Een geschikt diermodel is nodig om de pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan aortaklepstenose (AVS) te begrijpen en om de werkzaamheid van therapeutische interventies te evalueren. Dit protocol beschrijft een nieuwe procedure voor de ontwikkeling van het AVS-konijnenmodel via een directe ballonverwonding in vivo.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een konijnen aortaklepstenosemodel geïnduceerd door direct ballonletsel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Diermodellen zijn in opkomst als een belangrijk hulpmiddel om de pathologische mechanismen te begrijpen die ten grondslag liggen aan aortaklepstenose (AVS) vanwege het gebrek aan toegang tot betrouwbare bronnen van zieke menselijke aortakleppen. Van de verschillende diermodellen zijn AVS-konijnenmodellen een van de meest gebruikte in grote dierstudies. Traditionele AVS-konijnenmodellen vereisen echter een langdurige periode van voedingssuppletie en genetische manipulatie om significante stenose in de aortaklep te induceren, waardoor het gebruik ervan in experimentele studies wordt beperkt. Om deze beperkingen aan te pakken, wordt een nieuw AVS-konijnenmodel voorgesteld, waarbij stenose wordt geïnduceerd door een directe ballonverwonding aan de aortaklep. Dit protocol beschrijft een succesvolle techniek voor het induceren van AVS bij Nieuw-Zeelandse witte (NZW) konijnen, met stapsgewijze procedures voor de voorbereiding, de chirurgische ingreep en de postoperatieve zorg. Dit eenvoudige en reproduceerbare model biedt een veelbelovende benadering voor het bestuderen van de initiatie en progressie van AVS en biedt een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van de onderliggende pathologische mechanismen van de ziekte.
Inleiding
Het wordt steeds meer erkend dat het gebruik van geschikte diermodellen kan bijdragen aan een beter begrip van de pathologische mechanismen die ten grondslag liggen aan aortaklepstenose (AVS) vanwege het gebrek aan toegang tot betrouwbare bronnen van zieke menselijke aortakleppen die verband houden met de progressie van aortastenose (AS). Van de verschillende diermodellen voor het bestuderen van AVS zijn konijnen een van de meest gebruikte AVS-modellen voor grote dieren, en het AVS-konijnenmodel wordt geïnduceerd door cholesterol/vitamine D2-suppletie of genetische manipulatie 1,2,3,4.
Hoewel AVS-modellen bij konijnen veel inzicht hebben gegeven in de ontwikkeling en progressie van AVS, blijft het nog steeds een uitdaging om AVS consistent en reproduceerbaar te induceren, zoals te zien is in onze voorlopige experimenten.
Naast door voeding geïnduceerde en genetisch gevoelige diermodellen, is een nieuw model van AVS vastgesteld door direct mechanisch letsel bij muizen 5,6. Het mechanische verwondingsmodel induceert met succes aortastenose en vertegenwoordigt een eenvoudig en reproduceerbaar AVS-model bij wildtype muizen. Voor zover wij weten, zijn er geen eerdere studies geweest die de effecten van een mechanisch letsel op de aortaklep in konijnenmodellen onderzochten. Deze studie biedt dus een nieuwe procedure voor het induceren van AVS bij mannelijke witte konijnen in Nieuw-Zeeland door middel van een directe ballonverwonding aan de aortaklep, die de toestand van klepvormige aortastenose nauwkeurig kan nabootsen. Dit protocol bevat stapsgewijze beschrijvingen van de voorbereiding, de chirurgische ingreep en de postoperatieve zorg, die nuttig zijn voor het induceren van reproduceerbare AVS-konijnenmodellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures voor dierproeven zijn goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de Laboratory Animals Welfare Act, de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en de Guidelines and Policies for Animal Experiments van de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het College of Medicine van de Katholieke Universiteit van Korea (goedkeuringsnummer: CUMC-2021-0176-05). De huidige studie maakte gebruik van 3 maanden oude mannelijke Nieuw-Zeelandse witte (NZW) konijnen met een gewicht van 3,5-4,0 kg, die onder standaardomstandigheden in individuele kooien werden gehouden. De konijnen kregen ofwel een normaal dieet ofwel een 0,5% cholesterolverrijkt dieet aangevuld met 50.000 U vitamine D2 (zie Materiaaltabel). De experimentele opzet en analysemethoden voor de inductie van het AVS-konijnenmodel zijn weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding op de operatie
- Zorg ervoor dat alle medische en chirurgische instrumenten (zie Materiaaltabel) aan het begin van de operatie zijn gesteriliseerd.
