High-throughput contractiele metingen van hydrogel-ingebedde intacte muisspiervezels met behulp van een op optica gebaseerd systeem

Samenvatting

De skeletspierfunctie kan worden beoordeeld door de contractiliteit van geïsoleerde spiervezels te kwantificeren, traditioneel met behulp van bewerkelijke benaderingen met een lage doorvoer. Hier beschrijven we een op optica gebaseerde, high-throughput methode om de contractiliteit van hydrogel-ingebedde spiervezels te kwantificeren. Deze aanpak heeft toepassingen voor geneesmiddelenscreening en therapeutische ontwikkeling.

Samenvatting

In vitro celkweek is een krachtig hulpmiddel om cellulaire processen te beoordelen en therapeutische strategieën te testen. Voor skeletspieren omvatten de meest voorkomende benaderingen het differentiëren van myogene voorlopercellen in onrijpe myotubes of de korte termijn ex vivo cultuur van geïsoleerde individuele spiervezels. Een belangrijk voordeel van ex vivo cultuur ten opzichte van in vitro is het behoud van de complexe cellulaire architectuur en contractiele kenmerken. Hier beschrijven we een experimenteel protocol voor de isolatie van intacte flexor digitorum brevis spiervezels van muizen en hun daaropvolgende ex vivo cultuur. In dit protocol zijn spiervezels ingebed in een op fibrine gebaseerde en keldermembraanmatrixhydrogel om de vezels te immobiliseren en hun contractiele functie te behouden. Vervolgens beschrijven we methoden om de contractiele functie van de spiervezel te beoordelen met behulp van een op optica gebaseerd, contractiliteitssysteem met hoge doorvoer. De ingebedde spiervezels worden elektrisch gestimuleerd om contracties te induceren, waarna hun functionele eigenschappen, zoals sarcomeerverkorting en contractiele snelheid, worden beoordeeld met behulp van op optica gebaseerde kwantificering. Het koppelen van spiervezelcultuur aan dit systeem maakt high-throughput testen van de effecten van farmacologische middelen op de contractiele functie en ex vivo studies van genetische spieraandoeningen mogelijk. Ten slotte kan dit protocol ook worden aangepast om dynamische cellulaire processen in spiervezels te bestuderen met behulp van live-cell microscopie.

Inleiding

Vooruitgang in in vitro celkweektechnieken heeft nieuwe mogelijkheden geopend om weefselregeneratieve vermogens, pathofysiologische cellulaire mechanismen en daaropvolgende therapeutische strategieën te bestuderen, allemaal met behulp van zoogdierweefsels onder goed gecontroleerde omstandigheden ^1,2,3. Het gebruik van in vitro kweeksystemen is goed ingeburgerd binnen het spieronderzoeksveld ^4,5. Over het algemeen worden in vitro gedifferentieerde onrijpe myotubes van myogene voorlopercellen gebruikt 2,6,7,8. Hoewel er vooruitgang is geboekt in het differentiatieprotocol om meer volwassen spiervezels^{te genereren 9}, beperkt hun onvolwassenheid nog steeds de vertaling van de bevindingen naar een in vivo setting ^1,10. Een centraal probleem op het gebied van spierbiologie is het onvermogen van in vitro gedifferentieerde myobuizen om de complexe intracellulaire structuren, celsignaleringsprocessen en extracellulaire interacties die worden waargenomen in inheems spierweefsel volledig te belichamen en, belangrijker nog, de contractiele krachten geproduceerd door spiervezels samen te vatten 1,2,10,11,12 . Bovendien resulteert de ongecoördineerde samentrekking van myotubes tijdens het differentiatieproces vaak in spontane onthechting van de kweekschalen, waardoor de contractiele beoordeling van in vitro gedifferentieerde myotubes uitdagend is en beperkt tot kwalitatieve of semi-kwantitatieve evaluatie 8,11,12,13. Deze beperkingen vereisen vaak regelmatige in vivo experimenten met dieren, vooral als spiercontractiliteit een primaire experimentele uitkomst is¹.

