Kwantificering van globale histon posttranslationele modificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen

Summary

Dit werk beschrijft een protocol voor de kwantificering van globale histonmodificaties met behulp van intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde hersenmicroglia. Het werk bevat ook het microglia-isolatieprotocol dat werd gebruikt voor het verzamelen van gegevens.

Abstract

Controle van genexpressie vindt gedeeltelijk plaats door modificaties in de chromatinestructuur, waaronder het toevoegen en verwijderen van posttranslationele modificaties aan histonstaarten. Histon posttranslationele modificaties (HPTM's) kunnen genexpressie of onderdrukking vergemakkelijken. Acetylering van histonstaartlysineresiduen neutraliseert bijvoorbeeld de positieve lading en vermindert interacties tussen de staart en negatief geladen DNA. De afname van histon-staart-DNA-interacties resulteert in een verhoogde toegankelijkheid van het onderliggende DNA, waardoor een betere toegang tot transcriptiefactoren mogelijk is. Het acetyleringsmerk dient ook als herkenningsplaats voor broomdomein-bevattende transcriptionele activatoren, wat samen resulteert in verbeterde genexpressie. Histon-markeringen kunnen dynamisch worden gereguleerd tijdens celdifferentiatie en als reactie op verschillende cellulaire omgevingen en stimuli. Hoewel sequencing-benaderingen van de volgende generatie zijn begonnen met het karakteriseren van genomische locaties voor individuele histonmodificaties, kan slechts één modificatie tegelijkertijd worden onderzocht. Gezien het feit dat er honderden verschillende HPTM's zijn, hebben we een kwantitatieve meting met hoge doorvoer van wereldwijde HPTM's ontwikkeld die kan worden gebruikt om histonmodificaties te screenen voordat uitgebreidere genoomsequencingbenaderingen worden uitgevoerd. Dit protocol beschrijft een op flowcytometrie gebaseerde methode om globale HPTM's te detecteren en kan worden uitgevoerd met behulp van cellen in kweek of geïsoleerde cellen uit in vivo weefsels. We presenteren voorbeeldgegevens van geïsoleerde microglia in de hersenen van muizen om de gevoeligheid van de test aan te tonen om globale verschuivingen in HPTM's te detecteren als reactie op een van bacteriën afgeleide immuunstimulus (lipopolysaccharide). Dit protocol maakt de snelle en kwantitatieve beoordeling van HPTM's mogelijk en kan worden toegepast op elke transcriptionele of epigenetische regulator die door een antilichaam kan worden gedetecteerd.

Introduction

Epigenetica is de studie van de mechanismen die genexpressie reguleren zonder de onderliggende DNA-sequentie te veranderen. Epigenetische regulatie van genexpressie is dynamisch binnen cellen en kan snelle en gecoördineerde reacties op verschillende omgevingsstimuli mogelijk maken. De dynamische regulatie vindt gedeeltelijk plaats als gevolg van veranderingen in de chromatinestructuur op het niveau van het nucleosoom, dat bestaat uit histon-eiwitten (H2A, H2B, H3, H4) die zijn samengevoegd tot een octameerkern die strak is gewikkeld door DNA¹. De interacties tussen de histon-eiwitten en het DNA kunnen de toegankelijkheid van DNA tot transcriptiemachines regelen, wat uiteindelijk de genexpressie en andere aspecten van de chromatinebiologie kan beheersen^. Histon-eiwitten hebben ongestructureerde staarten met positief geladen residuen die elektrostatische interacties vormen met de negatief geladen DNA-ruggengraat. Deze interacties resulteren in een strakke opeenhoping van het DNA en verminderde toegankelijkheid van het DNA. Covalente modificaties aan de histonstaarten, histonposttranslationele modificaties (HPTM's) genoemd, kunnen deze interacties reguleren ^3,4. Enkele van de meest goed gekarakteriseerde HPTM's zijn histonstaartacetylering en methylering, die de affiniteit van elektrostatische interacties tussen de histonstaarten en DNA kunnen veranderen, wat resulteert in differentiële toegankelijkheid van het onderliggende DNA en rekrutering van transcriptiefactoren die deze HPTM's op specifieke plaatsen herkennen. HPTM's worden gereguleerd door drie belangrijke klassen enzymen, lezers genaamd, die herkennen, schrijvers die deponeren en gummen, die HPTM's verwijderen. Zo kan de rekrutering of ontbinding van lezer-, schrijvers- of gumenzymen uiteindelijk het landschap van HPTM's veranderen en de structuur en functie van chromatine regelen, waardoor hun regulatie en uitlezing essentieel zijn voor het begrijpen van cellulaire biologie en functie ^3,4.

De cellen in het centrale zenuwstelsel (CZS) zijn epigenetisch flexibel omdat ze hun transcriptoom veranderen om zich aan te passen aan omgevingsstimuli. Steeds meer bewijs suggereert dat veranderingen in het epigenoom, zoals DNA-methylering, niet-coderende RNA's en HPTM's, een essentiële rol spelen bij geheugenvorming en synaptische^functie. Het verstoren van de HPTM-dynamiek door manipulatie van de relevante lezers, schrijvers of gummen kan associatief leren en potentiëring op lange termijn blokkeren of verbeteren ^6,7,8. Microglia, de residente immuuncel van het CZS, reguleren snel hun transcriptoom als reactie op immuunstimulatie door dynamische veranderingen in hun epigenoom ^9,10,11. Deze hoge mate van aanpassing aan hun lokale hersenomgeving maakt ze moeilijk te onderzoeken in een geïsoleerde context, aangezien studies hebben aangetoond dat het epigenoom en transcriptoom van microglia al na een paar uur in kweekmedia veranderen na verwijdering uit de hersenomgeving¹¹. Bovendien, aangezien microglia slechts 10% van de hersencellen uitmaken, missen metingen die veranderingen op het niveau van het hele weefsel onderzoeken gevoeligheid en specificiteit ^12,13. Als gevolg hiervan moeten microglia snel worden geïsoleerd om de epigenetische veranderingen zoals HPTM-niveaus ex vivo te onderzoeken.

De methoden die vaak worden gebruikt om HPTM's te onderzoeken, zijn onder meer chromatine-immunoprecipitatiesequencing (ChIP-seq) en splitsing onder doelen en tagmentatiesequencing (CUT&Tag-seq)⁴. Hoewel deze technieken zeer specifiek zijn voor een individuele HPTM en de aanwezigheid van HPTM's binnen een specifieke genomische context kunnen informeren, kunnen ze slechts één van de vele mogelijke HPTM's binnen een enkel experiment onderzoeken^11,14 Daarom is het, alvorens verder te gaan met dergelijke experimenten, die een aanzienlijke investering in tijd en geld vergen, zeer waardevol om de lijst met potentieel interessante HPTM's voor verder onderzoek te verfijnen door eerst veranderingen in de wereldwijde wereld te onderzoeken niveaus van HPTM's. De twee belangrijkste benaderingen voor het onderzoeken van globale HPTM-niveaus zijn immunohistochemie en western blot-analyse, maar beide benaderingen zijn slechts semi-kwantitatief, hebben een lage doorvoer en vereisen grote aantallen weefselsecties of geïsoleerde cellen^15,16. Daarom wilden we een zeer gevoelige, kwantitatieve methode ontwikkelen die kan worden gebruikt om de globale HPTM-niveaus snel en op celniveau te onderzoeken.

Het gepresenteerde protocol maakt het mogelijk om globale HPTM-niveaus snel te detecteren met behulp van intranucleaire flowcytometrie. Eerdere studies in kankercellen hebben het belang gerechtvaardigd van het onderzoeken van wereldwijde niveaus vanuit een klinisch perspectief^17,18. Het is ook gebruikelijk dat studies wereldwijde niveaus gebruiken als screeningsmethode voordat de genomische locatie van specifieke HPTM's van belang wordt beoordeeld^19,20. Voor microglia is het beoordelen van globale niveaus na isolatie een uitdaging vanwege de lage celopbrengst; Pan et al. presenteren globale HPTM-niveaus van geïsoleerde microglia, waarin microglia van drie dieren werden samengevoegd om detectie van eiwitniveaus door western blot¹⁹ mogelijk te maken. Met behulp van ons protocol zijn we in staat om globale veranderingen te detecteren met veel lagere celinputs, waardoor meerdere markeringen per dier kunnen worden gescreend en het niet meer nodig is om monsters samen te voegen.

