Methodenartikel

Efficiënte vascularisatie van nierorganoïden door intracelomische transplantatie in kippenembryo's

DOI:

10.3791/65090

⸱

17 februari 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo's. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen en kan worden gebruikt om deze processen op een efficiënte manier te bestuderen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nierorganoïden afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen bevatten nefronachtige structuren die tot op zekere hoogte lijken op die in de volwassen nier. Helaas wordt hun klinische toepasbaarheid belemmerd door het ontbreken van een functionele vasculatuur en bijgevolg beperkte rijping in vitro. De transplantatie van nierorganoïden in de celomische holte van kippenembryo's induceert vascularisatie door geperfuseerde bloedvaten, inclusief de vorming van glomerulaire haarvaten, en verbetert hun rijping. Deze techniek is zeer efficiënt, waardoor de transplantatie en analyse van grote aantallen organoïden mogelijk is. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de intracelomische transplantatie van nierorganoïden in kippenembryo's, gevolgd door de injectie van fluorescerend gelabeld lectine om de perfuseerde vasculatuur te kleuren en de verzameling getransplanteerde organoïden voor beeldvormingsanalyse. Deze methode kan worden gebruikt om organoïde vascularisatie en rijping te induceren en te bestuderen om aanwijzingen te vinden voor het verbeteren van deze processen in vitro en het verbeteren van ziektemodellering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC)-afgeleide nierorganoïden is aangetoond dat ze potentieel hebben voor ontwikkelingsstudies 1,2,3,4, toxiciteitsscreening 5,6 en ziektemodellering 5,7,8,9,10,11,12,13 . Hun toepasbaarheid voor deze en eventuele klinische transplantatiedoeleinden wordt echter beperkt door het ontbreken van een vasculair netwerk. Tijdens de embryonale nierontwikkeling interageren podocyten, mesangiale cellen en vasculaire endotheelcellen (EC's) om de ingewikkelde structuur van de glomerulus te vormen. Zonder deze interactie kan de glomerulaire filtratiebarrière, bestaande uit podocyten, het glomerulaire keldermembraan (GBM) en EC's, zich niet goed ontwikkelen14,15,16. Hoewel nierorganoïden in vitro sommige EC's bevatten, vormen deze geen goed vasculair netwerk en verminderen ze na verloop van tijd17. Het is dan ook niet verwonderlijk dat de organoïden onvolgroeid blijven. Transplantatie bij muizen induceert vascularisatie en rijping van de nierorganoïden 18,19,20,21. Helaas is dit een arbeidsintensief proces dat niet geschikt is voor de analyse van grote aantallen organoïden.

Kippenembryo's worden al meer dan een eeuw gebruikt om vascularisatie en ontwikkeling te bestuderen22. Ze zijn gemakkelijk toegankelijk, vereisen weinig onderhoud, missen een volledig functioneel immuunsysteem en kunnen zich normaal ontwikkelen na het openen van de eierschaal23,24,25,26. De transplantatie van organoïden op hun chorioallantoïsche membraan (CAM) heeft aangetoond dat het leidt tot vascularisatie27. De duur van de transplantatie op de CAM, evenals het niveau van rijping van het transplantaat, worden echter beperkt door CAM-vorming, die tot embryonale dag 7 duurt om te voltooien. Daarom is onlangs een methode ontwikkeld om nierorganoïden efficiënt te vasculariseren en rijpen door intracelomische transplantatie in kippenembryo's28. De celomische holte van kippenembryo's is sinds de jaren 1930 bekend als een gunstige omgeving voor de differentiatie van embryonale weefsels29,30. Het is vroeg in de embryonale ontwikkeling toegankelijk en maakt een relatief onbeperkte uitbreiding van het transplantaat in alle richtingen mogelijk.

Dit artikel schetst een protocol voor de transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in de celomische holte van dag 4 kippenembryo's. Deze methode induceert vascularisatie en verbeterde rijping van de organoïden binnen 8 dagen. Injectie van fluorescerend gelabelde lens culinaris agglutinine (LCA) voorafgaand aan het opofferen van de embryo's maakt visualisatie van geperfuseerde bloedvaten in de organoïden mogelijk door middel van confocale microscopie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens de Nederlandse wet was voor dit onderzoek geen goedkeuring van de dierenwelzijnscommissie nodig.