Een alternatief voor het kweken in vitro-gedifferentieerde myotubes is de ex vivo kweek van geïsoleerde volwassen spiervezels ^1,14. Tijdens ex vivo kweek wordt ontwikkelingsrijp spierweefsel uit het lichaam weggesneden, gevolgd door eencellige isolatie voor kweek in laboratoriumomstandigheden ^1,14. De geïsoleerde volwassen spiervezels behouden hun complexe cellulaire structuren waargenomen in het inheemse weefsel^14,15, en deze methode opent de mogelijkheid voor directe interventies, zoals genetische manipulatie en medicijnscreening^, in een goed gedefinieerde en controleerbare kweekomgeving. Een van de eerste rapporten over skeletspiervezelisolatie en ex vivo cultuur dateert uit de jaren 1930; De opbrengst van levensvatbare vezels uit dit protocol was echter laag¹⁶. Met de voortdurende optimalisatie van de isolatieprocedure en kweekomstandigheden is nu een significante verbetering van de hoeveelheid levensvatbare en functionele spiervezels mogelijk 14,15,17,18,19. Een dergelijke verbetering van de kweekomstandigheden omvat het coaten van kweekschalen met extracellulaire matrixeiwitten om de hechting van de geïsoleerde spiervezels op de kweekschaal^{te bevorderen 15,18,20}. Meestal wordt lamininecoating gebruikt, omdat laminine een van de meest voorkomende elementen is in de extracellulaire matrix van spieren^20,21. De optimalisatie van de isolatieprocedure in combinatie met de coating van de kweekschalen hebben het spieronderzoeksveld in staat gesteld om geïsoleerde levensvatbare spiervezels met intacte cellulaire architectuur en contractiele functionaliteit gedurende korte tijd in cultuur te houden 1,15,18,22.

De meest conventionele benadering die binnen het spierveld wordt gebruikt om kracht en contractiele capaciteiten te meten, is om individuele spiervezels te monteren tussen een lengtedrivermotor en een krachtopnemer^23,24. Over het algemeen worden de spiervezels die worden gebruikt voor deze motoraangedreven opstellingen ontleed uit snap-frozen of vers weefsel, gevolgd door permeabilisatie of "skinning", wat externe calciumactivering mogelijk maakt, waarbij verschillende calciumconcentraties worden gebruikt om spiervezelcontractie te induceren²⁴. Hoewel deze methode de gouden standaard is voor contractiele metingen van spiervezels, kan slechts één spiervezel tegelijk worden gemeten, waardoor deze techniek een arbeidsintensieve en tijdrovende procedure is²⁵. Bovendien verstoort de isolatie- en skinningprocedure van de spiervezels de verschillende structuren die betrokken zijn bij excitatie-contractiekoppeling (d.w.z. calciumafgifte en daaropvolgende heropname in het sarcoplasmatisch reticulum), waardoor de studie van ontspanningskinetiek en eventuele ziekten die dit proces kunnen beïnvloeden niet mogelijk is^26,27. Een alternatief voor het gevilde vezelpreparaat is het gebruik van mechanische dissectie om intacte spiervezels te isoleren, waarbij contractiele krachten kunnen worden gemeten als reactie op elektrische activering²⁸; Deze aanpak is echter technisch uitdagend en zeer tijdrovend, wat resulteert in metingen met een lage doorvoer. Ten slotte worden in zowel gevilde als intacte preparaten de spiercellen volledig verwijderd uit de extracellulaire omgeving tijdens contractiele metingen 24, waardoor het onderzoek naar het effect van de extracellulaire matrixsamenstelling / stijfheid op spiervezelcontractie onmogelijk is²⁴. Als gevolg hiervan is de ontwikkeling van alternatieve methoden nodig om spiervezelcontractiliteitsmetingen van geïsoleerde intacte spiervezels op een high-throughput-manier mogelijk te maken, terwijl de verbinding tussen spiervezels en de extracellulaire matrix opnieuw wordt gecreëerd.

