Hoge resolutie fluorrespirometrie van equine skeletspieren

Michael Scott Davis; Montana Renae Barrett

doi:10.3791/65075

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hoge resolutie fluorrespirometrie van equine skeletspieren

1.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65075

⸱

3 februari 2023

Michael Scott Davis¹ , Montana Renae Barrett¹

¹Department of Physiological Sciences, Oklahoma State University

In dit artikel

Samenvatting

Paarden hebben een uitzonderlijke aërobe inspanningscapaciteit, waardoor paardenskeletspieren een belangrijk weefsel zijn voor zowel de studie van paardeninspanningsfysiologie als de mitochondriale fysiologie van zoogdieren. Dit artikel beschrijft technieken voor de uitgebreide beoordeling van de mitochondriale functie in de skeletspieren van paarden.

Samenvatting

Mitochondriale functie - oxidatieve fosforylering en het genereren van reactieve zuurstofsoorten - is van cruciaal belang voor zowel gezondheid als ziekte. Het meten van de mitochondriale functie is dus fundamenteel in biomedisch onderzoek. Skeletspieren zijn een robuuste bron van mitochondriën, vooral bij dieren met een zeer hoge aerobe capaciteit, zoals paarden, waardoor ze ideale onderwerpen zijn voor het bestuderen van mitochondriale fysiologie. Dit artikel demonstreert het gebruik van hoge-resolutie respirometrie met gelijktijdige fluorometrie, met vers geoogste skeletspier mitochondriën, om het vermogen om substraten te oxideren onder verschillende mitochondriale toestanden te kwantificeren en de relatieve capaciteiten van verschillende elementen van mitochondriale ademhaling te bepalen. Tetramethylrhodaminemethylester wordt gebruikt om de productie van mitochondriaal membraanpotentiaal als gevolg van substraatoxidatie aan te tonen, inclusief berekening van de relatieve efficiëntie van de mitochondriën door het relatieve membraanpotentiaal gegenereerd per eenheid gelijktijdige zuurstofflux te berekenen. De omzetting van ADP naar ATP resulteert in een verandering in de concentratie van magnesium in de reactiekamer, als gevolg van verschillende affiniteiten van de adenylaten voor magnesium. Daarom kan magnesiumgroen worden gebruikt om de snelheid van ATP-synthese te meten, waardoor de oxidatieve fosforyleringsefficiëntie (verhouding van fosforylering tot oxidatie [P / O]) verder kan worden berekend. Ten slotte maakt het gebruik van Amplex UltraRed, dat een fluorescerend product (resorufin) produceert in combinatie met waterstofperoxide, de kwantificering mogelijk van de productie van reactieve zuurstofsoorten tijdens mitochondriale ademhaling, evenals de relatie tussen ROS-productie en gelijktijdige ademhaling. Deze technieken maken de robuuste kwantificering van mitochondriale fysiologie onder een verscheidenheid aan verschillende gesimuleerde omstandigheden mogelijk, waardoor licht wordt geworpen op de bijdrage van deze kritieke cellulaire component aan zowel gezondheid als ziekte.

Inleiding

De mitochondriën van eukaryote cellen produceren het grootste deel van de ATP die door de cellen wordt gebruikt voor werk en onderhoud¹. Een belangrijke stap in de mitochondriale productie van ATP is de omzetting van zuurstof in water, en dus wordt de metabolische capaciteit van mitochondriën en de bijbehorende cellen vaak gekwantificeerd door de meting van het zuurstofverbruik². Mitochondriale fysiologie is echter complexer dan het eenvoudige proces van zuurstofverbruik, en vertrouwen op dit eindpunt biedt uitsluitend een onvolledige beoordeling van de impact van mitochondriale functie en disfunctie op cellulaire gezond....