1. Voorbereiden van hiPSC-afgeleide nierorganoïden voor transplantatie

  1. Differentieer hiPSC's tot nierorganoïden met behulp van het protocol ontwikkeld door Takasato et al.4,18,31. Kweek de organoïden volgens dit protocol op polyester celkweekinzetstukken met 0,4 μm poriën (celkweekinzetstukken) tot dag 7 + 12 van differentiatie. Elke celkweekinzet bevat drie organoïden.
  2. Verwijder de organoïden uit de celkweekinzet.
    1. Maak een gat in het midden van het membraan van de celkweekinzet met een paar ontleedtangen. Maak met een ontleedschaar drie sneden in het membraan van het gat in het midden tot de rand van de celkweekinzet, snijdend tussen de organoïden. Dit zal resulteren in drie stukken membraan, elk met één organoïde bevestigd, die nog steeds verbonden zijn met de celkweekinzet aan hun buitenrand.
    2. Pak een van de stukjes membraan dicht bij de buitenrand vast met een tang en scheur het los van de celkweekinzet. Plaats het stukje membraan met de aangehechte organoïde in een petrischaaltje. Voeg een paar druppels Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) zonder calcium en magnesium (DPBS-/-) toe aan de organoïde om uitdroging te voorkomen. Herhaal dit voor de andere twee organoïden.
  3. Bisect de organoïden door hun membraan op hun plaats te houden met een tang en ze in tweeën te snijden met een dubbelzijdig roestvrijstalen scheermesje (een hele organoïde is te groot voor de celom om in dit stadium van ontwikkeling te accommoderen). Duw de twee organoïde helften voorzichtig van het membraan met een dura-dissector. Gooi het membraan weg en laat de organoïden in DPBS-/- tot transplantatie.
    OPMERKING: Bereid maximaal drie organoïden tegelijk voor transplantatie om stress voor de organoïden voorafgaand aan de transplantatie te voorkomen. Idealiter bereidt één persoon de organoïden voor, terwijl een ander de transplantatie uitvoert.

2. Kippenembryo's voorbereiden voor transplantatie

  1. Incubeer bevruchte witte leghorneieren. Start de incubatie van de eieren op nierorganoïde differentiatie dag 7 + 8 om de juiste timing van de transplantatie te garanderen.
    1. Leg de bevruchte witte leghorneieren (Gallus domesticus) horizontaal op een houder (figuur 1A; dag 0), markeert het midden van de naar boven gerichte zijde met een potlood.
      OPMERKING: Op maat gemaakte plastic houders of eierdozen kunnen worden gebruikt als houders om de eieren uit te broeden.
    2. Plaats de houder met de eieren in een bevochtigde broedmachine bij 38 ± 1 ºC (figuur 1A; dag 0).
    3. Incubeer de eieren gedurende 3 dagen en houd het waterbassin in de broedmachine gevuld.
  2. Maak een venster in de eierschaal op dag 3 van de incubatie.
    1. Plaats op dag 3 van de incubatie een klein stukje (~ 1 cm x 0,5 cm) transparante tape op de puntige punt van het ei (klein uiteinde). Maak een klein gaatje in de eierschaal in het midden van de transparante tape door erop te tikken met het scherpe uiteinde van een ontleedschaar.
    2. Steek een naald van 19 G op een spuit van 5 ml in het gat onder een hoek van 45 °, vermijd schade aan de dooierzak en zuig 2-3 ml albumine uit het ei om het embryo in het ei te laten zakken. Sluit het gat af met een tweede stuk (~1 cm x 0,5 cm) transparante tape.
    3. Plaats een groot stuk (~ 5 cm x 5 cm) transparante tape op de met potlood gemarkeerde, naar boven gerichte kant van het ei. Maak een gat in de eierschaal in het midden van de transparante tape door erop te tikken met het scherpe uiteinde van een ontleedschaar (figuur 1A; dag 3).
    4. Begin vanuit dit gat en knip een klein cirkelvormig venster in de eierschaal met een gebogen ontleedschaar. Kijk door dit venster om het embryo te lokaliseren en vergroot vervolgens het venster om de toegang tot het embryo te optimaliseren (figuur 1A; dag 3).
    5. Verwijder grote stukken eierschaal die mogelijk bovenop het embryo zijn gevallen met een tang. Verwijder kleinere stukjes door een paar druppels DPBS met calcium en magnesium (DPBS+/+) met een plastic transferpipet op het embryo te plaatsen en vervolgens de DPBS+/+ met de eierschaal in de pipet te zuigen.
    6. Voeg drie druppels DPBS+/+ aangevuld met 0,5% penicilline/streptomycine toe aan het ei met behulp van een plastic transferpipet.
    7. Sluit het venster zorgvuldig af met een groot stuk (~ 5 cm x 5 cm) transparante tape voordat u het ei terug in de broedmachine plaatst tot dag 4 van de incubatie, wanneer het embryo zich in Hamburger-Hamilton stadium 23-24 (HH 23-24) bevindt.
      OPMERKING: Het verzegelen van het raam is erg belangrijk om uitdroging en de dood van het embryo te voorkomen.
    8. Controleer de embryo's dagelijks op levensvatbaarheid door ze door de tape te bekijken (verwijder de tape niet om uitdroging te voorkomen). Tijdens deze eerste dagen van incubatie verandert de kleur van de eierdooier van helder naar matgeel bij embryodood. Gooi overleden embryo's weg.
    9. Houd het waterbassin in de incubator gevuld.