Hier beschrijven we een protocol om HPTM-niveaus snel te detecteren via kwantitatieve intranucleaire flowcytometrie in geïsoleerde microglia. Hoewel we ons kortheidshalve specifiek richten op HPTM-kwantificering, kan dit protocol op dezelfde manier worden gebruikt om wereldwijde niveaus van lezer-, schrijvers- en gumenzymen te kwantificeren. Het protocol bestaat uit twee delen: ten eerste de isolatiemethode voor microglia en ten tweede de op flowcytometrie gebaseerde methode voor het bepalen van HPTM-niveaus. De isolatiemethode levert cellen op die kunnen worden gebruikt voor zowel RNA-isolatie als HPTM-niveaubeoordeling, waardoor genexpressie en HPTM-niveaus van hetzelfde monster kunnen worden geëvalueerd. Bovendien kan de methode voor HPTM-beoordeling worden gebruikt op andere celtypen zoals aangegeven in het protocol.

Protocol

Alle protocollen voor dierenverzorging zijn goedgekeurd door het Animal Care Committee van de University of British Columbia in overeenstemming met de richtlijnen van de Canadian Council on Animal Care.

1. Hersenvertering voor microglia-isolatie

Figuur 1: Eenvoudig stroomschema van het protocol. De muizen worden eerst transcardieel geperfundeerd met HBSS en de hersenen worden ontleed. De hersenen worden vervolgens gedissocieerd door chemische vertering en mechanische verstoring om te resulteren in een homogenaat van één cel. De immuunverrijkte fractie wordt verzameld via discontinue dichtheidsgradiënt, waarna de cellen worden gekleurd voor P2RY12. Gekleurde cellen worden ofwel 1) gesorteerd via fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS) om te leiden tot RNA-analyse of stroomafwaartse eiwitanalyse en/of 2) gefixeerd, gepermeabiliseerd en gekleurd voor intranucleaire eiwitten. Het eiwitniveau wordt gekwantificeerd door de mediane fluorescentie-intensiteit in het kanaal van belang, bepaald door flowcytometrie. Blauw gekleurde vakjes maken deel uit van protocolstap 1) Hersenvertering voor microglia-isolatie. Rood gekleurde vakjes maken deel uit van protocolstap 2) Intranucleaire stroomkleuring voor eiwitexpressieanalyse. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Bereiding van reagentia
   OPMERKING: Als u een extractie plant om zowel RNA als cellen te verzamelen voor HPTM-analyse, raadpleeg dan rubriek 1.7.1 voor wijzigingen om transcriptie- en translatieremmers op te nemen. Dit is echter niet vereist als alleen het eiwitsignaal wordt beoordeeld, aangezien de cellen grotendeels in rust zijn wanneer ze op ijs worden bewaard.
   1. Fluorescentie-geactiveerde celsorteringsbuffer (FACS) (20 ml per monster): Los runderserumalbumine (BSA) op in 1x Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) om een 2% BSA-oplossing te creëren. Los EDTA op tot een eindconcentratie van 1 mM in de 2% BSA-oplossing. Filter steriliseer met een filter van 0,2 μm en bewaar bij 4 °C gedurende maximaal 1 week voor gebruik.
   2. Digestiebuffer (1 ml per monster): Reconstitueer een injectieflacon papaïne in HBSS tot een eindconcentratie van 20 E/ml in 1 mM L-cysteïne met 0,5 mM EDTA. Activeer bij 37 °C gedurende minimaal 10 minuten of totdat het weefsel klaar is om te verteren. Voeg vlak voor gebruik DNase I toe aan de geactiveerde papaïneoplossing tot een eindconcentratie van 200 E/ml. Bereid dit voor op de dag van het experiment en bewaar het niet.
   3. Isotone dichtheidsgradiëntoplossing (5,5 ml per monster): Voeg 10x HBSS toe aan koud dichtheidsgradiëntmedium tot een eindconcentratie van 1x HBSS, wat resulteert in een einddichtheid van 1,117 g/ml. Vortex minimaal 30 seconden mengen voor gebruik. Leg op ijs tot gebruik.
   4. 37% dichtheidsgradiëntoplossing (4 ml per monster): Voeg isotone dichtheidsgradiënt toe aan 1x HBSS om een eindconcentratie van 37% te maken met een einddichtheid van 1,043 g/ml. Voeg 20 μL fenolrood toe voor elke ml met een dichtheidsgradiënt van 37% om een roze oplossing te maken voor visualisatie tijdens het aanbrengen van lagen. Vortex minimaal 30 seconden voor gebruik. Leg op ijs tot gebruik.
   5. 70% dichtheidsgradiëntoplossing (2 ml per monster): Voeg isotone dichtheidsgradiënt toe aan 1x HBSS om een eindconcentratie van 70% te maken met een einddichtheid van 1,082 g/ml. Voeg 5 μL trypanblauw toe voor elke ml medium met een dichtheid van 70% om een blauwe oplossing te maken voor visualisatie tijdens het aanbrengen van lagen. Vortex minimaal 30 seconden voor gebruik. Leg op ijs tot gebruik.
2. Perfusie en hersendissectie
   OPMERKING: Het perfusieprotocol is vergelijkbaar met Posel et al. met videoweergave van thoracotomie van muizen, transcardiale perfusie en hersenverwijdering²¹. Hier gebruiken we volwassen C57BL/6J mannelijke en vrouwelijke muizen (10-15 weken oud, 20-30 g), maar dit protocol kan worden gebruikt om een thoracotomie uit te voeren voor elke muis. Alle dierproeven moeten worden goedgekeurd door de ethische commissie van de instelling voordat experimenten worden uitgevoerd.
   1. Muisanesthesie: Verdoof muizen met 4% isofluraan in 100% zuurstof tot voorbij het vlak van chirurgische anesthesie, wat kan worden bevestigd met een teenknijp of een gebrek aan reflex bij het stevig knijpen in de voet van de muis. Plaats de muis op zijn rug en speld zijn vier poten stevig vast in het chirurgische dissectiebord dat gekanteld in een plastic bakje is geplaatst, zodat de neus vastzit in de isofluorane neuskegel. Zorg er na de overdracht voor dat het dier nog steeds voorbij het chirurgische anesthesievlak is voordat u verder gaat.
   2. Muis thoracotamie: Pak de buikhuid vast en til deze op met een pincet en maak een ondiepe incisie door de huid en buikwand om de xyphoid bloot te leggen zonder de dalende aorta of onderliggende organen te beschadigen.
   3. Pak de xyphoid vast met een tang en maak laterale incisies onder de ribbenkast om het middenrif en de lever bloot te leggen. Maak voorzichtige ondiepe sneden door het middenrif over de lengte van de ribbenkast met een fijne schaar en door de ribbenkast met een weefselschaar en speld het borstbeen vast aan het operatiestation in de buurt van de kop van de muis om het hart en de longen bloot te leggen voor transcardiale perfusie.
   4. Transcardiale perfusie: Bereid een peristaltische perfusiepomp voor en bevestig een naald van 26.5 G aan het ene uiteinde van de slang. Bereid de slang voor op de procedure door het ene uiteinde van de slang in een injectieflacon met koude 1x HBSS te steken en de pomp in te schakelen om de slang volledig te vullen met 1x HBSS.
