0,12 M.
      4. Bereid oplossing 2 door 15 g sacharose toe te voegen aan 100 ml fosfaatbuffer van 0,12 M.
      5. Bereid oplossing 3 door 15 g sacharose en 7,5 g gelatine toe te voegen aan 100 ml fosfaatbuffer van 0,12 M. Verwarm op 37 °C tot de gelatine is opgelost.
      6. Bereid methylgroene stockoplossing (2% methylgroen poeder opgelost in dH2O)19.
    2. Immunodetectie
      1. Bevestig de monsters met de fixatieve oplossing gedurende ten minste 4 uur bij 4 °C.
      2. Was de monsters 2x gedurende 10 minuten met 1x PBS.
      3. O/N of meer dan 1 dag bewaren in oplossing 1 bij 4 °C.
      4. Was en bewaar O/N of meer dan 1 dag in oplossing 2 bij 4 °C. Laat de monsters opwarmen tot RT.
      5. Incubeer gedurende 3 uur in oplossing 3 bij 37 °C. Bewaar extra oplossing 3 bij 37 °C om later te gebruiken.
      6. Vorm kleine (2 cm x 1 cm x 1 cm) containers in aluminiumfolie. Plaats een dunne laag oplossing 3 in de gegoten container en laat deze opstijven. Leg de monsters op de gestolde oplossing 3 en dek af met warme oplossing 3. Oriënteer de monsters en laat ze stollen. Markeer de locatie op de gestolde oplossing 3 met een kleurenpen.
      7. Bevries door de containers op het oppervlak van droogijsgekoeld of vloeibaar stikstofgekoeld isopentaan te plaatsen.
      8. Met behulp van een optimale snijtemperatuur (O.C.T.) compound, bevestigt u de bevroren gelatineblokjes met de monsters op de cryostaat.
      9. Snijd de bevroren gelatineblokjes en breng de weefselsecties over naar de dia's. Laat ze 60 min drogen.
      10. Gebruik een hydrofobe marker om een lijn rond de secties te volgen.
      11. Was de dia's 3 x 10 min in 1x PBS.
      12. Bedek de secties met 1% runderserumalbumine (BSA), 1% geitenserum en 0,05% Triton X-100 verdund in 1x PBS (blokkeringsoplossing) gedurende 30 minuten (blokkeringsstap).
      13. Verdun de primaire antilichamen in een blokkerende oplossing en bedek de secties. Incubeer O/N bij 4 °C in een gesloten doos, met vochtig papier, om te voorkomen dat de secties uitdrogen.
      14. Was de dia's 3 x 10 min met 1x PBS.
      15. Verdun de secundaire antilichamen in een blokkerende oplossing en bedek de secties. Incubeer gedurende 1,5 uur bij RT in het donker.
        OPMERKING: Vermijd blootstelling aan licht om degradatie van fluoroforen te voorkomen.
      16. Was de dia's 3 x 10 min met 4x PBS.
        OPMERKING: Een hogere concentratie PBS kan worden gebruikt wanneer een sterke achtergrond aanwezig is.
      17. Dompel de dia's onder in DAPI-oplossing (5 μg/ml 1,4-diazabicyclo-2,2,2-octaan in 0,1% Triton X-100/1x PBS) gedurende elk 30 s.
      18. Afspoelen in 1x PBS.
      19. Monteer de secties in antifadingmedium (50 mg/ml n-propylgallaat in 1x PBS:glycerol [1:9]) en sluit af met een coverslip. Bewaren bij 4 °C tot observatie en beeldacquisitie in een fluorescentiemicroscoop20.
        OPMERKING: Voor de in toto immunohistochemische experimenten werd hetzelfde protocol (zie stappen 4.2.2.12-4.2.2.18) gebruikt, behalve dat de monsters eerder waren gefixeerd in 4% PFA verdund in 1x PBS gedurende 3 uur bij RT. DNA-kleuring werd uitgevoerd door methylgroen toe te voegen aan de secundaire antilichaamoplossing. Alle gebruikte antilichamen en kleurstoffen, en hun respectieve verdunningen, zijn vermeld in tabel 1. Monsters werden vervolgens gemonteerd in anti-fading medium tussen twee coverslips gescheiden door stalen ringen, aan elkaar gelijmd met bijenwas, en 100 μm beeldstapels werden verkregen met behulp van een confocale microscoop21.