3. Intracelomische transplantatie op dag 4 van de incubatie

  1. Toegang krijgen tot de celomische holte
    1. Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar.
    2. Leg het ei onder een ontleedmicroscoop op een rubberen houder of eierdoos.
    3. Het kippenembryo bevindt zich nu in HH 23-24 en ligt aan de linkerkant, met de rechterkant naar de kijker gericht (figuur 1A; dag 4). Lokaliseer de rechtervleugel en beenknop van het embryo, omdat de celom toegankelijk is tussen deze twee ledemaatknoppen. Maak in het gebied tussen de rechtervleugel en de beenknop achtereenvolgens een opening in het vitellinemembraan, het chorion en het amnion, door ze vast te houden met twee paar ontleedtangen en ze voorzichtig in tegengestelde richtingen te trekken.
      OPMERKING: Het vitelline-membraan is het eerste membraan dat wordt aangetroffen na het openen van het ei en is in sommige gevallen al beschadigd na het maken van het venster op dag 3. Als het embryo wordt gedraaid, liggend aan de rechterkant met de linkerkant naar de kijker gericht (figuur 1A; dag 4), is het noodzakelijk om het om te draaien om transplantatie mogelijk te maken. Maak hiervoor een grote opening in de vitelline en het chorionmembraan en draai het embryo vervolgens voorzichtig rond met een tang.
    4. Controleer of er onbelemmerde toegang is tot de celomische holte: pak voorzichtig de rand van de lichaamswand tussen de vleugel en de ledemaatknop vast met een tang en trek deze iets naar de kijker toe. De celomische holte moet duidelijk zichtbaar zijn. Steek voorzichtig een stomp maar slank instrument (bijvoorbeeld een stompe wolfraamdraad in een microscalpelhouder) in de celomische holte.
      OPMERKING: Als het inbrengen van het stompe instrument in de celomische holte niet mogelijk is, betekent dit dat een of meer van de membranen niet goed zijn geopend.
  2. Transplantatie
    1. Plaats een halve organoïde in het ei bovenop de allantois met behulp van een dura-dissector.
    2. Gebruik een ontleedtang en pak voorzichtig de rand van de lichaamswand vast en trek deze iets naar de kijker toe om de opening naar de celom zichtbaar te maken.
      OPMERKING: Vermijd beschadiging van de bloedvaten in de lichaamswand.
    3. Beweeg de organoïde voorzichtig naar en door de opening in de lichaamswand in de celom met een stompe wolfraamdraad in een microscalpelhouder. Duw de organoïde iets craniaal om hem in de celom te plaatsen. Het is nu zichtbaar net achter de vleugelknop (figuur 1A; dag 4).
    4. Voeg drie druppels DPBS+/+ toe aan het ei met behulp van een plastic transferpipet.
    5. Sluit het venster zorgvuldig af met een groot stuk (~ 5 cm x 5 cm) transparante tape voordat u het ei terug in de broedmachine plaatst tot dag 12 van de incubatie (8 dagen na transplantatie).
    6. Blijf de embryo's dagelijks controleren op levensvatbaarheid door ze door de tape te bekijken (verwijder de tape niet om uitdroging te voorkomen). Gooi overleden embryo's weg.
      OPMERKING: Naarmate de embryo's en hun chorioallantoïsche membranen groeien, worden ze duidelijker zichtbaar door de tape. Een gebrek aan beweging door het embryo en ingeklapte of schaarse bloedvaten zijn een teken van embryodood.
    7. Controleer dagelijks het waterbassin in de incubator en houd het gevuld.