   5. Terwijl u het hart met een stompe tang vasthoudt, steekt u de punt van een naald van 26.5 G met de bijgevoegde perfusieslang in de linker hartkamer van het hart en maakt u een kleine incisie in het rechter atrium. Zet de perfusiepomp aan om de muis voorzichtig te doordrenken met een snelheid van ~2-4 ml/min met minimaal 15-20 ml koude 1x HBSS.
      OPMERKING: Een volledige perfusie is vaak geïndiceerd wanneer de lever bloed begint te zuiveren en dezelfde kleur krijgt als het hart.
   6. Hersenverwijdering: Onthoofd de muis met een weefselontleedschaar en maak een incisie in de middellijn in de hoofdhuid van nek tot neus. Trek de huidflappen naar de zijkanten om de schedel bloot te leggen en verwijder overtollig weefsel en botten aan het staartuiteinde van de schedel met een ontleedschaar.
   7. Schuif voorzichtig een blad van de schaar onder de schedel in het foramen magnum met de scherpe kant naar het bot gericht en knip voorzichtig de middellijn naar de neus toe. Maak zijwaartse sneden aan zowel de basis van de schedel als bij de neus met behulp van een ontleedschaar. Gebruik een fijne pincet om de schedel van de middellijn naar de buitenkant te leven om de schedelstukken af te breken en de hersenen bloot te leggen. Til de hersenen voorzichtig op met een spatel en plaats ze op dissectiepapier.
   8. Hersendissectie: Plaats de hersenen op een stuk dissectiepapier bevochtigd met 1x HBSS bovenop een gesloten petrischaal gevuld met ijs. Verwijder het cerebellum en snijd de hersenhelften in tweeën met een schoon scheermesje.
   9. Verwijder de hersenstam, het striatum en de witte stof van elk halfrond, terwijl de hippocampus en de overlappende cortex intact blijven. Breng de hemisferen met geïsoleerde cortex en hippocampusweefsel over in een buis van 15 ml met 5 ml koude 1x HBSS en bewaar op ijs.
      OPMERKING: Het is belangrijk om de dissecties zo snel mogelijk uit te voeren, zodat het weefsel koud blijft met niet meer dan 2 minuten tussen de onthoofding en het uiteindelijk plaatsen van ontleed weefsel in 1x HBSS op ijs. Als microglia van meerdere dieren worden geïsoleerd, kunnen hersenen gedurende ~1 uur op ijs worden bewaard in 1x HBSS voordat wordt doorgegaan met het verwerken van het hele cohort dieren voor spijsvertering enz.
3. Spijsvertering en homogenisatie van de hersenen
   1. Mechanische en chemische dissociatie: Plaats het hersenweefsel van elke muis en 1 ml spijsverteringsbuffer in individuele petrischaaltjes op ijs. Snijd de hersenen met een schoon scalpelmesje grondig in kleine stukjes (<1 mm).
   2. Snijd de punt van een plastic transferpipet af en breng elk van de gehakte hersenen voorzichtig over in afzonderlijke putjes in een plaat met 24 putjes op ijs. Bedek de plaat met transparante flexibele folie en incubeer 30 minuten op ijs.
      OPMERKING: Als het op de juiste manier wordt gehakt, lijkt het hersenweefsel op goed gehakte knoflook.
   3. Dounce homogenisatie: Breng verteerde hersenoplossing van elk putje over in individuele glazen dounce-homogenisatoren van 7 ml op ijs, elk gevuld met 5 ml koude FACS-buffer. Klop elk brein voorzichtig met de losse stamper (A), ongeveer 30-40 keer, totdat een eencellige suspensie is verkregen. Na het douncen met de A-stamper, voorzichtig 3-4 keer met de strakke stamper (B) deppen om een eencellige suspensie te garanderen.
      NOTITIE: Duw de stamper niet meer dan 3/4 van de weg naar beneden om te voorkomen dat het weefsel aan de onderkant van de homogenisator wordt verpletterd. De uiteindelijke oplossing moet ondoorzichtig en melkachtig zijn.
      OPMERKING: Als u meerdere hersenen in één experiment verteert, moet u de overdracht van de hersenvertering naar de FACS-buffer zo timen dat elk monster slechts 30 minuten in de digestiebuffer zit. Oververtering kan leiden tot splitsing van oppervlakte-eiwitten, waardoor stroomafwaartse antilichaambinding en -signaal worden verminderd.
4. Het verkrijgen van een immuunverrijkt fragment
   1. Dichtheidsgradiënt vaststellen: Breng het homogenaat van elk brein over in afzonderlijke polypropyleenbuizen van 15 ml en voeg 2.125 ml isotone dichtheidsgradiënt toe en top tot 8.5 ml met FACS-buffer voor elk om een uiteindelijke concentratie van 25% dichtheidsgradiënt te verkrijgen. Keer de tubes van 15 ml voorzichtig 20x om om goed te mengen.
   2. Gebruik een transferpipet met smalle schaalverdeling en breng voorzichtig 4 ml met een dichtheidsgradiënt van 37% aan op elke buis, waarbij u zeer voorzichtig bent om schone lagen te vormen. Schakel de transferpipetten om en leg voorzichtig 2 ml met een dichtheidsgradiënt van 70% onder de laag (Figuur 2A). Breng over naar een centrifuge die is afgekoeld tot 4 °C en draai gedurende 20 minuten op 500 x g met de remhelling op nul.
   3. Immuunverrijkt fragment verzamelen: Gebruik schone transferpipetten om de myeline voorzichtig op te zuigen vanaf de bovenkant van het volume in de buis van 15 ml met behulp van een schone transferpipet en gooi deze weg. Verzamel voorzichtig het bovenste fragment van de dichtheidsgradiënt in een schone polypropyleen buis van 15 ml met behulp van een transferpipet.
   4. Verzamel voorzichtig het immuunverrijkte fragment (1,5 ml boven en 1,5 ml onder waar de 70% en 37% dichtheidsgradiëntlagen samenkomen) in een nieuwe polypropyleen buis van 15 ml (Figuur 2B). Voeg 10 ml FACS-buffer toe aan het immuunverrijkte monster om het dichtheidsgradiëntmedium te verdunnen en keer de buis voorzichtig 20x om om grondig te mengen.
      OPMERKING: Aangezien cellen de neiging hebben om aan de zijkanten van het buisje te blijven kleven, moet u ervoor zorgen dat u alle cellen in het monster verzamelt tijdens de verzamelstappen door de pipet langzaam langs de zijkanten van het buisje te cirkelen terwijl u de vloeistof opvangt.
   5. Pelleteer de cellen in het immuunverrijkte monster door de buisjes van 15 ml gedurende 10 minuten in een centrifuge van 4 °C bij 500 x g te centrifugeren met de aftraprem op nul. Verwijder onmiddellijk na het centrifugeren het supernatans voorzichtig en laat ongeveer 300 μL vloeistof achter in de buis van 15 ml, waarbij u ervoor zorgt dat u de pellet (die mogelijk niet zichtbaar is) niet verstoort.
   6. Verzamel het supernatans in een andere buis van 15 ml om ervoor te zorgen dat de cellen in de spin zijn gepelleteerd (gooi deze fractie weg zodra verificatie met het celgetal van de geresuspendeerde pellet is voltooid). Na het resuspenderen van de celpellet in het volume van 300 μL met behulp van een P1000-pipet, telt u de cellen met een hemacytometer om de totale celopbrengst te schatten.