Onlangs is een nieuwe op optica gebaseerde benadering voor spiervezelcontractiliteitsmetingen met hoge doorvoer ontwikkeld²⁹. Dit op optica gebaseerde systeem meet de periodiciteit van sarcomeren om de sarcomeerlengte tijdens contractie te beoordelen met behulp van high-speed imaging. Binnen dit systeem blijven de cellen op hun plaats in de kweekschaal terwijl de optica wordt verplaatst, waardoor de tijd die nodig is tussen de metingen van meerdere cellen wordt geminimaliseerd²⁹. Een groot voordeel van het gebruik van deze op optica gebaseerde benadering met hoge doorvoer is dat het kweekomstandigheden kan ontwikkelen die vergelijkbaar zijn met die van het inheemse weefsel. Een benadering die wordt gebruikt om inheemse in vivo omstandigheden na te bootsen, is het inbedden van cellen in hydrogels³⁰. Typisch, een hydrogel is een visco-elastisch materiaal dat in staat is om zijn volume en vorm te behouden, en hydrogels hebben de eigenschappen van zowel vaste als vloeibare materialen³¹. Het vaste deel bestaat uit polymeerketens die met elkaar verbonden zijn, waardoor een structuur ontstaat die lijkt op een netto^30,31. De materiaaleigenschappen van hydrogels kunnen worden afgestemd om de matrixafzetting van spieren na te bootsen^30,31. De combinatie van een op optica gebaseerd systeem met hoge doorvoer en cellen ingebed in hydrogels opent dus nieuwe mogelijkheden om de effecten van extracellulaire matrixsamenstelling en mechanische eigenschappen op spiervezelfunctionaliteit te beoordelen.

Het algemene doel van dit artikel is om 1) de methodologie te beschrijven voor de enzymatische isolatie en ex vivo cultuur van spiervezels in omstandigheden die de inheemse weefselomgeving nabootsen en 2) spiervezelcontractiliteit te beoordelen met behulp van een high-throughput benadering. We beschrijven een gedetailleerde methodologie om eenvoudig een groot aantal enkele spiervezels te isoleren uit de flexor digitorum brevis (FDB) spier met behulp van enzymatische spijsvertering. Daarnaast beschrijven we een techniek om de geïsoleerde spiervezels in te bedden in een op fibrine gebaseerde hydrogel om de oorspronkelijke omgeving van de spieren na te bootsen en de levensvatbaarheid en contractiliteit van de spiervezel te verbeteren. Vervolgens schetsen we een high-throughput methode voor het meten van levende spiervezelcontracties in vitro met behulp van dit recent ontwikkelde systeem. Een bijkomend voordeel van deze inbeddingsprocedure is de immobilisatie van vezels tijdens contractie, wat de signaal-ruisverhouding van deze metingen kan verbeteren. Deze gel-inbeddingsmethode is van toepassing op zowel inkapselingsprocedures met één polymeer als composietgel, waardoor de beoordeling van de effecten van extracellulaire matrixsamenstelling op spiervezelcontractiliteit wordt vergemakkelijkt.

Protocol

Voor de ex vivo contractiestudies is postmortemweefsel verkregen van dieren die zijn geofferd voor andere goedgekeurde onderzoeksprojecten en/of fokoverschotten van de Vrije Universiteit in overeenstemming met de Richtlijn van de Europese Raad (2010/63/EU) met toestemming van de Wet op het Dieronderzoek.

1. Materiaalvoorbereiding

1. Bereid pipetten voor op trituratie (bewaar in 70% ethanol in een stroomkast tot gebruik). Snijd de uiteinden van twee P1.000-tips om verschillende gatgroottes te maken; Zorg ervoor dat het gat net groot genoeg is om de spier door te laten zonder de pipet te blokkeren. