Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Netwerk farmacologie voorspelling en metabolomics validatie van het mechanisme van fructus phyllanthi tegen hyperlipidemie

3.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65071

⸱

7 april 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Health Preservation and Rehabilitation, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Administration of Traditional Chinese Medicine Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine, Regimen and Health, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Regimen and Health of Sichuan Province

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een geïntegreerde strategie voor het verkennen van de belangrijkste doelen en mechanismen van Fructus Phyllanthi tegen hyperlipidemie op basis van netwerkfarmacologievoorspelling en metabolomics-verificatie.

Samenvatting

Hyperlipidemie is wereldwijd een belangrijke risicofactor geworden voor hart- en vaatziekten en leverbeschadiging. Fructus Phyllanthi (FP) is een effectief medicijn tegen hyperlipidemie in de traditionele Chinese geneeskunde (TCM) en de Indiase geneeskunde theorieën, maar het potentiële mechanisme vereist verder onderzoek. Het huidige onderzoek heeft tot doel het mechanisme van FP tegen hyperlipidemie te onthullen op basis van een geïntegreerde strategie die netwerkfarmacologievoorspelling combineert met metabolomics-validatie. Een vetrijk dieet (HFD) -geïnduceerd muizenmodel werd vastgesteld door de plasmalipideniveaus te evalueren, waaronder totaal cholesterol (TC), triglyceride (TG), lipoproteïnecholesterol met lage dichtheid (LDL-C) en lipoproteïnecholesterol met hoge dichtheid (HDL-C). Netwerkfarmacologie werd toegepast om de actieve ingrediënten van FP en potentiële doelwitten tegen hyperlipidemie te achterhalen. Metabolomica van plasma en lever werden uitgevoerd om differentiële metabolieten en hun overeenkomstige routes te identificeren tussen de normale groep, modelgroep en interventiegroep. De relatie tussen netwerkfarmacologie en metabolomica werd verder geconstrueerd om een uitgebreid beeld te krijgen van het proces van FP tegen hyperlipidemie. De verkregen belangrijkste doeleiwitten werden geverifieerd door moleculaire docking. Deze resultaten weerspiegelden dat FP de plasmalipidespiegels en leverbeschadiging van hyperlipidemie geïnduceerd door een HFD verbeterde. Galluszuur, quercetine en bèta-sitosterol in FP werden aangetoond als de belangrijkste actieve verbindingen. Een totaal van 16 en zes potentiële differentiële metabolieten in respectievelijk plasma en lever bleken betrokken te zijn bij de therapeutische effecten van FP tegen hyperlipidemie door metabolomica. Verder gaf integratieanalyse aan dat de interventie-effecten geassocieerd waren met CYP1A1, AChE en MGAM, evenals de aanpassing van L-kynurenine, corticosteron, acetylcholine en raffinose, voornamelijk met betrekking tot tryptofaanmetabolismeroute. Moleculaire docking zorgde ervoor dat de bovenstaande ingrediënten die inwerken op hyperlipidemie-gerelateerde eiwitdoelen een sleutelrol speelden bij het verlagen van lipiden. Samenvattend bood dit onderzoek een nieuwe mogelijkheid voor het voorkomen en behandelen van hyperlipidemie.

Inleiding

Hyperlipidemie is een veel voorkomende stofwisselingsziekte met ernstige gevolgen voor de menselijke gezondheid en is ook de primaire risicofactor voor hart- en vaatziekten1. Onlangs is er een neerwaartse leeftijdsgerelateerde trend voor deze ziekte en jongere mensen zijn vatbaarder geworden vanwege langdurige onregelmatige levensstijlen en ongezonde eetgewoonten2. In de kliniek zijn verschillende medicijnen gebruikt om hyperlipidemie te behandelen. Een van de meest gebruikte geneesmiddelen voor patiënten met hyperlipidemie en gerelateerde atherosclerotische aandoeningen is bijvoorbeeld statines. Langdurig gebruik van statines heeft echter bijwerkingen die niet kunnen worden verwaarloosd, wat leidt tot een slechte prognose, zoals intolerantie, behandelingsresistentie en bijwerkingen 3,4. Deze tekortkomingen zijn extra pijnen geworden voor hyperlipidemiepatiënten. Daarom moeten nieuwe behandelingen voor stabiele lipidenverlagende werkzaamheid en minder bijwerkingen worden voorgesteld.

Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) is op grote schaal gebruikt om ziekten te behandelen vanwege de goede werkzaamheid en weinig bijwerkingen5. Fructus Phyllanthi (FP), de gedroogde vrucht van Phyllanthus emblica Linn. (in de volksmond bekend als amla-bes of Indiase kruisbes), is een beroemd medicijn en voedsel homoloog materiaal van traditionele Chinese en Indiase medicijnen 6,7. Dit geneesmiddel is gebruikt voor het opruimen van warmte, het koelen van bloed en het bevorderen van de spijsvertering, volgens TCM-theorieën8. Moderne farmacologische studies hebben aangetoond dat FP rijk is aan bioactieve verbindingen zoals galluszuren, ellaginezuren en quercetine9, die verantwoordelijk zijn voor een reeks veelzijdige biologische eigenschappen, door op te treden als een antioxidant, een ontstekingsremmer, leverbescherming, een anti-hypolipidaemische, enzovoort10. Recent onderzoek heeft ook aangetoond dat FP de bloedlipiden van patiënten met hyperlipidemie effectief kan reguleren. Variya et al.11 hebben bijvoorbeeld aangetoond dat FP-vruchtensap en het belangrijkste chemische ingrediënt van galluszuur het plasmacholesterol kunnen verlagen en olie-infiltratie in de lever en aorta kunnen verminderen. De therapeutische werkzaamheid was gerelateerd aan de regulatie van FP bij het verhogen van de expressie van peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor-alfa en het verminderen van hepatische lipogene activiteit. Het onderliggende mechanisme van FP bij het verbeteren van hyperlipidemie moet echter verder worden onderzocht, omdat de bioactieve ingrediënten vrij uitgebreid zijn. We probeerden het potentiële mechanisme van de therapeutische werkzaamheid van FP te onderzoeken, wat gunstig kan zijn voor de verdere ontwikkeling en het gebruik van dit geneesmiddel.