4. Injectie van fluorescerend gelabeld lectine

  1. Voorbereiding op injectie
    1. Maak glazen microinjectienaalden door glazen microcapillairen in een micropipettrekker te trekken met de volgende instellingen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200. Terwijl u door de ontleedmicroscoop kijkt, breekt u voorzichtig de uiteinden van de microinjectienaalden met behulp van een ontleedtang om een opening te maken.
      OPMERKING: De vereiste instellingen voor de micropipettrekker kunnen per machine verschillen.
    2. Monteer het injectiesysteem. Neem twee stukken siliconenslang van 38 cm en verbind ze met elkaar door er een filter van 0,2 μm tussen te plaatsen. Steek een mondstuk in het uiteinde van de buis die is verbonden met de filteruitlaat (siliconenbuis 1) en een connector aan het einde van de buis die is verbonden met de filterinlaat (siliconenbuis 2). Steek ten slotte de micro-injectienaald in de connector (figuur 1B).
    3. Verdun fluorescerend gelabelde lens culinaris agglutinine (LCA) met DPBS-/ - tot een concentratie van 2,5 mg ml-1 in een buis van 0,5 ml en draai gedurende ~ 30 s in een microcentrifuge om de aggregaten naar de bodem van de buis te verplaatsen.
    4. Pipetteer 20 μL LCA op een stuk parafilm.
    5. Zuig de 20 μL LCA van de parafilm in de microcapillaire naald van het geassembleerde injectiesysteem.
  2. Injectie
    1. Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar. Leg het ei onder een ontleedmicroscoop in een rubberen houder.
    2. Evalueer de vasculatuur en lokaliseer de aderen, die van de slagaders kunnen worden onderscheiden door hun iets helderdere rode kleur (figuur 1A; dag 12). Om de toegang tot de vasculatuur te verbeteren, vergroot u het venster zorgvuldig door te knippen met een gebogen ontleedschaar. Selecteer een ader voor injectie op basis van toegankelijkheid en grootte.
    3. Steek de punt van de microcapillaire naald in de geselecteerde ader onder een hoek van 0°-20º. Zorg ervoor dat de naald in de ader zit door de punt voorzichtig van links naar rechts te bewegen. Blaas voorzichtig en gestaag in het injectiesysteem om de LCA te injecteren (figuur 1A; dag 12).
      OPMERKING: Als de naald in de ader zich in de juiste positie bevindt, moet deze binnen de grenzen van de ader blijven.
    4. Plaats het ei gedurende 10 minuten terug in de broedmachine om de LCA te laten circuleren.
      OPMERKING: Het is niet nodig om het ei gedurende deze tijd met tape te verzegelen.