Figuur 2: Verkrijgen van het immuunverrijkte fragment door discontinue dichtheidsgradiënt. (A) Het hersenhomogenaat wordt gemaakt tot 25% dichtheidsmedium, onderlaag 4 ml van 37% dichtheidsmedium roze gekleurd via fenolrood en 2 ml van 70% dichtheid medium blauw gekleurd via trypanblauw. (B) Na het centrifugeren zijn de fracties gescheiden. Microglia bevindt zich op het grensvlak van mediafragmenten met een dichtheid van 37% en 70%. Het myelinefragment bevindt zich aan de bovenkant van de buis van 15 ml en wordt weggegooid. Het bovenste fragment wordt verzameld als back-up voor het geval de spin mislukt en er geen cellen worden hersteld. Als dat gebeurt, kan de gradiënt worden herhaald met behulp van deze breuk. De immuunverrijkte fractie wordt stroomafwaarts verzameld. De onderste fractie met rode bloedcellen blijft in het buisje en wordt weggegooid. (C) Voorbeeldfiguur met volledige lagen. Gemaakt met BioRender.com. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Extracellulaire antilichaamkleuring
   1. Blokkeren: Breng de cellen over naar een ronde bodem met 96 putjes op ijs en centrifugeer bij 500 x g met rem om de cellen te pelleteren. Verwijder het supernatans snel in de gootsteen door op de plaat te tikken om het supernatant weg te gooien, waarbij de celpellet intact blijft op de bodem van de put.
   2. Resuspendeer de cellen in 50 μL FACS-buffer met anti-muis CD16/32 FC-receptorblokkerend reagens met behulp van een P200-pipet (eindconcentratie 10 μg/ml, verdunningsfactor 1:50) om niet-specifieke binding van antilichamen aan monocyten of andere FcR-dragende cellen te voorkomen. Incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
   3. Antilichaamkleuring: Bereid het juiste volume van een 2x mastermix met P2RY12-allophycocyanine (APC; verdunningsfactor 1:50, concentratie 4 μg/ml voor een uiteindelijke putconcentratie van 1:100, concentratie 2 μg/ml) en violet 525 levende dode kleuring (verdunningsfactor 1:50 voor een uiteindelijke putconcentratie van 1:100). Voeg 50 μl van het kleuringsmengsel toe aan de celsuspensie (verkregen na blokkering in punt 1.5.1) en incubeer de plaat gedurende 30 minuten in het donker op ijs.
      OPMERKING: Voor dit protocol presenteren we het kleuren van de cellen met P2RY12. Ten eerste is P2RY12 een homeostatische marker voor microglia die in bepaalde ziektecontexten kan worden gedownreguleerd. 5XFAD Alzheimer-modelmuizen hebben bijvoorbeeld de P2RY12-niveaus verlaagd, waardoor ze moeilijk te identificeren^{zijn 22}. Alternatieve beitsen die voor de isolatie kunnen worden gebruikt, zijn Tmem119, Cd11b en CD45²³. Ten tweede kan het geconjugeerde fluorochroom APC worden aangepast aan het gewenste panel van antilichamen. Het kiezen van een helder fluorochroom, zoals APC of PE, zal er echter voor zorgen dat de positieve en negatieve populaties gemakkelijk te onderscheiden zijn²⁴.
   4. Voeg na het kleuren 200 μL FACS-buffer rechtstreeks toe aan elk putje om de cellen te wassen. Centrifugeer op 500 x g bij 4 °C om het supernatans te verwijderen door te tikken. Resuspendeer cellen in 200 μL FACS-buffer met een P200-pipet, draai ze rond bij 500 x g bij 4 °C en tik op de plaat om de buffer uit de putjes te verwijderen.
   5. Voorbereiding van de stroomregelingen: Scheid voorafgaand aan de kleuring de benodigde hoeveelheden cellen van elk monster na het blokkeren in stap 1.5.1 voor de vereiste stroomregelingen.
      OPMERKING: Stroomregelaars zijn vereist voor elk experiment om de poorten tot stand te brengen. De stroomregelaars kunnen worden genomen van een extra dier of van een fractie van elk van de proefputten. Zorg er bij het splitsen van cellen voor dat u voldoende cellen per controle toewijst, aangezien 10.000-30.000 cellen per controle nodig zijn om poorten met hoge betrouwbaarheid tot stand te brengen.
      1. Er zijn drie relevante stroomregelingen: geen vlek, levend dood en P2RY12 isotypecontrole. Voeg voor de controle zonder vlekken geen antilichamen toe. Behandel cellen in de P2RY12-isotypecontrole met levensvatbaarheidskleurstof (1:100) en een isotypecontrole-antilichaam geconjugeerd aan APC (1:100).
      2. Om de levende dode controle voor te bereiden, aliquot cellen in een apart putje en de helft van het celvolume in een buis van 500 μL verplaatsen. Plaats de buis van 500 μl gedurende 5 minuten in de vriezer van -80 °C, gevolgd door plaatsing in de incubator van 37 °C gedurende 5 minuten om de cellen te doden. Breng de hoeveelheid dode cellen terug in de levende dode controleput en kleur met een aminebindende levensvatbaarheidskleurstof op violet 525 (verdunningsfactor 1:100) om dode cellen te markeren.
         OPMERKING: Het protocol is geschreven voor het kleuren van platen met een flick-methode voor het verwijderen van supernatans. Dit vereist echter dat het supernatans onmiddellijk na voltooiing van de spin wordt verwijderd en dat de flick met voldoende kracht wordt gedaan om het supernatans snel te verwijderen zonder de pellet te verstoren. Als alternatief kunnen 1,5 ml RNAse/DNase-vrije buisjes worden gebruikt voor de kleuring, met de volgende aanpassingen: Breng de cellen over in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en pellet op 800 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig supernatans op met pipetten. Tip: Voor snelheid kan een overdrachtspipet van 5 ml met een P200-tip het supernatant snel en nauwkeurig opzuigen. Controleer bij het aanzuigen op de pellet. Als de pellet niet zichtbaar is, laat dan 50 μL supernatans over en pas de berekeningen dienovereenkomstig aan. Voeg bij het uitwassen van antilichamen extra FACS toe om de verdunning van antilichamen te verhogen (1000 μL in plaats van 200 μL) om rekening te houden met onvolledige verwijdering van supernatant. Afhankelijk van de cytometer gebruikt u de buisjes van 1,5 ml voor het sorteren, waardoor er minder benodigdheden nodig zijn.
6. FACS-sortering voor microglia
   1. Bereiding: Resuspendeer elk putje in 200 μL FACS-buffer met een P200-pipet en breng het over in gelabelde flowsorteerbuizen en voeg FACS-buffer toe tot een totaal van 500 μL voor een concentratie van ongeveer 5 x 10⁵ events per ml. Bewaar op ijs in het donker tot analyse. Bereid nasorteerbuisjes voor door 100 μL FACS-buffer toe te voegen als buffer voor cellen in 1,5 ml RNAse-vrije buisjes.
   2. Cytometerinstellingen: Sorteer cellen op een flowcytometriecelsorteerder die is opgesteld met het mondstuk van 100 μm. Sorteer cellen met 18-20 psi.
   3. Gating: Poort op de cytometer voor celgrootte met behulp van side-scatter (SSC)-gebied versus voorwaartse scatter (FSC)-hoogte met behulp van de no-stain-controle om puin te helpen onderscheiden, plaats SSC-A op een log-as om een celpopulatie te visualiseren en poort nauwkeurig om cellen te selecteren (poort S1; Figuur 3). Om eventuele doubletten te verwijderen, zet u FSC-H versus FSC-W uit en plaatst u een poort dicht rond de celpopulatie en verwijdert u al het puin en doubletten (poort S2). Gebruik de P2RY12-isotypecontrole om de cellen in het APC-kanaal te onderzoeken en de poort voor autofluorescentie in te stellen om P2RY12+-cellen te bepalen. Gebruik de controles zonder vlekken en levende dode cellen die niet fluorescerend zijn op violet 525 nm als levende cellen.
   4. Sorteren: Plot violet 525 nm vs APC en bepaal de populatie die P2RY12+ is en leeft volgens FMO's (MG). Sorteer die cellen in de gelabelde postsorteerbuis (Figuur 3). Het uiteindelijke sorteerpercentage is ongeveer 50% van het totale aantal gebeurtenissen, waarbij het grootste deel van het totale verlies van de gebeurtenis bestaat uit puin dat wordt verwijderd in poort S1 (~70% van de gebeurtenissen zijn cellen; Tabel 1).
7. RNA-isolatie en -analyse
   1. Transcriptie- en translatieremmers: Als u RNA-extractie plant, om het risico van isolatie-geassocieerde transcriptomische handtekeningen te elimineren, neem dan translatie- en transcriptieremmers op in de bufferstappen. Bereid de remmercocktail zoals beschreven door Marsh et al. inclusief actinomycine D, anisomycine en triptolide²⁵.
      1. Bereiding van de remmer: Reconstitueer de remmervoorraden en bewaar als volgt: Reconstitueer actinomycine D in dimethylsulfoxide (DMSO) tot 5 mg/ml en bewaar bij -20 °C. Reconstitueer triptolide in DMSO tot 10 mM en bewaar bij -20 °C, beschermd tegen licht. Reconstitueer anisomycine in DMSO tot 10 mg/ml en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen licht. Bewaar alle remmervoorraden niet langer dan 1 maand nadat ze zijn gereconstitueerd.
      2. Buffermodificaties: Voeg als volgt remmers toe in vier verschillende buffers in het protocol: Bereid bij het uitvoeren van de transcardiale perfusie HBSS met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad) en triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad). Na perfusie worden de hersenen naar het laboratorium vervoerd in HBSS met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad). Bereid FACS-buffer met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad). Bereid de digestiebuffer met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad). Bereid na het sorteren wasbuffer met HBSS met actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad).
         NOTITIE: Wanneer u de remmers toevoegt, zorg er dan voor dat u ze onmiddellijk voor gebruik toevoegt en bescherm alle voorbereide buffers tegen licht tijdens gebruik. Vermijd bevriezing-dooi van voorraadoplossingen.
   2. Wassen na het sorteren: Omdat de cellen zijn gesorteerd in 1,5 ml RNasevrije buisjes in FACS-buffer, die de RNA-isolatie verstoren, is het noodzakelijk om de cellen te wassen. Draai de cellen gedurende 5 minuten op 1000 x g bij 4 °C en verwijder het supernatant, zodat er ongeveer 50 μL vloeistof overblijft.
   3. Voeg 200 μL 1x HBSS bevattend actinomycine D (5 μg/ml, 1:1000 uit voorraad), triptolide (10 μM, 1:1000 uit voorraad) en anisomycine (27,1 μg/ml, 1:368,5 uit voorraad) toe en meng goed. Herhaal het centrifugeren en verwijder het supernatant, waardoor er 50 μL vloeistof overblijft (was 1). Voeg 200 μL wasbuffer na het sorteren toe, meng grondig en herhaal het centrifugeren en verwijder het supernatans, waardoor er 25 μL vloeistof overblijft (was 2).
   4. RNA-extractie: Gebruik voor RNA-isolatie uit microgliacellen een RNA-isolatiekit met lage input voor hoge en consistente RNA-opbrengsten en RIN-scores boven de 9 (zie hieronder en Materiaaltabel voor productaanbevelingen). Voeg aan de celkorrel 350 μL lysisbuffer uit de aanbevolen kit + β-mercaptoethanol (1:100) toe en meng goed.
      OPMERKING: Indien nodig kan het protocol op dit punt worden opgeschort. Monsters kunnen worden opgeslagen in de lysisbuffer bij -80 °C tot RNA-extractie. Als RNA na opslag wordt geëxtraheerd, ontdooi het lysaat dan op ijs en ga verder met de kitspecifieke instructies voor de isolatie.
   5. Breng lysaat over in een kolomvormige celvernietiger (zie de materiaaltabel voor productaanbevelingen) en centrifugeer gedurende 2 minuten op maximale snelheid bij 4 °C. Elute in minimaal 14 μL RNasevrij water en bepaal de concentratie indien van toepassing. RNA kan na dit punt worden gebruikt voor elke stroomafwaartse toepassing.