Momenteel wordt netwerkfarmacologie beschouwd als een holistische en efficiënte techniek om het therapeutische mechanisme van TCM te bestuderen. In plaats van te zoeken naar enkele ziekteverwekkende genen en geneesmiddelen die alleen een individueel doelwit behandelen, wordt een compleet netwerk van geneesmiddelen-ingrediënten-genen-ziekten geconstrueerd om het multi-doelmechanisme van het geneesmiddel met meerdere ingrediënten te vinden met betrekking tot hun uitgebreide behandeling12. Deze techniek is vooral geschikt voor TCM, omdat hun chemische samenstellingen enorm zijn. Helaas kan netwerkfarmacologie alleen worden gebruikt om doelen te voorspellen die in theorie worden beïnvloed door chemische ingrediënten. De endogene metabolieten in het ziektemodel moeten worden geobserveerd om de effectiviteit van netwerkfarmacologie te valideren. De metabolomics-methode, die ontstaat met de ontwikkeling van systeembiologie, is een belangrijk hulpmiddel voor het monitoren van de veranderingen in endogene metabolieten13. De veranderingen in metabolieten weerspiegelen de steady state veranderingen van de gastheer, wat ook een belangrijke indicator is voor het bestuderen van het interne mechanisme. Sommige onderzoekers hebben met succes netwerkfarmacologie en metabolomica geïntegreerd om het interactiemechanisme tussen geneesmiddelen en ziekten te onderzoeken14,15.

Dit artikel onderzoekt de mechanistische basis van FP tegen hyperlipidemie door netwerkfarmacologie en metabolomics-technieken te integreren. Netwerkfarmacologie werd toegepast om de relatie tussen de belangrijkste actieve ingrediënten in FP en moleculaire doelen voor hyperlipidemie te analyseren. Vervolgens werd metabolomics uitgevoerd om de verandering van endogene metabolieten in het diermodel te observeren, wat de geneesmiddelacties op metabolisch niveau kan verklaren. Vergeleken met de toepassing van netwerkfarmacologie of metabonomica alleen, leverde deze geïntegreerde analyse een specifieker en uitgebreider onderzoeksmechanisme op. Bovendien werd de moleculaire koppelingsstrategie gebruikt om de interactie tussen actieve ingrediënten en belangrijke eiwitten te analyseren. In het algemeen zou deze geïntegreerde benadering het gebrek aan experimenteel bewijs voor netwerkfarmacologie en het ontbreken van een endogene mechanisme voor de metabolomics-methode kunnen compenseren en kan het worden gebruikt voor de therapeutische mechanismeanalyse van natuurlijke geneeskunde. Het belangrijkste schematische stroomdiagram van het protocol is weergegeven in figuur 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures met betrekking tot de behandeling van dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door de institutionele ethische commissie van de Chengdu University of Traditional Chinese Medicine (protocolnummer 2020-36). Mannelijke C57BL/6 muizen (20 ± 2 g) werden gebruikt voor deze studie. De muizen werden verkregen uit een commerciële bron (zie Tabel van Materialen).

1. Op netwerkfarmacologie gebaseerde voorspelling

OPMERKING: De netwerkfarmacologie wordt gebruikt om de actieve ingrediënten en hun belangrijkste doelen van FP tegen hyperlipidemie te voorspellen.