5. Het verzamelen van getransplanteerde organoïden op dag 12 van de incubatie

  1. Het kippenembryo opofferen
    1. Leg het ei in een rubberen houder op de bank. Knip de tape uit het raam met een gebogen ontleedschaar. Knip vervolgens door de membranen rond het embryo met een gebogen ontleedschaar.
      OPMERKING: Een ontleedmicroscoop is niet vereist voor deze stap.
    2. Schep het embryo met een geperforeerde lepel uit het ei en onthoofd het embryo onmiddellijk met een schaar. Plaats het lichaam van het embryo in een petrischaaltje onder de dissectiemicroscoop.
  2. Lokaliseren en verzamelen van organoïden
    1. Plaats het embryo op zijn rug in de petrischaal en spreid zijn ledematen.
    2. Open voorzichtig de buikwand van het embryo langs de lengteas met behulp van een tang.
    3. Lokaliseer de organoïde in het embryo. De organoïde wordt meestal gehecht aan de rechter leverkwab, hetzij aan de caudale punt of craniaal net onder de ribbenkast (figuur 1A; dag 12). Het is daarom aan te raden om eerst op deze locaties te gaan kijken.
    4. Zodra de organoïde is gelokaliseerd, verwijdert u deze uit het embryo door er met een microschaar omheen te knippen. Plaats de organoïde en het kippenweefsel dat er onvermijdelijk aan vastzit in een petrischaaltje onder de ontleedmicroscoop. Verwijder zoveel mogelijk kippenweefsel met een dubbelzijdig roestvrijstalen scheermesje.
    5. Verwerk de organoïde afhankelijk van de gewenste analyse.

6. Immunofluorescentiekleuring met hele montage

  1. Plaats een getransplanteerde organoïde in een plaat met 24 putten en fixeer gedurende 24 uur in 500 μL 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 °C. 3x wassen met DPBS-/-.
  2. Permeabiliseer en blokkeer de organoïde in 300 μL blokkerende oplossing (0,3% Triton-X in DPBS-/- met 10% ezelsserum) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.
  3. Bereid het primaire antilichaammengsel voor: verdun voor één organoïde primaire antilichamen NPHS1 (schaap-α-mens, verdunning van 1:100), CD31 (muis-α-mens, verdunning van 1:100) en LTL (biotine-geconjugeerd, verdunning van 1:300) in 300 μL blokkerende oplossing. Voeg het antilichaammengsel toe aan de organoïde en incubeer gedurende 72 uur bij 4 °C.
  4. Was 3x met 0,3% TritonX in DPBS-/-.
  5. Bereid de secundaire antilichaammix voor: voor één organoïde, verdun secundaire antilichamen ezel-α-schaap Alexa Fluor 647 (verdunning van 1:500), ezel-α-muis Alexa Fluor 488 (verdunning van 1:500) en streptavidin Alexa Fluor 405 (verdunning van 1:200) in 300 μL blokkerende oplossing. Voeg de secundaire antilichaammix toe aan de organoïde en incubeer gedurende 2-4 uur bij kamertemperatuur. Dek af met aluminiumfolie om blootstelling van de secundaire antilichamen aan licht te voorkomen.
  6. 3x wassen met DPBS-/-.
  7. Sluit de organoïde in ~ 30 μL montagemedium in een schaal met glazen bodem van 35 mm en laat een nacht drogen bij kamertemperatuur, bedekt met aluminiumfolie. Bewaren bij 4 °C.
  8. Beeld met behulp van een confocale microscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De methode en tijdlijn voor de differentiatie van hiPSC's naar nierorganoïden, incubatie van bevruchte kippeneieren, transplantatie van nierorganoïden, injectie van LCA en verzameling van de organoïden zijn samengevat in figuur 1A. Het is belangrijk om de timing van organoïde differentiatie en kippenei-incubatie te coördineren, waarbij differentiatie 15 dagen vóór de incubatie wordt gestart. De acties op dag 0, 3, 4 en 12 van de incubatie worden geïllustreerd met foto's onder de tijdlijn. Or...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit manuscript wordt een protocol voor intracelomische transplantatie van hiPSC-afgeleide nierorganoïden in kippenembryo's gedemonstreerd. Bij transplantatie worden organoïden gevasculariseerd door geperfuseerde bloedvaten die bestaan uit een combinatie van van menselijke organoïden afgeleide en van kippen afgeleide EC's. Deze zijn verspreid over de organoïde en dringen de glomerulaire structuren binnen, waardoor interactie tussen de EC's en podocyten mogelijk wordt. Eerder werd aangetoond dat dit leidt tot een verbet...