Figuur 3: Poortstrategie voor stroomsortering. Gebeurtenissen worden gated voor celgrootte op SSC-A versus FSC-H (S1). Vervolgens worden cellen afgeschermd als singlets op FSC-H versus FSC-W (S2). Singletcellen worden gesorteerd als levend indien negatief op Comp-FL8-A::405-526-52 (violette 525 levende dode vlek) en als P2RY12+ indien positief op Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) met behulp van de P2RY12-isotypecontrole. Cellen worden gelabeld als MG en gesorteerd als ze zowel levend als P2RY12+ zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

OMHEINDE BEVOLKING	Frequentie van ouder	Frequentie van de totale	Tellen
S1	68.10%	68.10%	162186
S2>S1	93.59%	63.70%	151707
P2Ry12+ (670+) > S2 > S1	83.05%	52.90%	125986
Live (525-) > S2 > S1	92.78%	59.10%	140752
MG (P2RY12+ Live) >S2>S1	78.96%	50.30%	119794

Tabel 1: Voorbeeld van een voorbeeldtabel met afstammingspercentages en verwachte gebeurtenisnummers.

2. Intranucleaire stroomkleuring voor analyse van eiwitexpressie

OPMERKING: Andere celtypen kunnen op dit punt worden gestart, dit protocol wordt getest met gekweekte cellen, waaronder HEK293-cellen, BV2-microglia-achtige cellen en menselijke IPSC-afgeleide microglia.

1. Fixatie en kleuring van cellen
   OPMERKING: Gebruik voor het volgende protocol een intracellulaire kleuringskit die is geoptimaliseerd voor nucleaire kleuring. Zien Tabel met materialen voor productaanbevelingen.
   1. Aliquot extracellulair gekleurde cellen uit sectie 1.5.2 in een plaat met 96 putjes (5 x 10⁴- 1 x 10⁶ cellen). Draai de cellen 5 minuten op 500 x g bij 4 °C en veeg om de FACS-buffer te verwijderen.
      OPMERKING: Om gegevens met een hoge betrouwbaarheid van de mediane niveaus te verkrijgen, moeten minimaal 10.000 cellen per put worden gebruikt. Hoewel er geen aanbevolen maximum is, is het het beste om het aantal cellen gedurende het hele experiment consistent te houden om ervoor te zorgen dat er geen significant effect is van verschillende variatiecoëfficiënten (CV).
   2. Fixatie en permeabilisatie: Voeg 200 μL 1x fix-concentraat toe en meng voorzichtig met de P200-pipet om de cellen te resuspenderen. Incubeer 45-60 minuten in het donker. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij kamertemperatuur (RT) en veeg om supernatant weg te gooien.
      OPMERKING: Indien nodig kan het protocol op dit punt worden opgeschort. Na het weggooien van supernatant, suspendeert u de cellen opnieuw in een langdurige opslagbuffer voor immuuncellen (zie de materiaaltabel voor productaanbevelingen). Monsters kunnen 12-18 uur bij 4 °C worden bewaard, beschermd tegen licht en bedekt met transparante folie om bufferverdamping te beschermen.
   3. Voeg 200 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan elk putje en pipetteer met een P200 om te mengen. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT en veeg om supernatant weg te gooien. Herhaal de permeabilisatiebuffer in totaal 3x.
   4. Voorbereiding van de stroomregelingen: Splits het volume van de cellen van elk monster voor de vereiste stroomregelingen (10.000-30.000 cellen per controleput is voldoende).
      1. Om de vlekvrije controle voor te bereiden, fixeert u de niet-vlekkencellen van de soort of aliquot ongekleurde cellen in een apart putje dat geen antilichaam zal ontvangen.
      2. Om de fluorescentie minus één (FMO)-controle voor te bereiden, aliquot cellen voor elk van de antilichamen op het paneel, behalve die in dat kanaal.
      3. Neem voor de relevante kanalen het isotypecontrole-antilichaam op in de FMO voor gating. Bijvoorbeeld, in een paneel dat P2RY12-APC en H3K27Ac-AlexaFluor568 bevat, moeten er twee FMOS zijn: (1) de APC-FMO die alleen H3K27Ac-AlexaFluor568 en het P2RY12 isotype controle-antilichaam bevat en (2) de 568-FMO die alleen P2RY12-APC en de isotypecontrole primair en 568 secundair bevat.
         OPMERKING: Dit protocol wordt gepresenteerd om een enkele HPTM te testen, maar er kunnen panels worden opgesteld die veel HPTM's bevatten die zijn geconjugeerd aan verschillende fluoroforen.
   5. Primaire antilichaamkleuring: Voeg 50 μL 1x permeabilisatiebuffer met de juiste concentratie primair antilichaam toe aan elk putje. Incubeer 30 minuten bij RT in het donker. Was 2x met 200 μL 1x permeabilisatiebuffer.
      OPMERKING: De concentratie van antilichamen die voor elke HPTM worden gebruikt, is opgenomen in de materiaaltabel. De concentratie wordt bepaald door verschillende concentraties van de antilichamen te testen op gekweekte cellen die zijn behandeld met een stimulerend middel dat een dramatische toename zou veroorzaken, bijvoorbeeld een HDAC-remmer voor acetyleringsmarkeringen, en ervoor te zorgen dat zowel onbehandelde als behandelde cellen ruim binnen het detectiebereik lagen (boven de isotypecontrole en onder het maximale detectiebereik van de cytometer). De optimale antilichaamconcentratie voor HPTM's moet een gemiddelde mediane fluorescentie-intensiteit in het fluorofoorkanaal hebben tussen 5 x 10⁴ en 1 x 10⁵.
   6. Secundaire antilichaamkleuring: Blokkeer met 200 μL 1x permeabilisatiebuffer met 2% normaal ezelserum (NDS) gedurende 10 minuten bij RT. Draai gedurende 5 minuten op 500 x g bij RT en veeg om supernatant te verwijderen.
   7. Voeg 50 μL 1x permeabilisatiebuffer met 2% NDS en de juiste concentratie secundair antilichaam toe en incubeer gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Voeg 200 μL 1x permeabilisatiebuffer toe aan putjes om te verdunnen, centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT en veeg om supernatant weg te gooien. Was de cellen 2x met 200 μL 1x permeabilisatiebuffer.
      OPMERKING: Onderbreek indien nodig het protocol op dit punt. Resuspendeer cellen in 200 μL langdurige opslagbuffer voor immuuncellen met P200-pipet (zie Materiaaltabel voor aanbevelingen) en bewaar bij 4 °C gedurende 12-24 uur beschermd tegen licht.
   8. Voorbereiding op flowcytometrie: Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten bij 500 x g bij RT en veeg om supernatant weg te gooien. Resuspendeer cellen in 200 μL FACS-buffer met behulp van een P200-pipet voor flowcytometrie. Verzegelen met transparante folie voor transport naar de cytometer.
2. Flowcytometrie
   1. Om het voorgestelde antilichaampaneel te analyseren, moet u ervoor zorgen dat de cytometer is uitgerust met ten minste vier lasers, waaronder violet (405 nm), blauw (488 nm), geel (561 nm) en rood (633 nm). De cytometer heeft filters nodig om FITC (blauw-525 nm), KRO (violet-525 nm), PE (geel-585 nm) en APC (rood-660 nm) te detecteren. Voeg extra antilichamen toe, afhankelijk van de gekozen cytometer.
   2. Kalibratie en standaardisatie: Voer aan het begin van elk experiment regenboogfluorescerende kralen uit en pas de spanning van de fotomultiplicatorbuis (PMT) aan totdat de kraalpieken vergelijkbaar zijn met de streefwaarden die voor eerdere experimenten zijn uitgevoerd. Deze standaardisatiemethode maakt het mogelijk om de drift van apparatuur in de loop van de tijd op te vangen.
   3. Compensatie: Nadat de PMT-spanning en versterking voor het experiment zijn ingesteld, gebruikt u antilichaamgevangen compensatieparels om de compensatiematrix voor het panel van antilichamen vast te stellen. Deze berekening zorgt ervoor dat de fluoroforen niet bijdragen aan de signaalveranderingen in andere kanalen. Dit is in toenemende mate nodig bij het multiplexen van meerdere antilichamen.
   4. Size gating: In een dot plot, plot SSC-A op log vs FSC-H op lineair. Poort vuil uit en selecteer de celgrootte met behulp van de S1-poort. Selecteer voor singlet-cellen in een puntplot van FSC-W versus FSC-H en poort als S2. (Figuur 4).
   5. Fluorofoorpoorten vaststellen: Bepaal met behulp van de relevante FMO voor elk fluorofoorkanaal de poorten om te bepalen wat een positief signaal is in elk kanaal met behulp van histogrammen met één parameter (Figuur 4).
   6. Meten van de monsters: Noteer de monsters zorgvuldig met behulp van de vastgestelde poortstrategie. Identificeer de microglia met behulp van het P2RY12+-signaal, bepaal de expressie van het eiwit in de respectieve kanalen alleen voor de microglia.
3. Analyse van flowcytometriegegevens
   1. Analysepoorten tot stand brengen: Gebruik de bovenstaande stappen voor de cytometer op de gebruikersinterface van de analysesoftware en gebruik dezelfde poorten die worden gebruikt voor registratie voor analyse.
   2. Verkrijg MFI-waarden met behulp van flowcytometrie-analysesoftware (zie Materiaaltabel voor aanbevelingen): Vat de cytometerpoortstrategie voor flowanalyse samen. Selecteer met behulp van de functie statistieken toevoegen de mediaan voor de populatie van belang (bijv. 568+) op de gecompenseerde kanaalhoogte. Exporteer met behulp van de tabeleditor de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI)-waarden voor de respectieve kanalen naar een spreadsheet om door te gaan met statistische analyse (Tabel 2).
      OPMERKING: Aanvullend bestand S1 bevat voorbeeldgegevens van met lipopolysaccharide (LPS) en fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) geïnjecteerde muizen en een voorbeeldanalysebestand met de poortstrategie en MFI-waarden.
   3. Analyse van MFI-waarden naar eiwitvouwverandering: Bereken na het verkrijgen van de MFI-waarden de vouwverandering van de MFI ten opzichte van de controle- of onbehandelde populatie (vergelijking 1). De MFI-vouwverandering weerspiegelt de vouwverandering in eiwitniveaus. Beoordeel met behulp van de vouwveranderingswaarden de verandering in expressie en bereken de statistische significantie met behulp van een t-toets of ANOVA.
      Vergelijking 1