  1. Selectie van actieve ingrediënten en belangrijkste doelen
    1. Zoek op het trefwoord "Phyllanthi Fructus" in de farmacologiedatabase van het traditionele Chinese geneeskundesysteem (TCMSP; http://tcmspw.com/tcmsp.php) om de lijst met de kandidaat-actieve ingrediënten en doelen van FP te verkrijgen.
      OPMERKING: Normaal gesproken worden alleen ingrediënten met orale biologische beschikbaarheid (OB) ≥30% en geneesmiddelachtige (DL) waarden ≥0,18 in de database opgenomen als actieve ingrediënten.
    2. Zoek op het trefwoord "hyperlipidemie" in de GeneCards-database (https://www.genecards.org/), de Online Mendelian Inheritance in Man-database (OMIM; https://omim.org/) en de therapeutische doeldatabase (TTD; http://db.idrblab.net/ttd/) om de respectieve kandidaat-doelen van hyperlipidemie te verkrijgen. Download de spreadsheets van ziektedoelen. Verwijder de herhaalde doelen om de lijst met hyperlipidemiedoelen te verkrijgen.
    3. Kopieer deze lijsten uit stap 1.1.1 en 1.1.2 naar een nieuwe spreadsheet. Gebruik de functie "Gegevens - Duplicaten identificeren" in de werkbalk om kruispuntdoelen te krijgen. Importeer de kruispuntdoellijst in UniProtKB (http://www.uniprot.org/) om de gen- en eiwitnamen te standaardiseren.
      OPMERKING: Deze doelen zijn gerelateerd aan zowel FP als hyperlipidemie. Voorspel daarom deze kruispuntdoelen als de doelen van FP tegen hyperlipidemie.
  2. Bouw van een eiwit-eiwit interactienetwerk
    1. Open de STRING-database (https://string-db.org/) 11.5. Plak de kruispuntdoellijst van FP tegen hyperlipidemie in het dialoogvenster 'Lijst met namen'. Selecteer Homo sapiens in "Organismen" en klik op ZOEKEN > DOORGAAN.
      OPMERKING: Mensen en muizen hebben zeer vergelijkbare genen. Daarom wordt verdere experimentele verificatie uitgevoerd met muizen.
    2. Wanneer de resultaten beschikbaar zijn, vinkt u de verberg niet-verbonden knooppunten in het netwerk aan in "Geavanceerde instellingen". Stel het hoogste vertrouwen (0,900) in op "minimaal vereiste interactiescore" en klik vervolgens op de knop UPDATE .
    3. Klik op Exports in de titelbalk en download de korte tabeltekst van het eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk in PNG- en TSV-indeling.
  3. Bouw van een drug-component-disease-target netwerk
    1. Open Cytoscape 3.9.1 (zie Tabel met materialen). Importeer het TSV-indelingsbestand van stap 1.2.3. Optimaliseer de kleur, het lettertype en de zijkant van de netwerkknooppunten via de stijlbalk in het configuratiescherm.
    2. Gebruik de functie "Netwerk analyseren" voor netwerktopologieanalyse. Verkrijg hubgenen door CytoHubba in Cytoscape. Opzetten van het drug-ingredient-target-disease netwerk.
  4. GO- en KEGG-verrijkingsanalyse
    1. Open DAVID Bioinformatics Resources (https://david.ncifcrf.gov/home.jsp). Klik op Analyse starten en plak de doellijst in het linkerdialoogvenster. Selecteer OFFICIEEL GENSYMBOOL in "Select Identifier". Selecteer Homo sapiens in "Selecteer soort". Selecteer Genenlijst in "Lijsttype". Klik op Lijst verzenden.
    2. Wanneer de resultaten beschikbaar zijn, klikt u op Bovenstaande genenlijst analyseren met een van de DAVID-tools. Vink GOTERM_BP_DIRECT, GOTERM_CC_DIRECT GOTERM_MF_DIRECT aan in "Gene Ontology" voor GO-functieverrijkingsanalyse. Vink KEGG_Pathway aan in "Pathways" voor KEGG pathway enrichment analysis.
    3. Klik op Functionele Annotatiegrafiek om de resultaten weer te geven.
      OPMERKING: Stel de statistische significantiedrempel van de verrijkingsanalyse in op p < 0,05.