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken George Galaris (LUMC, Leiden) voor zijn hulp bij de injectie van kippenembryo's. We erkennen de steun van Saskia van der Wal-Maas (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Conny van Munsteren (Afdeling Anatomie & Embryologie, LUMC, Leiden, Nederland), Manon Zuurmond (LUMC, Leiden, Nederland) en Annemarie de Graaf (LUMC, Leiden, Nederland). M. Koning wordt ondersteund door 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. Dit werk werd mede mogelijk gemaakt door het Leids Universiteits Fonds "Prof. Jaap de Graeff-Lingling Wiyadhanrma Fonds" GWF2019-02. Dit werk wordt ondersteund door de partners van Regenerative Medicine Crossing Borders (RegMedXB) en Health Holland, Topsector Life Sciences & Health. C.W. van den Berg en T.J. Rabelink worden ondersteund door The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine wordt ondersteund door Novo Nordisk Foundation grants (NNF21CC0073729).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µmWhatman10462200
35 mm glass bottom dishes MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettesSigma-AldrichA5177-5EABevat siliconen buizen, mondstuk en connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope LeicaTCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tipsHammacher KarlHAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tipsHammacher KarlHAMMHTC090-11
Dissecting microscope Wild Heerbrugg355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharpHammacher KarlHAMMHSB391-10
Donkey serumSigma-AldrichD9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-212-02dilutie 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647ThermoFisher ScientificA-21448dilutie 1:500
Double edged stainless steel razor bladesElectron Microsopy Sciences72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-)ThermoFisher Scientific14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+)ThermoFisher Scientific14190094
Egg cartons or custom made egg holders NANA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus) Drost Loosdrecht B.V.NA
IncubatorElbanton BVET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) BiotinylatedVector LaboratoriesB-1325dilutie 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mmHammacher KarlHAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filamentWorld Precision InstrumentsTW150F-3
Micropipette pullerSutter Instrument CompanyModel P-97We gebruiken de volgende instellingen: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws.EuronexiaL-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant ThermoFisher ScientificP36930
Olivecrona dura dissector 18 cm Reda41146-18
Parafilm Heathrow ScientificHS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mLThermoFisher Scientific15070063
Perforated spoon EuronexiaS-20-P
Petri dish 60 x 15 mm CELLSTAR628160
Plastic transfer pipettes ThermoFisher ScientificPP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibodyBD Biosciences555444dilutie 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA)Vector LaboratoriesRL-1042Dit product is onlangs stopgezet. Vectorlabs produceert nog steeds Dylight 649 gelabelde LCA (DL-1048-1) en fluoresceïne gelabelde LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibodyR&D systemsAF4269dilutie 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 GBD microlance301500
Streptavidin Alexa Fluor 405ThermoFisher ScientificS32351dilutie 1:200
Syringe 5 mLBD Emerald307731
Transparent tape Tesa4124Verkrijgbaar bij de meeste bouwmarkten
Triton XSigma-AldrichT9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia ThermoFisher Scientific010404.H2