Figuur 4: Poortstrategie voor de beoordeling van de MFI-waarde van eiwitten. Gebeurtenissen worden eerst afgeschermd voor celgrootte op SSC-A versus FSC-H (S1). De cellen worden vervolgens afgesloten voor singlets op FSC-H versus FSC-W (S2). Singletcellen worden vervolgens geïdentificeerd als microglia door middel van een P2RY12-APC-signaal (APC+), waarbij de poort wordt vastgesteld op basis van fluorescentie in een APC-FMO-controle die een isotypecontrole-antilichaam bevat. Cellen worden vervolgens afgeschermd voor het H3K27Ac-AlexaFluor568-signaal op Comp-FL5-A::Y610-mCherry. De fluorescerende intensiteit van de 610+ cellen wordt bepaald als een proxy voor eiwitexpressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Volwassen muizen werden transcardiaal geperfundeerd en opgeofferd voor microglia-isolatie. Microglia werden geïsoleerd op ijs en gekleurd met P2RY12-APC en violet 525 levende dode antilichamen. Cellen waarvan werd vastgesteld dat ze positief waren voor P2RY12 en negatief voor violet 525 levende dode kleuring, werden gesorteerd als levende microglia. De gemiddelde opbrengst van microglia uit een ontlede muizenhersenen was 1,28 x 10⁵ ± 0,05 (gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM), N=100). Er is geen verschil in de opbrengst van microglia van vrouwelijke (1,25 x 10⁵ ± 0,09 [gemiddelde ± SEM, N=46]) en mannelijke (1,32 x 10⁵ ± 0,07 [gemiddelde ± SEM, N=54]) muizen (t(98)=0,6365, p=0,526). Bij isolatie uit specifieke hersengebieden is de gemiddelde opbrengst van microglia uit muizencortex 8,3 x 10⁴ ± 0,08 (gemiddelde ± SEM, N=15) en uit de hippocampus van muizen 4,1 x 10⁴ ± 0,02 (gemiddelde ± SEM, N=16). Zoals verwacht is er een significant verschil in de opbrengst van microglia uit elk hersengebied (F(2, 128)=25,25, P<0,0001). Na microglia-isolatie werd RNA geëxtraheerd uit de geïsoleerde cellen met behulp van een low-input RNA-isolatiekit. Consequent was de RNA-integriteitsscore (RIN) hoger dan 9,0 (9,62 ± 0,05) en de gemiddelde opbrengst van RNA per cel was 0,25 ± 0,01 pg (gemiddelde ± SEM, N=32; Aanvullend bestand S2).

Volwassen muizen werden 24 uur voorafgaand aan het offeren intraperitoneaal geïnjecteerd met 1 mg/kg lipopolysaccharide (LPS). De muizen werden transcardieel geperfundeerd met HBSS en microglia geïsoleerd uit de hele hersenen volgens het beschreven protocol (Figuur 5A). Voor elke kleuring werden 20.000-30.000 cellen toegewezen aan elk panel van antilichamen. De globale niveaus van histon-3-lysine-27-acetylering (H3K27Ac) werden beoordeeld in geïsoleerde microglia via flowcytometrie. Voor mannelijke en vrouwelijke muizen induceerde LPS-behandeling een toename van H3K27Ac wanneer de MFI binnen het geslacht is genormaliseerd (t(6)=9.676, p<0.0001; Figuur 5B). Bij het onderzoeken van de histogrammen voor de gekleurde cellen, blijven de populaties normaal verdeeld met een vergelijkbare variatie; de cellen zijn echter verschoven naar verhoogde fluorescentie, wat resulteert in een toename van de MFI (figuur 5C). Bij onderzoek naar H3K9Ac in dezelfde behandeling is er een vergelijkbare toename van H3K9Ac (t(6)=7,299, p=0,0003; Figuur 5D,E) de vouwverandering van LPS ten opzichte van PBS van het H3K9Ac-signaal is echter kleiner dan het H3K27Ac-signaal.

Figuur 5: Globale veranderingen in histonacetylering in geïsoleerde microglia. (A) Muizen worden 24 uur voorafgaand aan het offeren intraperitoneaal geïnjecteerd met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of 1 mg/kg lipopolysaccharide (LPS). De microglia worden verzameld uit de immuunverrijkte fractie en gefixeerd voor flowcytometrie en globale histon na translationele modificatiebeoordeling. De mediane fluorescerende intensiteit wordt beoordeeld als een proxy voor eiwitexpressie. Gemaakt met BioRender.com. (B) Wereldwijde niveaus van H3K27Ac namen toe als reactie op LPS-behandeling. Vouw verandering naar PBS genormaliseerd binnen experiment en geslacht. Ongepaarde tweezijdige t-toets, t(6)=9.676, p<0.0001. Staafdiagram toont het gemiddelde ± SEM. N=8 dieren; 2 per aandoening in 2 onafhankelijke experimenten. (C) Voorbeeld van histogrammen die de verschuiving van de H3K27Ac fluorescerende intensiteit weergeven. Modal toont histogrammen van PBS-geïnjecteerde versus LPS-geïnjecteerde muizen. (D) Voorbeeld van histogrammen die de verschuiving van de H3K9Ac fluorescerende intensiteit weergeven. Modal toont histogrammen van PBS-geïnjecteerde versus LPS-geïnjecteerde muizen. (E) Wereldwijde niveaus van H3K9Ac stegen als reactie op LPS-behandeling. Vouw verandering naar PBS genormaliseerd binnen experiment en geslacht. Ongepaarde tweezijdige t-toets, t(6)=7.299, p=0.0003. Staafdiagram toont het gemiddelde ± SEM. N=8 dieren; 2 per aandoening in 2 onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om te bevestigen dat de beschreven methode vergelijkbaar was met andere eerder gebruikte methoden voor de kwantificering van globale histonmodificatie, wilden we immunoblot gebruiken als een vergelijkend hulpmiddel. De opbrengst van de geïsoleerde microglia is echter simpelweg te laag om een redelijke beoordeling mogelijk te maken. Daarom gebruikten we gekweekte BV2-cellen om de intracellulaire flowcytometriemethode te vergelijken met een Western blot (WB). BV2-cellen werden gekweekt in volledige media (DMEMF12, 10% FBS, 1x penicilline/streptamycine en 1x L-glutamine) bij 37 °C, 5% CO₂. Cellen werden gepasseerd met 0,25% trypsine-EDTA en geplateerd met een dichtheid van 250.000 cellen/putje en behandeld in gereduceerde serummedia (DMEM F12, 2% FBS, 1x penicilline/streptamycine en 1x L-glutamine) en gedurende 12 uur laten herstellen bij 37 °C, 5% CO₂. Cellen werden behandeld met 25 ng/ml LPS gedurende 24 uur voorafgaand aan fixatie zoals hierboven beschreven of lysis met een WB-lysisbuffer. Het signaal van H3K27Ac werd met beide methoden uitgevoerd, waarbij GAPDH werd gebruikt als belastingscontrole voor WB. Voor elke groep werd een analyse van de genormaliseerde fluorescentie-intensiteit in vergelijking met de PBS-controle bepaald (figuur 6A). Bij het onderzoeken van de verandering in het genormaliseerde H3K27Ac-signaal door WB, was er een 1.527-voudige toename van de met LPS behandelde aandoening ten opzichte van de H₂O-controle, waarvan werd vastgesteld dat deze significant was door de ongepaarde t-test (t = 3.024, df = 5; p = 0.0293). Bij onderzoek van de verandering met behulp van flowcytometrie was er een 1,482-voudige toename van de met LPS behandelde aandoening die significant werd geacht (t=7,843, df=10; p<0,0001). Met behulp van een 2-weg ANOVA om de methoden te vergelijken, werd vastgesteld dat er een significant effect was van de behandeling (F(1,15)=45,21,p<0,0001), maar niet van de methode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) of interactie (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Bovendien verifiëren we hier dat er geen verandering is in histon H3-spiegels door zowel Western blot als flowcytometrie, aangezien 2-weg ANOVA geen significant effect aantoonde van de LPS-behandeling (F(1,7)=0,02170,p=0,8870), de methode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) of de interactie (F(1,7=0,01191, p=0,9162; Figuur 6B). Voorbeeldvlekken en histogramverschuivingen voor deze gegevens worden ook getoond (Figuur 6C,D).