  3. Western blot analyse
    OPMERKING: Alle gebruikte antilichamen en respectieve verdunningen zijn vermeld in Tabel 1.
    1. Bereiding van oplossingen
      1. Bereid de 2x SDS-PAGE-laadbuffer voor door 20 ml glycerol, 4 g SDS en 0,2 ml broomfenolblauw toe te voegen aan 80 ml 100 ml Tris-basisoplossing. Stel de pH in op 6,8. Voeg voor gebruik verse dithiothreitol (DTT) toe.
      2. Bereid de Tris gebufferde zoutoplossing wasbuffer met Tween 20 (TBST) oplossing door 2,4 g Tris-base, 8,8 g NaCl en 1 ml Tween-20 tot dH2O toe te voegen aan een eindvolume van 1 L. Stel de pH in op 7,4-7,6 met HCl.
      3. Bereid de 10x lopende buffer (RB) voor door 30,2 g Tris-base, 144,2 g glycine en 10 g SDS toe te voegen aan 1 L dH2O. Voeg voor gebruik 100 ml 10x RB toe aan 900 ml dH2O om 1x RB (werkoplossing) te bereiden.
        OPMERKING: Terwijl 10x RB enkele maanden bij RT kan worden opgeslagen, kan 1x RB op verschillende runs worden hergebruikt.
      4. Bereid de overdrachtsbuffer (TB) voor door 5,82 g Tris-base, 2,93 g glycine en 0,5 g SDS toe te voegen aan 800 ml dH2O. Nadat de componenten zijn opgelost, voegt u 200 ml methanol toe. Afkoelen bij 4 °C.
        OPMERKING: De TB moet voor elk gebruik vers worden bereid.
    2. Eiwitextractie
      1. Verzamel epaxiale spieren van E18.5-muizen en plaats ze onmiddellijk in een microcentrifugebuis (2 ml) met 2x SDS-PAGE-laadbuffer met vers toegevoegde DTT (100 mM DTT). Verwerk E18.5 dECM op dezelfde manier.
      2. Voeg één wolfraamcarbide kraal per buis toe. Homogeniseer 2x in een kralenmolen telkens 2,5 min (draai de steunen om).
      3. Soniceer de monsters gedurende 5 minuten in een echobad.
      4. Verwarm de monsters gedurende 10 minuten op 50 °C.
      5. Centrifugeer de monsters gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 12.000 × g .
      6. Breng het supernatant over in een verse microcentrifugebuis van 1,5 ml.
      7. Kwantificeer het eiwit met behulp van een microvolumespectrofotometer.
      8. Bewaren bij -20 °C tot verder gebruik.
    3. Polyacrylamide gel elektroforese
      1. Gebruik prefab acrylamide gradiëntgel (4%-20%)
      2. Monteer de gel in de elektroforesetank. Verwijder de kam voorzichtig. Voeg 1x RB toe tot de lijn die in de elektroforesetank wordt weergegeven. Zorg ervoor dat de putten gevuld zijn met RB.
      3. Laad 100 μg eiwit per monster in de putjes. Laad 12 μL eiwitstandaard met een hoog molecuulgewicht.
      4. Loop in totaal 100 minuten met constante spanning (10 min bij 150 V en 90 min bij 185 V).
    4. Overdracht
      1. Week de filterpads en sponzen met gekoelde TB (4 °C) terwijl de gel loopt.
      2. Snijd de polyvinylideendifluoridemembranen op de grootte van de gel. Activeer ze met methanol en was ze met dH2O. Week in de TB.
      3. Monteer de transfercassette met de sponzen, filterpads, gels en geactiveerde membranen volgens de instructies van de fabrikant.
      4. Plaats de cassette in de elektroforesetank met de gekoelde TB (op een bed van ijs). Voeg de koeleenheid toe. Loop gedurende 90 minuten op 100 V.
      5. Na de overdracht beitsen met een Coomassie blauwe vervanger om de transferkwaliteit te beoordelen.
    5. Immunodetectie
      1. Bereid de blokkerende oplossing (TBST met 5% magere melk). Incubeer de membranen met roeren gedurende 1 uur bij RT.
      2. Spoel 3 x 5 s af met TBST.
      3. Incubeer de membranen O/N met de primaire antilichamen verdund in TBST met 2% BSA en 0,02% natriumazide (3 ml per membraan) in een koude kamer (4 °C) met roeren.