2. Experimenteel ontwerp

  1. Het FP-waterige extractpreparaat
    OPMERKING: FP wordt verwerkt in het laboratorium van professor Lina Xia aan de Chengdu University of TCM8.
    1. Week het gedroogde pfp-poeder (90 g) in 1 l zuiver water in een schone maatkolf van 2 l. Gebruik ultrasone behandeling (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz) om gedurende 30 minuten op te lossen. Filtreer de oplossing om het extract te verkrijgen met een dubbellaags, 1 mm x 1 mm steriel medisch gaas. Herhaal de bovenstaande bewerking drie keer om de volledige oplossing van FP te garanderen.
    2. Gebruik de roterende verdampingsmethode voor verdere concentratie. Stel het toerental in op 50 rpm met een temperatuur van 60 °C gedurende 4 uur. Concentreer het waterige extract tot 100 ml.
    3. Verdeel het ruwe extract van FP (0,9 g/ml) gelijkmatig in twee delen (50 ml). Eén deel wordt gebruikt als de hooggedoseerde FP-vloeistof (0,9 g / ml). Voeg 50 ml zuiver water toe aan een ander deel en beschouw het als de lage dosis FP-vloeistof (0,45 g / ml). Gebruik de hoge en lage dosis FP-waterige oplossingen voor toediening. Bewaar de vloeistof bij -20 °C tot gebruik.
  2. Voorbereiding van dieren
    1. Huis 50 mannelijke C57BL/6 muizen (20 ± 2 g) in een goed geventileerde ruimte bij kamertemperatuur, met een licht-donker cyclus van 12 uur en vrije toegang tot voedsel en zuiver water.
    2. Wijs de muizen willekeurig toe aan twee groepen: voer 10 muizen met een normaal dieet en 40 muizen met een vetrijk dieet (zie tabel met materialen) om hyperlipidemie te induceren.
      OPMERKING: Na 8 weken te hebben gevoerd, werden de muizen gescreend op verdere medicamenteuze interventie.
    3. Trek in de 8e week ongeveer 200 μL bloed uit elke muisbaan. Centrifugeer het bloed gedurende 10 minuten bij 5,733 x g bij 4 °C om plasmamonsters te verkrijgen. Bepaal de TC- en TG-niveaus met in de handel verkrijgbare testkits (zie materiaaltabel).
    4. Selecteer zes muizen met de meest normale lipideniveaus als de no-treatment control (NC) groep. Selecteer 24 muizen met een significant hoger lipidenniveau als de vetrijke dieetgroep en verdeel ze willekeurig in vier groepen: vetrijke dieet (HFD) -groep, lage dosis FP (FP_L) -groep, hoge dosis FP (FP_H) -groep en positieve controle (PC) -groep.
    5. Dien maagirrigatie toe aan de FP_L en FP_H groepen met twee doseringen FP (lage dosis, 4,5 g / kg en hoge dosis, 9 g / kg), respectievelijk; maagirrigatie naar de PC-groep met simvastatinetabletten (5 mg/kg; zie materiaaltabel); en maagirrigatie naar de NC- en HFD-groepen met hetzelfde volume fysiologische zoutoplossing eenmaal daags gedurende 4 weken.
      OPMERKING: De huidige studie gebruikte de waterige oplossingen van FP en simvastatine voor de behandeling.
    6. In de 12e week, na anesthesie door 1% pentobarbital natrium (30 mg / kg), offeren de muizen van alle groepen. Verzamel ~ 400 μL bloedmonsters uit de orbitale ader van elke muis.
      OPMERKING: Stimuleer de tenen en voetzolen van de muizen met een pincet. Als er geen reactie is, blijkt dit adequate anesthesie.
    7. Centrifugeer het bloed gedurende 10 minuten bij 5.733 x g bij 4 °C om plasmamonsters te verkrijgen en bepaal de TC-, TG-, LDL-C- en HDL-C-niveaus met in de handel verkrijgbare testkits (zie materiaaltabel). Verkrijg leverweefselmonsters16 en onderwerp ze aan histopathologische analyse. Gebruik de resterende plasma- en levermonsters voor metabolomics-analyse (stap 3).
      OPMERKING: Alle monsters worden bewaard bij -80 °C tot gebruik.
  3. Histopathologisch leveronderzoek
    1. Fixeer verse leverweefsels met 4% paraformaldehyde-oplossing gedurende meer dan 24 uur. Haal het weefsel uit het fixatief en strijk de doelweefsels glad met een scalpel. Plaats het weefsel en het bijbehorende etiket in de dehydrator.
    2. Uitdrogen in een ethanolgradiënt: 75% alcohol gedurende 4 uur, 85% alcohol gedurende 2 uur, 90% alcohol gedurende 2 uur, 95% alcohol gedurende 1 uur, absolute ethanol gedurende 1 uur, xyleen gedurende 30 minuten. Plaats de weefselcassette in een weefselvorm in paraffinewas gedurende drie wasbeurten, 30 min elk16.
    3. Plaats de met was doordrenkte weefsels in de weefselinbedding (zie tabel met materialen). Voordat de was stolt, verwijdert u de weefsels uit de dehydrator, plaatst u ze in de ingesloten doos en bevestigt u het bijbehorende label.
    4. Koel de wasblokken af in een vriestafel van -20 °C, verwijder ze uit het ingesloten frame en snijd het wasblok bij.
    5. Snijd de bijgesneden wasblokken in secties van 3 μm dik met behulp van een microtoom (zie materiaaltabel). Laat de secties drijven in water van 40 °C, haal ze van de platen en bak ze in een oven van 60 °C. Na het bakken met water en droge was, haal je het eruit en bewaar je het op kamertemperatuur.
    6. Plaats de secties achtereenvolgens in xyleen I gedurende 10 minuten, xyleen II gedurende 10 minuten, xyleen III gedurende 10 minuten, absolute ethanol I gedurende 5 minuten, absolute ethanol II gedurende 5 minuten, 75% alcohol gedurende 5 minuten en was in water16.
    7. Kleur de secties met hematoxyline-kleuringsoplossing gedurende 4 minuten, 1% zoutzuuralcoholoplossing (75% alcohol) voor differentiatie, 1% ammoniakwateroplossing terug blauw en was ze met water.
    8. Bevlek de secties gedurende 2 minuten met eosinekleuringsoplossing en was ze met water.
    9. Observeer de secties met een optische microscoop met een vergroting van 200x en 400x.
  4. Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie )LC-MS) analyse
    1. Identificatie van ingrediënten van KP
      OPMERKING: De analyse wordt uitgevoerd met behulp van ultra-high-performance vloeistofchromatografie in combinatie met hybride quadrupole-orbitrap hoge resolutie massaspectrometrie (UPLC-Q-Orbirap HRMS, LC-MS; zie tabel met materialen).
      1. Meet nauwkeurig 1 g gedroogd pp-poeder af en doe het in een schone maatkolf van 50 ml.
      2. Voeg 25 ml 70% methanol toe aan de maatkolf en weeg nauwkeurig. Gebruik ultrasone behandeling (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz) gedurende 30 minuten om het oplossen te helpen. Weeg opnieuw nauwkeurig om het verlies na het oplossen nauwkeurig te bepalen en gebruik 70% methanol om het verlies aan te vullen.
        OPMERKING: Meet het volume niet, omdat de schaal van de maatkolf niet nauwkeurig is, vooral na het waterbad van 4 °C.
      3. Schud op om volledig te mengen. Gebruik een microporeus membraan van 0,22 μm om te filteren.
    2. Voorbereiding van plasmamonsters
      1. Voeg nauwkeurig 100 μL plasma (stap 2.2.7) toe aan een dubbel volume (200 μL) acetonitril in een centrifugebuis van 1,5 ml en vortex het met een vortexvibrator gedurende ten minste 30 s. Volg deze procedure voor alle voorbeelden.
      2. Centrifugeer alle monsters bij 17.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Breng de supernatanten na centrifugatie over in een nieuwe centrifugebuis van 1,5 ml. Droog de supernatanten onder stikstof. Reconstitueer met 200 μL extractieoplosmiddel (acetonitril:water = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex de gereconstitueerde oplossing gedurende ten minste 30 s en gebruik ultrasone behandeling gedurende 10 minuten (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz). Centrifugeer bij 17.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
      4. Filtreer de supernatanten met 0,22 μm filtermembranen en houd ze op 4 °C voor analyse.
    3. Voorbereiding van het levermonster
      1. Homogeniseer 90 mg leverweefsel (stap 2.2.7) gedurende 1 min in ijskoud methanolwater (1:1, v/v, 1 ml) en centrifugeer ze gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 21.500 x g . Breng het supernatant over in centrifugebuizen van 1,5 ml. Volg deze procedure voor alle voorbeelden.
      2. Extraheer de neerslag opnieuw volgens dezelfde procedure en voeg de supernatanten samen in nieuwe centrifugebuizen van 1,5 ml. Droog de supernatanten onder stikstof. Reconstitueer met 300 μL van het extractieoplosmiddel (methanol:water = 4:1 [v/v]).
      3. Vortex de gereconstitueerde oplossing gedurende ten minste 30 s en gebruik ultrasone behandeling gedurende 10 minuten (in een waterbad van 4 °C, vermogen: 250 W, frequentie: 35 kHz). Centrifugeer bij 17.200 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C.
      4. Filtreer de supernatanten met 0,22 μm filtermembranen en houd ze op 4 °C voor analyse.
        OPMERKING: De gepoolde kwaliteitscontrolemonsters (QC) werden bereid door 10 μL aliquots uit elk plasma- en levermonster te mengen (één per zes monsters).
    4. Analyseparameters van LC-MS
      OPMERKING: De mobiele fase bestaat uit 0,1% mierenzuur (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B). Breng deze oplosmiddelen over in een schone glazen fles en sluit ze aan op het LC-MS-systeem.
      1. Stel de gradiëntprogramma's van plasmamonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: 1% B (0-1,5 min), 1%-60% B (1,5-13,0 min), 60%-99% B (13,0-20,0 min), handhaven op 99% B (20,0-25,0 min), 99%-1% B (25,0-25,1 min) en handhaven op 1% B tot 27 min.
      2. Stel de autosamplercondities van de plasmamonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: het injectievolume, 2 μL; en het debiet 0,3 ml/min voor elke analyse.
      3. Stel het gradiëntprogramma van levermonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: 1% B (0-1 min), 1%-53% B (1-15 min), 53%-70% B (15-30 min), 70%-90% B (30-32 min), 90%-95% B (32-40 min), 95%-1% B (40-42 min), en handhaaf op 1% B tot 45 min.
      4. Stel de autosamplercondities van de levermonsters in het "inlaatbestand" van het LC-MS-systeem als volgt in: injectievolume, 5 μL; en het debiet 0,3 ml/min voor elke analyse.
      5. Stel de MS-detectiecondities van zowel de plasma- als de levermonsters in het "MS-tunebestand" van het LC-MS-systeem in. Voer de MS-acquisitie uit met behulp van zowel positieve als negatieve ionisatiemodi.
        OPMERKING: De verwarmde elektrospray ionisatieparameters zijn als volgt: sproeispanning: 3,5 kV voor positieve ionisatie en 3,8 kV voor negatieve ionisatie; Mantelgasstroom: 55 arb; hulpgasstroom: 15 arb; sondeverwarmingstemperatuur: 300 °C; en capillaire temperatuur: 350 °C.
      6. Importeer de verzamelde onbewerkte gegevens in de Compound Discoverer-software en stel de methodesjabloon in volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).