Figuur 6: Methodevergelijking voor kwantificering van de globale histonmodificatieverandering tussen flowcytometrie en western blot. (A) BV2-cellen worden behandeld met 25 ng/ml lipopolysaccharide (LPS) of H₂O gedurende 24 uur voorafgaand aan de analyse. De fluorescerende intensiteit van H3K27Ac wordt weergegeven als vouwverandering in de voertuigregeling, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), voor zowel flowcytometrie als western blot. 2-weg ANOVA toonde een significant effect van de LPS-behandeling (F(1,15)=45,21, p<0,0001), maar niet van de methode (F(1,15)=0,05545, p=0,8697) of interactie (F(1,15)=0,02785, p=0,8697). Tukey's correctie voor het testen van meerdere hypothesen werd toegepast voor de residuen. * presenteert 0,0332, ** presenteert 0,0021. (B) De fluorescerende intensiteit voor histon H3 wordt weergegeven als vouwverandering naar PBS voor zowel flowcytometrie als western blot. 2-weg ANOVA toonde geen significant effect van de LPS-behandeling (F(1,7)=0,02170, p=0,8870) of de methode (F(1,7)=0,01191, p=0,9162) of de interactie (F(1,7=0,01191, p=0,9162). (C) Voorbeeldvlekken en (D) flowcytometrieverschuivingen worden afgebeeld. De histogramgrootte wordt genormaliseerd naar procenten op basis van het aantal cellen dat aanwezig is in de modus fluorescerende intensiteit. Staafdiagram toont de gemiddelde SEM. n=2 onafhankelijke experimenten, 2 per conditie per experiment. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Alles bij elkaar laten deze resultaten zien dat deze techniek kan worden gebruikt om de globale HPTM-niveaus in geïsoleerde microglia kwantitatief te beoordelen. Bovendien bleek de methode vergelijkbaar te zijn met eerdere technieken, maar met veel lagere celinputs. Bovendien kan de huidige techniek, hoewel niet aangetoond, met de juiste compensatie worden gebruikt met meerdere antilichamen in hetzelfde panel dat verschillende HPTM's beoordeelt.

Aanvullend bestand S1: Voorbeeld analysebestanden. Dit bestand bevat een wsp-analysebestand en 7 fcs-bestanden, waaronder de niet-kleuring, P2RY12FMO, 568FMO, twee PBS-behandelde dieren en twee LPS-behandelde dieren gekleurd met H3K27Ac. Het doel van dit bestand is om de analyse en gating van een experiment te demonstreren dat zou kunnen weergeven hoe een succesvol experiment eruit zag. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand S2: Isolatiegegevens. Het bijgevoegde bestand bevat de relevante gegevens na microglia-sortering die de microglia- en RNA-opbrengst van het beschreven protocol bevat. Klik hier om dit bestand te downloaden.

OMHEINDE BEVOLKING	Frequentie van ouder	Frequentie van de totale	Tellen
S1	89.00%	89.00%	25672
S2>S1	88.73%	78.97%	22779
APC+ > S2 > S1	76.61%	60.50%	17452
610+ > APC+ > S2 > S1	99.56%	60.24%	17376

Tabel 2: Een voorbeeld van een voorbeeldafstammingsdiagram toont het percentage en de gebeurtenisnummers die nodig zijn voor nauwkeurige eiwitdetectie.

Discussion

Het gepresenteerde protocol maakt kwantitatieve beoordeling van globale HPTM-niveaus mogelijk door middel van flowcytometrie. Hoewel dit protocol een nieuwe methode presenteert, hebben eerdere studies kwantitatieve beoordeling van eiwitten uitgevoerd met behulp van een vergelijkbare benadering²⁶. Eerdere methoden die worden gebruikt om wereldwijde niveaus van HPTM's te beoordelen, zijn onder meer immunohistochemie en western blot 16,17,19,20. De gepresenteerde methode op basis van flowcytometrie is een gemakkelijk kwantificeerbare methode, terwijl western blot en immunohistochemie semi-kwantitatief zijn en een lagere doorvoer hebben. Western blot is afhankelijk van cellyse en vereist dus zowel eiwitnormalisatie als een belastingscontrole-eiwit waarvan wordt aangenomen dat het onveranderd is door de experimentele conditie²⁷. Immunohistochemie is semikwantitatief en heeft een zeer lage doorvoer, omdat het moeilijk is om de hoeveelheid eiwit kwantitatief te beoordelen zonder op celniveau te onderzoeken¹⁶. Evenzo is er voor de geïsoleerde microglia een voordeel aan het gebruik van de flowcytometriemethode vanwege de beperkte opbrengst, aangezien western blot een veel grotere eiwitinvoer vereist¹⁹. De lage vereisten voor het aantal cellen maken het mogelijk om meerdere kleurplaten van hetzelfde dier te gebruiken.

Zoals bij elke andere methode, zijn er echter beperkingen aan deze techniek, waaronder de kosten en beschikbaarheid van antilichamen, aangezien niet alle antilichamen goed werken in een flowcytometrie-omgeving. Bovendien is de vereiste concentratie antilichaam in vergelijking met immunoblot veel hoger. Hoewel multiplexing het mogelijk maakt om meerdere antilichamen op hetzelfde cellenpaneel te gebruiken, kunnen cellen na analyse niet van het antilichaam worden ontdaan, waardoor het celgebruik wordt beperkt tot één per antilichaamsoort. Dit is anders dan immunoblot waarbij dezelfde blot herhaaldelijk kan worden gebruikt. Afhankelijk van de beschikbaarheid van antilichamen en het aantal detectiekanalen op een cytometer, zou het echter mogelijk zijn om tot een dozijn markeringen tegelijk te onderzoeken.

De huidige methode legt alleen globale niveaus van eiwitexpressie vast en niet de specifieke genomische locatie, en veranderingen in globale niveaus weerspiegelen mogelijk geen veranderingen op individuele genomische loci. Evenzo hoeft een gebrek aan verandering in de mondiale niveaus niet te betekenen dat er geen genomische loci veranderingen ondergaan, alleen dat de globale veranderingen samen geen verschillen tussen behandelingen opleveren. Als zodanig is deze techniek bedoeld om te worden gebruikt als een scherm om HPTM's te identificeren die van belang zijn voor genomische analyse. Bovendien maakt deze methode het niet mogelijk om verschillende eiwitmarkeringen te vergelijken, behalve wanneer deze wordt beoordeeld als een vouwverandering ter controle. Daarom is dit beperkt in vergelijking met een standaard curve-gebaseerde methode zoals ELISA voor eiwitbepaling.

Het gepresenteerde protocol biedt een strategie voor het isoleren van levende microglia in de hersenen. Dit protocol is gebaseerd op P2RY12-eiwitexpressie voor microglia-isolatie. P2RY12 is echter een homeostatische marker in microglia en kan worden gedownreguleerd in ziektemodellen, zoals 5XFAD²². Zorg er daarom voor dat u bij het gebruik van een ziektemodeldier andere markereiwitten kiest, zoals TMEM119, CD11b of CD45 om te helpen bij het isoleren van microglia²³. Op dezelfde manier presenteren we dit protocol als isolatie van de hippocampus en/of de cortex. Dit protocol zou werken om microglia te isoleren van andere hersengebieden, waaronder witte stofgebieden, maar er kunnen meerdere dieren nodig zijn om voldoende microglia te verkrijgen, afhankelijk van de grootte van de interessegebieden.