- Bereid de dilatatieballonkatheterset voor volgens de onderstaande stappen.
- Sluit het in-deflatieapparaat gevuld met een mengsel van zoutoplossing en in de handel verkrijgbaar contrastmiddel (1:1) aan op het luer lock-gedeelte van de ballonkatheter (zie Materiaaltabel).
- Vul de ballon met opblaasoplossing en verwijder alle lucht uit de ballonkatheter.
OPMERKING: Voor de huidige studie bestond de opblaasoplossing uit 30% jodixanol met 0,9% zoutoplossing (zie materiaaltabel). - Controleer of de ballon goed wordt opgeblazen door het ballonlumen te spoelen met de opblaasoplossing.
2. Chirurgische ingreep voor het letsel aan de aortaklep
- Dien een intramusculaire injectie toe van tiletamine en zolazepam (15 mg/kg) en xylazine (5 mg/kg) (zie materiaaltabel) om het dier te verdoven.
OPMERKING: Vóór het toedienen van de anesthesie werden de konijnen voorbehandeld met een subcutane glycopyrrolaatinjectie (0,05 mg/kg) als een pre-anesthetisch anticholinerge middel. Het adequate anesthesieniveau werd bepaald door een combinatie van criteria, waaronder een gebrek aan respons op een teenknijp en een constante ademhalingsfrequentie. - Breng een intraveneuze (IV) katheter van 24 G in de marginale auriculaire ader in en sluit een infusieset aan met gehepariniseerde zoutoplossing (100 E/kg heparine).
- Sluit het konijn aan op een veterinaire monitor met meerdere parameters (zie Materiaaltabel) om continu de vitale functies te bewaken, zoals het zuurstofverzadigingssignaal (SpO2), temperatuur en bloeddruk.
NOTITIE: Voor de SpO 2-bewaking bevestigt u de SpO2-sensor aan de tong van het konijn. Voor de temperatuurbewaking steekt u de sonde in het rectum van het konijn. Voor de bloeddrukmeting plaatst u de manchet om de voorpoot. - Plaats het konijn in rugligging op een operatietafel die is uitgerust met een C-boogfluoroscopie (zie Materiaaltabel) en verwijder het haar uit het ventrale nekgebied met een tondeuse van dierenhaar (Figuur 2A).
- Steriliseer het incisiegebied met jodium en bedek het konijn met chirurgische handdoeken.
- Plaats het hart van het konijn in het midden van de afbeelding van de C-boog.
OPMERKING: Alle onderzoekers moeten beschermende kleding dragen met bevestigde thermoluminescente dosimeters (TLD's) om de blootstelling aan straling te verminderen tijdens het uitvoeren van de C-booggeleide operatie.- Schakel de C-boog in en selecteer de fluoroscopische modus voor cardiale beeldvorming.
- Pas de positie van het konijn aan om ervoor te zorgen dat het hart zich in het midden van het beeldvormingsveld bevindt.
- Maak een longitudinale incisie van ongeveer 3 cm in de huid van de nek en gebruik een chirurgische schaar om de fascia en het vetweefsel te knippen.
- Leg de linker gemeenschappelijke halsslagader (LCCA) bloot door de spieren voorzichtig te scheiden totdat ongeveer 3-3,5 cm van de LCCA bloot ligt (Figuur 2B).
- Maak de LCCA vast met een 3-0 zijden hechting (zie Tabel met materialen) aan de boven- en achterkant van de blootgestelde LCCA om de bloedstroom te stoppen.
- Breng een 22 G IV-katheter in de LCCA in en breng een voerdraad (0.016 inch, zie Materiaaltabel) in de linker hartkamer (LV) via de IV-katheter, en zorg ervoor dat de punt van de katheter goed in het beeldvormingsveld van de C-boog is geplaatst.
NOTITIE: Wanneer u de infuuskatheter inbrengt, maakt u de ligatuurhechting voorzichtig los op weg naar beneden naar de aortaklep om de katheter vooruit te kunnen bewegen. - Trek de IV-katheter terug, laat de voerdraad achter en plaats een 4-F-huls (zie Materiaaltabel) over de voerdraad in de LCCA om de ballonkatheter in te brengen (Figuur 2C).