      4. De volgende dag 3 x 5 min wassen met TBST.
      5. Incubeer de membranen met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen verdund in TBST met 5% magere melk (5 ml voor elk membraan) gedurende 1 uur bij RT.
      6. Was de vliezen met TBST 3 x 5 min. Houd in TBST tot de detectiestap.
      7. Visualiseer het eiwit met behulp van een in de handel verkrijgbare ontwikkelkit. Voeg detectiereagentia toe volgens de instructies van de fabrikant. Verkrijg beelden van de bands.
      8. Om meer dan één antilichaam per membraan te testen, stript u na de detectiestap de voormalige antilichamen met drie wasbeurten (elk 5 minuten) met TBST en herhaalt u de stappen 4.3.5.2-4.3.5.7.

Tabel 1: Antilichamen en kleurstoffen die worden gebruikt in immunohistochemie en western blot-analyse en de respectieve verdunningen. Klik hier om deze tabel te downloaden.10,22

5. Celkweek in gedecellulariseerde matrices

OPMERKING: Alle technieken werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap. Alle incubaties werden uitgevoerd bij 37 °C en met 5% CO2.

  1. Bereid het celkweekmedium, hoog glucose Dulbecco's Modified Eagle Medium met stabiele glutamine en met natriumpyruvaat (DMEM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% pen/streptokokken (compleet kweekmedium).
  2. Plaats de dECM's in een petrischaaltje in 1x PBS met 1% pen/streptokokken in een laminaire flowkap en scheid ze in stukjes van ongeveer 500 μm x 500 μm x 250 μm, met behulp van een micro scalpel en pincet.
    OPMERKING: dECM's hebben een zachte textuur en daarom is het vaak gemakkelijker om een pincet te gebruiken om ze in ongeveer even grote stukken te scheiden in plaats van ze met het micro-scalpel te snijden.
  3. Breng de fragmenten over in een plaat van 96 putten (drie of vier stuks per put) met 200 μL volledig kweekmedium, vooraf opgewarmd tot 37 °C. Incubeer gedurende 2 uur in de couveuse.
  4. Voeg 500 μL trypsine toe aan een T25-kolf bezaaid met sub-confluente (~70%) C2C12-cellen. Resuspendie in 1 ml volledig medium.
  5. Voeg 10 μL van de resuspensie toe aan 10 μL Trypan blauwe kleurstof en laad in een hemocytometer. Tel en bereken het celnummer en bevestig de levensvatbaarheid van de cel.
  6. Zuig het medium op uit de 96-putplaat met de dECM's en voeg 200 μL volledig kweekmedium toe met 50.000 levensvatbare C2C12-cellen.
  7. Incubeer gedurende 2 dagen en breng vervolgens, met behulp van een pincet, de dECM's (met de cellen) over op een 48-wellige plaat met 400 μL volledig kweekmedium. Zuig om de 2 dagen het medium voorzichtig op met een micropipette om te voorkomen dat de dECM's loskomen van de bodem van de put en voeg vers medium toe tot dag 8.
    OPMERKING: Matrices worden gedurende 2 dagen bewaard in 96-putplaten om de C2C12-celhechting aan de dECM's te bevorderen en worden vervolgens overgebracht naar een 48-well-plaat om toegang te krijgen tot een groter volume medium met voedingsstoffen. dECM's moeten zich hechten aan de bodem van de putten.
  8. Vervang voor het differentiatie-experiment het volledige kweekmedium door differentiatiemedium (DMEM aangevuld met 2% paardenserum en 1% pen/streptokokken) op dag 8, gevolgd door incubatie in differentiatiemedium gedurende 4 dagen tot dag 12.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van het decellularisatieprotocol is om dECM's te produceren die sterk lijken op de samenstelling van inheems weefsel. Om de effectiviteit van het decellularisatieproces te bepalen, werden verschillende methoden gebruikt, waaronder onderzoek van weefselmorfologie, meting van DNA-niveaus, kleuring voor F-actine en analyse van belangrijke ECM-componenten met behulp van immunohistochemie en westerse blottingtechnieken. In het bijzonder werden vijf belangrijke ECM-componenten van skeletspierweefsels geanalyseerd.