3. Metabolomische validatie

OPMERKING: De metabolomische profileringsgegevens van plasma- en levermetabolieten worden geïmporteerd in Compound Discoverer-software om de metabole functie-extractie uit te voeren door een algoritme voor moleculaire functie-extractie aan te nemen. Stel de parameters als volgt in: massaafwijking, 5 x 10-6; massabereik, 100-1.500; signaal-ruisverhouding (SNR) drempel, 3; en afwijking van de retentietijd, 0,05. Evalueer de stabiliteit en herhaalbaarheid van metabolomics aan de hand van de relatieve standaarddeviatie (RSD) van QC-piekgebieden.

  1. Gebruik SIMCA-P-software (zie materiaaltabel) voor multivariate statistische analyse van de integrale waarden verkregen uit LC-MS-bevindingen. Gebruik orthogonale partiële kleinste kwadratenanalyse (OPLS-DA) voor de gemiddeld-gecentreerde gegevens en de modellering van steekproefklassen.
  2. Beschouw na de OPLS-DA-test de metabolieten, met integraal met variabel belang in de projectiewaarden (VIP) van >1 en een p-waarde van <0,05 uit de t-test van Student als de potentiële differentiële metabolieten.
  3. Identificeer de verstoorde metabolieten en metabole routes door open databasebronnen, waaronder Human Metabolome (HMDB; http://www.hmdb.ca/), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG; https://www.kegg.jp/) en MetaboAnalyst5.0 (https://www.metaboanalyst.ca/).
  4. Visualiseer de resultaatweergaven door MetaboAnalyst5.0 en het 'Wu Kong'-platform (https://www.omicsolution.com/wkomics/main/).