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Taguchi, A., et al. Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2014).
  2. Morizane, R., et al. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
  3. Kim, Y. K., et al. Gene-edited human kidney organoids reveal mechanisms of disease in podocyte development. Stem Cells. 35 (12), 2366-2378 (2017).
  4. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  5. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communications. 9 (1), 5167(2018).
  6. Vanslambrouck, J. M., et al. Enhanced metanephric specification to functional proximal tubule enables toxicity screening and infectious disease modelling in kidney organoids. Nature Communications. 13 (1), 5943(2022).
  7. Tanigawa, S., et al. Organoids from nephrotic disease-derived iPSCs identify impaired NEPHRIN localization and slit diaphragm formation in kidney podocytes. Stem Cell Reports. 11 (3), 727-740 (2018).
  8. Forbes, T. A., et al. Patient-iPSC-derived kidney organoids show functional validation of a ciliopathic renal phenotype and reveal underlying pathogenetic mechanisms. American Journal of Human Genetics. 102 (5), 816-831 (2018).
  9. Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6, 8715(2015).
  10. Cruz, N. M., et al. Organoid cystogenesis reveals a critical role of microenvironment in human polycystic kidney disease. Nature Materials. 16 (11), 1112-1119 (2017).
  11. Gupta, N., et al. Modeling injury and repair in kidney organoids reveals that homologous recombination governs tubular intrinsic repair. Science Translational Medicine. 14 (634), eabj4772(2022).
  12. Hiratsuka, K., et al. Organoid-on-a-chip model of human ARPKD reveals mechanosensing pathomechanisms for drug discovery. Scencei Advances. 8 (38), eabq0866(2022).
  13. Dorison, A., et al. Kidney organoids generated using an allelic series of NPHS2 point variants reveal distinct intracellular podocin mistrafficking. Journal of the American Society of Nephrology. , (2022).
  14. Eremina, V., et al. Glomerular-specific alterations of VEGF-A expression lead to distinct congenital and acquired renal diseases. The Journal of Clinical Investigation. 111 (5), 707-716 (2003).
  15. Kitamoto, Y., Tokunaga, H., Tomita, K. Vascular endothelial growth factor is an essential molecule for mouse kidney development: glomerulogenesis and nephrogenesis. The Journal of Clinical Investigation. 99 (10), 2351-2357 (1997).
  16. Sison, K., et al. Glomerular structure and function require paracrine, not autocrine, VEGF-VEGFR-2 signaling. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (10), 1691-1701 (2010).
  17. Ryan, A. R., et al. Vascular deficiencies in renal organoids and ex vivo kidney organogenesis. Developmental Biology. 477, 98-116 (2021).
  18. vanden Berg, C. W., et al. Renal subcapsular transplantation of PSC-derived kidney organoids induces neo-vasculogenesis and significant glomerular and tubular maturation in vivo. Stem Cell Reports. 10 (3), 751-765 (2018).
  19. Sharmin, S., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived podocytes mature into vascularized glomeruli upon experimental transplantation. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1778-1791 (2016).
  20. Bantounas, I., et al. Generation of functioning nephrons by implanting human pluripotent stem cell-derived kidney progenitors. Stem Cell Reports. 10 (3), 766-779 (2018).
  21. vanden Berg, C. W., Koudijs, A., Ritsma, L., Rabelink, T. J. In vivo assessment of size-selective glomerular sieving in transplanted human induced pluripotent stem cell-derived kidney organoids. Journal of the American Society of Nephrology. 31 (5), 921-929 (2020).
  22. Asai, R., Bressan, M., Mikawa, T. Avians as a model system of vascular development. Methods in Molecular Biology. 2206, 103-127 (2021).
  23. Jankovic, B. D., et al. Immunological capacity of the chicken embryo. I. Relationship between the maturation of lymphoid tissues and the occurrence of cell-mediated immunity in the developing chicken embryo. Immunology. 29 (3), 497-508 (1975).
  24. Alkie, T. N., et al. Development of innate immunity in chicken embryos and newly hatched chicks: a disease control perspective. Avian Pathology. 48 (4), 288-310 (2019).
  25. Rawles, M. E. Transplantation of normal embryonic tissues. Annalls of the New York Academy of Sciences. 55 (2), 302-312 (1952).
  26. Rawles, M. E. The development of melanophores from embryonic mouse tissues grown in the coelom of chick embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences. 26 (12), 673-680 (1940).
  27. Garreta, E., et al. Fine tuning the extracellular environment accelerates the derivation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Materials. 18 (4), 397-405 (2019).
  28. Koning, M., et al. Vasculogenesis in kidney organoids upon transplantation. NPJ Regenerative Medicine. 7 (1), 40(2022).
  29. Hamburger, V. Morphogenetic and axial self-differentiation of transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. Journal of Experimental Zoology. 77 (3), 379-399 (1938).
  30. Dossel, W. E. New method of intracelomic grafting. Science. 120 (3111), 262-263 (1954).
  31. Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
  32. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Developmental Dynamics. 195 (4), 231-272 (1992).
  33. Aleksandrowicz, E., Herr, I. Ethical euthanasia and short-term anesthesia of the chick embryo. ALTEX. 32 (2), 143-147 (2015).
  34. ACUC. Guideline: The Use and Euthanasia Procedures of Chicken/Avian Embryos. , Available from: https://www.cpp.edu/research/research-compliance/iacuc/docs/iacuc-guidelines-on-euthanasia-of-chicken-and-embryos.pdf (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Vascularisatie van organo denmenselijke ge nduceerde pluripotente stamcellenglomerulaire capillairengeperfuseerd vaatstelselimmunofluorescentie imagingendotheelcellenziekte modellering

Gerelateerde artikelen