NOTITIE: Na het vervangen van de infuuskatheter door de huls, moet alle ingesloten lucht uit het omhulsel worden verwijderd. - Steek de ballonkatheter van 8 mm voorzichtig over de voerdraad in de aortaklep onder fluoroscopische geleiding van de C-boog (Figuur 2D).
- Plaats de tip van de ballonkatheter ongeveer 1-2 cm distaal van de aortaklep en blaas de ballon op door de opblaasoplossing te spoelen met een drukinflator van 6 atm.
- Schuif de ballon in de LV-apex en trek hem terug in de LV-uitlaat. Herhaal deze procedure vijf keer en laat de ballon vervolgens leeglopen (Figuur 2E, F).
- Herhaal stap 2.8-2.9 drie keer om ervoor te zorgen dat de klep voldoende letsel oploopt.
- Trek de ballonkatheter en voerdraad terug. Verwijder langzaam de huls van de LCCA en bind de LCCA onmiddellijk vast met de hechting op weg naar beneden naar de aortaklep.
- Reinig het incisiegebied met zoutoplossing om de bloedstolsels te verwijderen en inspecteer de doorboorde plaats op arteriële bloedingen.
- Sluit de spier en huid met een 3-0 niet-resorbeerbare hechting en steriliseer alle zijden van de wond met jodium.
3. Postoperatieve zorg
- Verwijder de bewakingspleisters en clips en bewaar het konijn in een intensive care-couveuse.
OPMERKING: Na de operatie werden de konijnen gedurende 1 dag nauwlettend geobserveerd in een intensive care-couveuse en vervolgens verplaatst naar een thuiskooi. - Behandel postoperatieve pijn met 5 mg/kg tramadol en 3 mg/kg ketoprofen en dien antibiotica (4 mg/kg gentamicine) tweemaal daags toe gedurende 3 dagen via subcutane injectie (zie materiaaltabel).
OPMERKING: Postoperatieve pijnbestrijding moet voldoen aan de veterinaire en IACUC-richtlijnen (bijv. opioïde, NSAID, lokale verdoving of combinatie). - Voer gedurende 8 weken een met 0,5% cholesterol verrijkt dieet met 50.000 E vitamine D2 (HC + VitD2).
4. Echocardiografie
- Na 8 weken ballonverwonding, verdooft u het konijn volgens dezelfde procedure als beschreven in stap 2.1.
- Visualiseer de aortakleppen met behulp van tweedimensionale transthoracale weergaven en neem M-modusbeelden op in korte- en lange-asweergaven.
- Leg het konijn in rugligging op een echotafel.
- Scheer de borst met een tondeuse en ontharingscrème.
- Breng ultrasone transducergel (zie Materiaaltabel) aan op de borst.
- Pas de transducer aan om het parasternale lange asbeeld en het parasternale korte-asbeeld van de aortaklep te verkrijgen.
- Gebruik beeldvorming in M-modus om beelden van de aortaklep op te nemen in zowel lange- als korte-asweergaven en sla de beelden op voor latere analyse.
5. Histologische analyse
- Na de echocardiografie euthanaseert u het konijn door een intraveneuze injectie met kaliumchloride (KCl, 3 g/20 ml, 1 ml) toe te dienen.
- Open de borstholte, oogst het hart met de aorta 7 ascendens en plaats het op ijs in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Dompel het hart onmiddellijk onder in een 4% paraformaldehyde (PFA)-oplossing en plaats het in een paraffineblok (zie Materiaaltabel).