4. Moleculaire koppeling

  1. Download respectievelijk de 3D-structuur van de geselecteerde FP-ingrediënten uit de TCMSP-database. Zoek de namen van de ingrediënten in het zoekvak 'Chemische naam' en download de bijbehorende 3D-structuurbestanden in mol2-indeling.
  2. Download de kristalstructuren van de belangrijkste doelen uit de AlphaFold Protein Structure Database (Alphafold DB;, https://alphafold.ebi.ac.uk/). Zoek de doelnamen in het zoekvak en download de bijbehorende kristalstructuurbestanden in pdb-formaat.
  3. Importeer ingrediënten en doelstructuren in AutoDockTools-software. Klik op Bewerken > Water verwijderen om watermoleculen te verwijderen. Klik op Bewerken > Hydrogenen > Toevoegen om waterstof toe te voegen. Stel de ingrediënten in als de 'ligand' en voer blind docking uit door de hele doelen als de 'receptor' te selecteren17.
  4. Voer een waarde in het vak achter "midden" en "grootte" in om de nieuw ontwikkelde ruimte aan te passen, waardoor het mogelijk wordt om het ligand en de receptor volledig te omvatten. Sla de ligand- en receptorbestanden op in pdbqt-indeling.
  5. Gebruik AutoDock Vina om moleculaire docking uit te voeren. Stel de balk "Receptor" in op de naam van de 'receptor.pdbqt' en de balk "Ligand" op de naam van de 'ligand.pdbqt'. Verkrijg de optimale locatie voor ligandbinding aan de receptor. Noteer de bindingsenergiewaarde op de optimale positie.
    OPMERKING: Het koppelingsproces is berekend door het genetische algoritme14. Alle opties voor het uitvoeren van docking waren standaardwaarden. Dockingframes worden automatisch gerangschikt van de hoogste naar de laagste bindingsenergie.
  6. Importeer de dockingbestanden in PILP (Protein-ligand Interaction Profiler' https://plip-tool.biotec.tu-dresden.de/plip-web/plip/index) om het visuele systeemmodel te krijgen. Download de modelbestanden in pse-formaat en importeer ze in PyMOL-software (zie Materiaaltabel) om verdere visualisatie te construeren.

5. Statistische analyse

OPMERKING: Gebruik spss statistische software (zie tabel met materialen) voor gegevensanalyse. Beschouw de waarde van p < 0,05 als statistisch significant.

  1. Druk de waarden uit als gemiddelde ± standaardafwijking (SD).
  2. Voer een eenrichtings-ANOVA uit, gevolgd door post hoc minst significant verschil (LSD), Dunnett (in geval van gelijke variantie) of Dunnett's T3 (in geval van ongelijke variantie) om de statistische significantie tussen groepen te testen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Netwerk farmacologie
In totaal werden 18 potentiële ingrediënten in KP gescreend op basis van hun farmacokinetische en farmacodynamische eigenschappen uit de database en LC-MS-analyse (de totale ionchromatogrammen zijn weergegeven in aanvullende figuur 1). Door relevante literatuur is het gehalte aan galluszuur veel hoger dan andere ingrediënten en is het effectief in het verlagen van lipiden 9,11. Daarom werd dit ingrediënt o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In de afgelopen jaren is de incidentie van hyperlipidemie toegenomen, voornamelijk als gevolg van langdurige ongezonde eetgewoonten. TCM en zijn chemische ingrediënten hebben verschillende farmacologische activiteiten, die de afgelopen jaren op grote schaal zijn bestudeerd37,38. FP is een soort fruitbron, gebruikt als medicijn en voedsel, en heeft een belangrijk potentieel voor de behandeling van hyperlipidemie. Het potentiële therapeutische mechanisme van FP teg...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door het Product Development and Innovation Team van TCM Health Preservation and Rehabilitation (2022C005) en Research on New Business Cross-border Integration of "Health Preservation and Rehabilitation+".