Het gepresenteerde protocol kan levende microglia in de hersenen robuust isoleren, maar er zijn verschillende stappen, hieronder beschreven, in de isolatiefase die de celopbrengst kunnen verminderen als ze verkeerd worden uitgevoerd.

Perfusies voor dit protocol resulteren in een hoger percentage microglia in het immuunverrijkte fragment, wat de hoeveelheid tijd in de sorteerder zal verminderen. Perfusie is echter niet vereist en indien nodig kunnen andere euthanasiemethoden worden gebruikt.

Tijdens de isolatie van microglia moet myeline volledig worden verwijderd. Flowcytometers vertrouwen erop dat cellen in een snel tempo door smalle buizen kunnen reizen. Vanwege de viscositeit en de neiging om te klonteren, veroorzaakt myeline problemen met cytometers, waardoor vaak verstoppingen ontstaan die zowel de apparatuur kunnen beschadigen als het monster kunnen vernietigen, waardoor de opbrengst drastisch wordt verminderd. Wees voorzichtig met het verwijderen van alle myeline tijdens het verzamelen van immuunverrijkte fragmenten om stroomafwaarts problemen te voorkomen.

Plaatkleuring versus buiskleuring: In dit protocol hebben we twee opties beschreven voor het kleuren van cellen in buisjes van 1,5 ml of een plaat met 96 putjes. De use case voor elk hangt af van het experiment; Over het algemeen is buiskleuring echter een lager risico op het beïnvloeden van de opbrengst dan plaatkleuring, omdat de flick het risico loopt cellen te verliezen als het verkeerd wordt gedaan. Het kleuren van platen gaat veel sneller omdat het opzuigen van het supernatans voor elke buis tijdrovend is. Gebruik voorafgaand aan het fixeren (voor sorteren, enz.) buiskleuring om de opbrengst te maximaliseren en het risico op verlies te verminderen. Voor HPTM-analyse is de pellet echter stabieler als de cellen eenmaal zijn gefixeerd voor intranucleaire kleuring en is er minder risico op verlies bij flikkeren.

Vaststellen van de discontinue dichtheidsgradiënt: Bij het vaststellen van de gelaagdheid is het goed instellen van de lagen essentieel om de immuunverrijkte fractie te verkrijgen. Als de lagen verstoord of gemengd zijn en er troebel uitzien, zullen de cellen niet sorteren op de gewenste locatie en zal het moeilijk zijn om de immuunverrijkte celfractie te verkrijgen. Als dit gebeurt, draai dan met het dichtheidsmedium om myeline te verwijderen en verzamel vervolgens de volledige resterende fracties, verdun met 3 ml FACS-buffer tot 1 ml dichtheidsmedium en meng goed (hiervoor zijn meerdere buisjes nodig). Centrifugeer gedurende 10 minuten op 500 x g met de rem op 0. Gooi de supernatant weg en laat slechts ~300 μL oplossing over. Verzamel het volledige monster en beits. Dit levert lagere sorteerpercentages op en een hogere hoeveelheid tijd die aan de cytometer wordt doorgebracht, maar de opbrengst kan nog steeds vergelijkbaar zijn.

Bij gebruik van de isolatiemethode is het gunstig om cellen voor RNA en voor HPTM-evaluatie uit hetzelfde muizenbrein te kunnen verzamelen. In deze situatie kunnen cellen na het sorteren van de levende microglia worden gedeeld om een deel toe te wijzen aan RNA-evaluatie (minimaal aantal cellen om een fatsoenlijke RNA-opbrengst te verkrijgen is 75.000 cellen) en een deel voor verdere flowcytometrie-analyse (minimaal 10.000 cellen per putje voor een goede bepaling van MFI). In dit geval is het sorteren van de flowcytometer vereist. Wanneer u echter alleen van plan bent de cellen te gebruiken voor HPTM-analyse, is sorteren niet nodig en kan de immuunfractie worden gekleurd met het P2RY12-antilichaam en HPTM-antilichaam. Gating op de cytometer kan dan worden ingesteld voor P2RY12+ microglia, zoals zou worden gedaan voor flowsorting, om alleen het HPTM-signaal binnen microglia te analyseren. Door het elimineren van de sortering kan het protocol sneller en kosteneffectiever zijn. Bovendien is het bij de evaluatie van HPTM's uit gekweekte cellen voldoende om te beginnen bij het kleuringsprotocol en zijn er geen celmarkerantilichamen nodig, zoals aangetoond in figuur 6. Het HPTM-evaluatieprotocol kan worden gebruikt voor veel celtypen, waaronder gekweekte, primaire en IPSC-afgeleide cellen.

Ten slotte, hoewel we slechts twee mogelijke toepassingen van microglia stroomafwaarts van isolatie hebben gepresenteerd, zijn er nog vele andere, waaronder epigenetische technieken zoals ChIP, CUT&Tag en CUT&RUN. In het geval van genomische epigenetische technieken, waarbij het karakteriseren van veranderingen op specifieke loci van belang is, kies dan specifieke remmers voor schrijvers en gummen van chromatinemarkeringen¹¹ die zijn afgestemd op de experimenten om ervoor te zorgen dat eventuele geprofileerde microgliale epigenetische modificaties geen technische artefacten zijn van stappen in de isolatieprocedure, zoals enzymatische spijsvertering. Bij het beoordelen van veranderingen in globale niveaus van epigenetische markeringen, zoals door gebruik te maken van kwantitatieve flowcytometrie, wordt niet verwacht dat eventuele door de procedure geïnduceerde veranderingen zo groot zijn dat ze op mondiaal niveau worden gedetecteerd.

Over het algemeen bieden de besproken methoden een nieuwe, eencellige methode voor het kwantificeren van globale niveaus van histonmodificaties en andere epigenetische veranderingen door middel van flowcytometrie. We toonden aan dat deze methode voldoende gevoelig is om globale veranderingen in de enhancer-marker H3K27ac in microglia te detecteren als reactie op LPS in vivo. Dit komt overeen met eerdere ChIP-sequencing van H3K27ac na LPS-stimulatie die een dramatische remodellering laat zien van enhancers die reageren op LPS²⁸. Toepassingen van deze methode zullen het mogelijk maken om globale epigenetische veranderingen in verschillende hersenceltypen in ontwikkeling en ziekte te onderzoeken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5M EDTA	Invitrogen	AM9260G
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile	Falcon	352196
24-well Clear Not Treated Plates	Costar	3738
2-Mercaptoethanol	Gibco	21985023
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface	Corning	3788
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11)	Cell Signalling Technology	9649S	Dilution: 1:100
Acetyl Histone H4 K8 (2594)	Cell Signalling Technology	2594S	Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4)	Cell Signalling Technology	8173S	Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516)	Invitrogen	MA523516	Dilution: 1:100
Actinomycin D	New England Biolabs	15021S
Anisomycin	New England Biolabs	2222S
Anti-Histone H3 (tri methyl K4)	Abcam	ab213224	Dilution: 1:100
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb	PTM Biolabs	PTM-1411RM	Dilution: 1:250
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb	PRM Biolabs	PTM-1401RM	Dilution: 1:250
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D	BioLegend	848006
BSA	Tocris	5217
Cyto-Last Buffer	BioLegend	422501
dimethylsulfoxide, sterile	Cell Signalling Technology	12611S
DNAse I	STEMCELL Technologies	07900
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488	Jackson ImmunoResearch	715-546-150	Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488	ABclonal	AS035	Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568	Invitrogen	A10042	Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421	BioLegend	406410	Dilution: 1:500
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes	Fisherbrand	13-711-9AM
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL	Fisherbrand	FB12566502
H3K18ac Polyclonal Antibody	Invitrogen	720095	Dilution: 1:100
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14185052
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red	Gibco	14175103
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002)	Abcam	ab6002	Dilution: 1:100
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL	VWR	885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb	PTM BIolabs	PTM-1406RM	Dilution: 1:250
Lipopolysacharide	Sigma-Aldrich	L5418
Normal Donkey Serum	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
OneComp eBeads Compensation Beads	Invitrogen	01-1111-41
PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical	Cedarlane	LK003178
Percoll	Sigma-Aldrich	GE17-0891-02
Phenol Red	VWR	RC57004
QIAshredder	Qiagen	79656
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity	BioLegend	422905
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL	Invitrogen	AM12400
Rneasy Plus Micro Kit	Qiagen	74034
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL	Corning	352063
Triptolide	New England Biolabs	97539
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set	BioLegend	424401
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody	BioLegend	156604
Trypan Blue	VWR	97063-702
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	BioLegend	423102