- Snijd het in paraffine ingebedde hartblok met behulp van een microtoom in secties van 4 μm dik en kleur de secties met Masson's trichroom (MT), Alizarin Red en von Kossa (zie Tabel met materialen) om de collageenafzetting en klepverkalking te beoordelen, respectievelijk 8,9.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Konijn AVS-model geïnduceerd door aortaklepletsel
Om het AVS-model van het konijn te induceren, werden mannelijke NZW-konijnen met een gewicht van 3,5-4,0 kg gebruikt voor dit onderzoek. Volgens de chirurgische ingrepen beschreven in stap 2 (Figuur 2) werd het AVS-model tot stand gebracht door aortaklepletsel, wat resulteerde in mechanische aortaklepdegeneratie en verkalking. De controlegroep omvatte konijnen die werden gevoed met een 0,5% cholesterolverrijkt dieet (hoog ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dierlijke AVS-modellen worden vaak gebruikt om de pathologische aspecten van AVS te bestuderen, inclusief de initiatie en progressie van AVS. Dit protocol introduceert een nieuw AVS-model voor konijnen dat wordt geïnduceerd door een directe ballonverwonding aan de aortaklep. In deze studie vertoonde het aortaklepletselmodel een significante verdikking en verkalking van de blaadjes. Vergeleken met het milde AVS-model geïnduceerd door voedingssupplementen, was de aortaklep in het model met directe ballonbeschadiging select...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben met dit werk geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Research Foundation of Korea (NRF), gefinancierd door de Koreaanse regering (MSIT) (nr. 2020R1A4A3079570), het ministerie van Onderwijs (nr. 2021R1I1A1A01051425) en het Industrial Strategic Technology Development Program (nr. 20014873), gefinancierd door het ministerie van Handel, Industrie en Energie, Republiek Korea.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-0 Silk suture | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehyde(PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin red Solution | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | ASAHI | Guide wire | |
| Back Table Cover | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Balloon In-deflation Device | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinary monitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet | Purina | 5322 | 4.7% Hydrogenated Coconut Oil, 0.5% Cholesterol, & 1% Molasse |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 | Intensive Care Unit (ICU) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 |
| Fechtner conjunctiva forceps titanium | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Forceps | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolate | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normal saline 500 mL | |
| Hematoxylin solution | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmaceutical | 25,000 U | |
| Infusion set for single use | SWOON MEDICAL | ||
| Iodine | Green pharmaceutical | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Inflation solution (contrast agent) |
| IV catheter 22 G | BD | 382423 | |
| IV catheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok syringe 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok syringe 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Microscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Microtome | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT stain kit | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Needel holder | Solco | 009-1304 | |
| Needle Holder with Lock and Suture | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Potassium chloride 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophilic Sheath | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Sheath 4F |
| PTA Balloon Dilatation catheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Balloon catheter 8.0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxine | |
| sterile Gauze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Surgical Gloves | Ansell | Ansell | |
| Surgical Gown | Yuhan kimberly | 90002-02 | |
| Surgical Scissors | Nopa, Germany | AC020/16 | |
| Surgical Tape | 3M micopore | 1530-1 | |
| Syringe 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Syringe 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Tissue cassette | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transducer gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultrasound system | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa stain kit | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
Referenties
- Aliev, G., Burnstock, G. Watanabe rabbits with heritable hypercholesterolaemia: A model of atherosclerosis. Histology and Histopathology. 13 (3), 797-817 (1998).
- Cimini, M., Boughner, D. R., Ronald, J. A., Aldington, L., Rogers, K. A. Development of aortic valve sclerosis in a rabbit model of atherosclerosis: An immunohistochemical and histological study. Journal of Heart Valve Disease. 14 (3), 365-375 (2005).
- Drolet, M. C., Couet, J., Arsenault, M. Development of aortic valve sclerosis or stenosis in rabbits: role of cholesterol and calcium. Journal of Heart Valve Disease. 17 (4), 381-387 (2008).
- Sider, K. L., Blaser, M. C., Simmons, C. A. Animal models of calcific aortic valve disease. International Journal of Inflammation. 2011, 364310(2011).
- Honda, S., et al. A novel mouse model of aortic valve stenosis induced by direct wire injury. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (2), 270-278 (2014).
- Niepmann, S. T., et al. Graded murine wire-induced aortic valve stenosis model mimics human functional and morphological disease phenotype. Clinical Research in Cardiology. 108 (8), 847-856 (2019).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; A versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).
- Wirrig, E. E., Gomez, M. V., Hinton, R. B., Yutzey, K. E. COX2 inhibition reduces aortic valve calcification in vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 35 (4), 938-947 (2015).
- Jung, S. H., et al. Spatiotemporal dynamics of macrophage heterogeneity and a potential function of Trem2(hi) macrophages in infarcted hearts. Nature Communications. 13 (1), 4580(2022).
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: Pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111 (24), 3316-3326 (2005).
- Lindman, B. R., et al. Calcific aortic stenosis. Nature Reviews Disease Primers. 2, 16006(2016).
- Cuniberti, L. A., et al. Development of mild aortic valve stenosis in a rabbit model of hypertension. Journal of the American College of Cardiology. 47 (11), 2303-2309 (2006).
- Marechaux, S., et al. Identification of tissue factor in experimental aortic valve sclerosis. Cardiovascular Pathology. 18 (2), 67-76 (2009).
- Hara, T., et al. Progression of calcific aortic valve sclerosis in WHHLMI rabbits. Atherosclerosis. 273, 8-14 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