...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ECM is een complex netwerk van macromoleculen dat in alle weefsels aanwezig is en een cruciale rol speelt bij het reguleren van celgedrag en -functie2. De ECU fungeert als een fysieke steiger voor cellen om zich aan te hechten en biedt signalen die actief cellulaire processen moduleren, zoals proliferatie, motiliteit, differentiatie en apoptose. Een goede vorming en onderhoud van de ECM is dus essentieel voor zowel de ontwikkeling als de homeostase1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gefinancierd door de Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; contract nr. 23049), het MATRIHEALTH-project en cE3c-eenheidsfinanciering UIDB/00329/2020. We willen graag onze donateur Henrique Meirelles bedanken die ervoor heeft gekozen om het MATRIHEALTH-project te ondersteunen. Dit werk profiteerde van de infrastructuren van de Faculteit Wetenschappen Microscopie Faciliteit, een knooppunt van het Portugese Platform van BioImaging (referentie PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), en we danken Luís Marques voor zijn hulp bij beeldacquisitie en -verwerking. Tot slot bedanken we Marta Palma voor de technische ondersteuning en ons onderzoeksteam voor hun genereuze bijdragen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
12 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21021
4′6-Diamidino-2-fenylindole dihydrochlorideMerckD8417
4–20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad4561093
48 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21023
96 Well Cell Culture Plate, Flat, TC, SterileAbdos LabwareP21024
Bovine Serum Albumine, Fraction VNZYtechMB04601
BX60 fluorescence microscopeOlympus
Cryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM high glucose w/ stabiele glutamine w/ natriumpyruvaatBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen69506
Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA)Merck108418
Fetaal bovien serumBiowestS1560-500
Fine tip transfer pipetteThermoFisher15387823
GeitenserumBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 IncubatorThermo Scientific
HiMark Pre-stained Protein StandardInvitrogen
Horse Serum, New Zealand originGibco16050122
HRP-α- Konijn IgGabcamab205718
HRP-α- Rat IgGabcamab205720
HRP-α-Muis IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
MethylgroenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer ThermoFisher
Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol freeAlfa Aesar043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polystyreen Petri schotel 60x15mm met ventilatie (steriel)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS kitThermo ScientificQ32851
Qubit™ 3 FluorometerInvitrogen15387293
S6E Zoom Stereo microscopeLeica
NatriumdodecylsulfaatMerck11667289001
SuperFrost® Plus adhesieve dia'sThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent SubstraatThermo Scientific15626144
TCS SPE confocal microscopeLeica
Tris-(hydroxymethyl) aminomethaan (Tris base) ≥99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypaan Blauw Oplossing, 0.4%Gibco15250061
Trypsine-EDTA (0.05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50% Oplossing)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL membraanrol (0.22µm)AdvanstaL-08024-001
α-Collageen Iabcamab21286
α-Collageen IVMilliporeAB756P
α-Collageen IVSanta Cruz Biotechnologysc-398655
α-FibronectineSigmaF-3648
α-Laminine α2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Muis Alexa 488Molecular ProbesA11017
α-Muis Alexa 568Molecular ProbesA11019
α-pan-LaminineSigmaL- 9393
α-fosfo-histone 3Merk Millipore06-570
α-Konijn Alexa 568Molecular ProbesA21069
α-Konijn Alexa 488Molecular ProbesA11070
α-Rat Alexa 488Molecular ProbesA11006

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Genetic disorders of the extracellular matrix. Anatomical Record. 303 (6), 1527-1542 (2020).
  4. Ahmad, K., Shaikh, S., Ahmad, S. S., Lee, E. J., Choi, I. Cross-talk between extracellular matrix and skeletal muscle: implications for myopathies. Frontiers in Pharmacology. 11, 142(2020).
  5. Tome, F. M., et al. Congenital muscular dystrophy with merosin deficiency. Comptes Rendus de l'Academie des Sciences. Serie III, Sciences de la Vie. 317 (4), 351-357 (1994).
  6. Gawlik, K. I., Durbeej, M. Skeletal muscle laminin and MDC1A: pathogenesis and treatment strategies. Skeletal Muscle. 1 (1), 9(2011).