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
101-3B OvenLuyue Instrument and Equipment Factory\
80312/80302 Glass SlideJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
80340-1630 Cover SlipJiangsu Sitai Experimental Equipment Co., LTD\
AccucoreTM C18 (3 mm × 100 mm, 2. 6 µm)Thermo Fisher Scientific\
AcetonitrileFisher ChemicalA998Versie 1.5.6
ACQUITY UPLC HSS T3 Column (2.1 mm × 100 mm, 1.8 µm)Thermo Fisher Scientific\
AethanolFisher ChemicalA995Versie 3.0
Ammonia SolutionChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1336-21-6Versie 3.9.1
AutoDockToolsScripps Institution of Oceanography\
BS-240VT Full-automatic Animal Biochemical Detection SystemShenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd.\
Compound DiscovererThermo Fisher Scientific\
CytoscapeCytoscape Consortium\
DM500 Optical MicroscopeLeica\
DV215CD Electronic BalanceOhaus Corporation., LtdT15A63
Ethyl AlcoholChengdu Cologne Chemicals Co., LTD64-17-5
Formic AcidFisher ChemicalA118
HDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA112-1-1
Hematoxylin Staining SolutionBiosharpBL700B
High Fat DietENSIWEIER202211091031
Hitachi CT15E/CT15RE CentrifugeHitachi., Ltd.\
HomogenizerOulaibo Technology Co., Ltd\
Hydrochloric AcidChengdu Cologne Chemicals Co., LTD7647-01-0
Image-forming SystemLIOO\
JB-L5 FreezerWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JB-L5 Tissue EmbedderWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JK-5/6 MicrotomeWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
JT-12S HydroextractorWuhan Junjie Electronics Co., Ltd\
KQ3200E Ultrasonic CleanerKun Shan Ultrasonic Instruments Co., Ltd\
LDL-C Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA113-1-1
Male C57BL/6 Mice SBF Biotechnology Co., Ltd.\Versie 2.3.2
Neutral BalsamShanghai Yiyang Instrument Co., Ltd10021190865934
Pure WaterGuangzhou Watson's Food & Beverage Co., LtdGB19298
PyMOLDeLano Scientific LLC\Versie 14.1
RE-3000 Rotary EvaporatorYarong Biochemical Instrument Factory ., Ltd\
RM2016 Pathological MicrotomeShanghai Leica Instruments Co., Ltd\Versie 26.0
SIMCA-PUmetrics AB\
SimvastatinMerck Sharp & Dohme., Ltd14202220051
SPSSInternational Business Machines Corporation\
TC Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA111-1-1
TG Assay KitNanjing Jiancheng Bioengineering InstituteA110-1-1
UPLC-Q-Exactive Quadrupole Electrostatic Field Orbital Hydrazine High Resolution Mass SpectrometryThermo Fisher Scientific\
Vortex VibratorBeijing PowerStar Technology Co., Ltd.LC-Vortex-P1
XyleneChengdu Cologne Chemicals Co., LTD1330-20-7