  7. van Ry, P. M., et al. ECM-related myopathies and muscular dystrophies: pros and cons of protein therapies. Comprehensive Physiology. 7 (4), 1519-1536 (2017).
  8. Gawlik, K. I., Durbeej, M. A family of laminin α2 chain-deficient mouse mutants: advancing the research on LAMA2-CMD. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 59(2020).
  9. Kuang, W., et al. Merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Partial genetic correction in two mouse models. Journal of Clinical Investigation. 102 (4), 844-852 (1998).
  10. Nunes, A. M., et al. Impaired fetal muscle development and JAK-STAT activation mark disease onset and progression in a mouse model for merosin-deficient congenital muscular dystrophy. Human Molecular Genetics. 26 (11), 2018-2033 (2017).
  11. McCrary, M. W., Bousalis, D., Mobini, S., Song, Y. H., Schmidt, C. E. Decellularized tissues as platforms for in vitro modeling of healthy and diseased tissues. Acta Biomaterialia. 111, 1-19 (2020).
  12. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  13. Philips, C., Terrie, L., Thorrez, L. Decellularized skeletal muscle: A versatile biomaterial in tissue engineering and regenerative medicine. Biomaterials. 283, 121436(2022).
  14. Silva, A. C., et al. Comparable decellularization of fetal and adult cardiac tissue explants as 3D-like platforms for in vitro studies. Journal of Visualized Experiments. (145), e56924(2019).
  15. Silva, A. C., et al. Three-dimensional scaffolds of fetal decellularized hearts exhibit enhanced potential to support cardiac cells in comparison to the adult. Biomaterials. 104, 52-64 (2016).
  16. Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
  17. Burattini, S., et al. C2C12 murine myoblasts as a model of skeletal muscle development: morpho-functional characterization. European Journal of Histochemistry. 48 (3), 223-233 (2004).
  18. Murphy, D. Caesarean section and fostering. Methods in Molecular Biology. 18, 177-178 (1993).
  19. Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-specific stain methyl green in the fluorescent labeling of embryos. Journal of Visualized Experiments. (99), e52769(2015).
  20. Lichtman, J. W., Conchello, J. -A. Fluorescence microscopy. Nature Methods. 2 (12), 910-919 (2005).
  21. Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy. Nature Protocols. 15 (5), 1585-1611 (2020).
  22. Paulsson, M. A.T.S. Biosynthesis, tissue distribution and isolation of laminins. The Laminins. , 1-26 (1994).
  23. Fedecostante, M., et al. Recellularized native kidney scaffolds as a novel tool in nephrotoxicity screening. Drug Metabolism and Disposition: the Biological Fate of Chemicals. 46 (9), 1338-1350 (2018).
  24. Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
  25. Brouki Milan, P., et al. Decellularization and preservation of human skin: A platform for tissue engineering and reconstructive surgery. Methods. 171, 62-67 (2020).
  26. Lamandé, S. R., Bateman, J. F. Collagen VI disorders: Insights on form and function in the extracellular matrix and beyond. Matrix Biology. 71, 348-367 (2018).
  27. Baptista, P. M., et al. The use of whole organ decellularization for the generation of a vascularized liver organoid. Hepatology. 53 (2), 604-617 (2011).
  28. White, L. J., et al. The impact of detergents on the tissue decellularization process: a ToF-SIMS study. Acta Biomaterialia. 50, 207-219 (2017).
  29. Nakayama, K. H., Batchelder, C. A., Lee, C. I., Tarantal, A. F. Renal tissue engineering with decellularized rhesus monkey kidneys: age-related differences. Tissue Engineering. Part A. 17 (23-24), 2891-2901 (2011).
  30. Ma, X., et al. Development and in vivo validation of tissue-engineered, small-diameter vascular grafts from decellularized aortae of fetal pigs and canine vascular endothelial cells. Journal of Cardiothoracic Surgery. 12 (1), 101(2017).
  31. Wu Young, M. Y., et al. Decellularized fetal matrix suppresses fibrotic gene expression and promotes myogenesis in a rat model of volumetric muscle loss. Plastic and Reconstructive Surgery. 146 (3), 552-562 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Foetale muisspierextracellulaire matrixskeletspier ECMdifferentiatie van spiercellenC2C12 myoblastenlaminine alfa tweecollageen IDNase behandeling

Gerelateerde artikelen