Referenties

  1. Nelson, R. H. Hyperlipidemia as a risk factor for cardiovascular disease. Primary Care: Clinics in Office Practice. 40 (1), 195-211 (2013).
  2. Mach, F., et al. 2019 ESC/EAS Guidelines for the management of dyslipidaemias: lipid modification to reduce cardiovascular risk: the Task Force for the management of dyslipidaemias of the European Society of Cardiology (ESC) and European Atherosclerosis Society (EAS). European Heart Journal. 41 (1), 111-188 (2020).
  3. Oesterle, A., Laufs, U., Liao, J. K. Pleiotropic effects of statins on the cardiovascular system. Circulation Research. 120 (1), 229-243 (2017).
  4. Last, A. R., Ference, J. D., Menzel, E. R. Hyperlipidemia: drugs for cardiovascular risk reduction in adults. American Family Physician. 95 (2), 78-87 (2017).
  5. Wu, S., et al. Recent advances of tanshinone in regulating autophagy for medicinal research. Front Pharmacol. 13, 1059360(2022).
  6. Mirunalini, S., Krishnaveni, M. Therapeutic potential of Phyllanthus emblica (amla): the ayurvedic wonder. Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 21 (1), 93-105 (2010).
  7. Zhao, H. J., et al. Fructus phyllanthi tannin fraction induces apoptosis and inhibits migration and invasion of human lung squamous carcinoma cells in vitro via MAPK/MMP pathways. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (6), 758-768 (2015).
  8. Yan, X., et al. Current advances on the phytochemical composition, pharmacologic effects, toxicology, and product development of Phyllanthi Fructus. Frontiers in Pharmacology. 13, 1017628(2022).
  9. Yang, F., et al. Chemical constituents from the fruits of Phyllanthus emblica L. Biochemical Systematics and Ecology. 92, 104122(2020).
  10. Wu, L., et al. Phytochemical analysis using UPLC-MSn combined with network pharmacology approaches to explore the biomarkers for the quality control of the anticancer tannin fraction of Phyllanthus emblica L. habitat in Nepal. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2021, 6623791(2021).
  11. Variya, B. C., Bakrania, A. K., Chen, Y., Han, J., Patel, S. S. Suppression of abdominal fat and anti-hyperlipidemic potential of Emblica officinalis: Upregulation of PPARs and identification of active moiety. Biomedicine & Pharmacotherapy. 108, 1274-1281 (2018).
  12. Gertsch, J. Botanical drugs, synergy, and network pharmacology: forth and back to intelligent mixtures. Planta Medica. 77 (11), 1086-1098 (2011).
  13. Nicholson, J. K., Wilson, I. D. Understanding 'global' systems biology: metabonomics and the continuum of metabolism. Nature Reviews Drug Discovery. 2 (8), 668-676 (2003).
  14. Li, T., et al. Integrated metabolomics and network pharmacology to reveal the mechanisms of hydroxysafflor yellow A against acute traumatic brain injury. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 1002-1013 (2021).
  15. Wang, F., et al. Network pharmacology combined with metabolomics to investigate the anti-hyperlipidemia mechanism of a novel combination. Journal of Functional Foods. 87, 104848(2021).
  16. Adams, J. M., Jafar-Nejad, H. Determining bile duct density in the mouse liver. Journal of Visualized Experiments. (146), e59587(2019).
  17. Wang, J. Y., et al. Use of viral entry assays and molecular docking analysis for the identification of antiviral candidates against coxsackievirus A16. Journal of Visualized Experiments. (149), e59920(2019).
  18. Wu, L. F., Liang, W. Y., Zhang, L. Z. Determination of main components of Tibetan medicine Phyllanthus emblica L. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica. 22 (8), 2857-2863 (2022).
  19. El-Hussainy, E. H. M., Hussein, A. M., Abdel-Aziz, A., El-Mehasseb, I. Effects of aluminum oxide (Al2O3) nanoparticles on ECG, myocardial inflammatory cytokines, redox state, and connexin 43 and lipid profile in rats: possible cardioprotective effect of gallic acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 94 (8), 868-878 (2016).
  20. Huang, W. Y., et al. Quercetin, hyper, and chlorogenic acid improve endothelial function by antioxidant, antiinflammatory, and ACE inhibitory effects. Journal of Food Science. 82 (5), 1239-1246 (2017).
  21. Lu, T. M., et al. Hypocholesterolemic efficacy of quercetin rich onion juice in healthy mild hypercholesterolemic adults: a pilot study. Plant Foods for Human Nutrition. 70 (4), 395-400 (2015).
  22. Witkowska, A. M., et al. Dietary plant sterols and phytosterol-enriched margarines and their relationship with cardiovascular disease among polish men and women: The WOBASZ II cross-sectional study. Nutrients. 14 (13), 2665(2022).
  23. Turini, E., et al. Efficacy of plant sterol-enriched food for primary prevention and treatment of hypercholesterolemia: a systematic literature review. Foods. 11 (6), 839(2022).
  24. Alamro, S. A., et al. Fermented camel milk enriched with plant sterols improves lipid profile and atherogenic index in rats fed high-fat and-cholesterol diets. Heliyon. , e10871(2022).
  25. Gao, P., Wen, X., Ou, Q., Zhang, J. Which one of LDL-C/HDL-C ratio and non-HDL-C can better predict the severity of coronary artery disease in STEMI patients. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 318(2022).
  26. Sun, T., et al. Predictive value of LDL/HDL ratio in coronary atherosclerotic heart disease. BMC Cardiovascular Disorders. 22 (1), 273(2022).
  27. Maegawa, K., et al. Dietary raffinose ameliorates hepatic lipid accumulation induced by cholic acid via modulation of enterohepatic bile acid circulation in rats. British Journal of Nutrition. 127 (11), 1621-1630 (2022).
  28. Antony, B., Merina, B., Sheeba, V. AmlamaxTM in the management of dyslipidemia in humans. Indian Journal of Pharmaceutical Sciences. 70 (4), 504(2008).
  29. Antony, B., Benny, M., Kaimal, T. N. B. A pilot clinical study to evaluate the effect of Emblica officinalis extract (Amlamax™) on markers of systemic inflammation and dyslipidemia. Indian Journal of Clinical Biochemistry. 23 (4), 378-381 (2008).
  30. Nambiar, S. S., Shetty, N. P. Phytochemical profiling and assessment of low-density lipoprotein oxidation, foam cell-preventing ability and antioxidant activity of commercial products of Emblica officinalis fruit. Journal of Food Biochemistry. 39 (3), 218-229 (2015).
  31. Gopa, B., Bhatt, J., Hemavathi, K. G. A comparative clinical study of hypolipidemic efficacy of Amla (Emblica officinalis) with 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme-A reductase inhibitor simvastatin. Indian Journal of Pharmacology. 44 (2), 238(2012).
  32. Jung, T. W., et al. Administration of kynurenic acid reduces hyperlipidemia-induced inflammation and insulin resistance in skeletal muscle and adipocytes. Molecular and Cellular Endocrinology. , 518(2020).
  33. Dong, Y., Li, X., Liu, Y., Gao, J., Tao, J. The molecular targets of taurine confer anti-hyperlipidemic effects. Life Sciences. 278, 119579(2021).
  34. Huang, B., Bao, J., Cao, Y. R., Gao, H. F., Jin, Y. Cytochrome P450 1A1 (CYP1A1) catalyzes lipid peroxidation of oleic acid-induced HepG2 cells. Biochemistry. 83 (5), 595-602 (2018).
  35. Xia, H., et al. Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice. Biomedicine & Pharmacotherapy. 118, 109287(2019).
  36. Dai, Z., et al. Protective effects of α-galacto-oligosaccharides against a high-fat/western-style diet-induced metabolic abnormalities in mice. Food & Function. 10 (6), 3660-3670 (2019).
  37. Wang, X., et al. Salidroside, a phenyl ethanol glycoside from Rhodiola crenulata, orchestrates hypoxic mitochondrial dynamics homeostasis by stimulating Sirt1/p53/Drp1 signaling. J Ethnopharmacol. 293, 115278(2022).
  38. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl(2)-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).
  39. Noor, F., et al. Network pharmacology approach for medicinal plants: review and assessment. Pharmaceuticals. 15 (5), 572(2022).
  40. Li, X., et al. Role of potential bioactive metabolites from traditional Chinese medicine for type 2 diabetes mellitus: An overview. Front Pharmacol. 13, 1023713(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Mechanisme van hyperlipidemievetrijk dieetplasmalipidengehaltesmoleculaire dockingtryptofaanmetabolismeeiwitinteractienetwerkdifferenti le metabolieten
Netwerk farmacologie voorspelling en metabolomics validatie van het mechanisme van fructus phyllanthi tegen hyperlipidemie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.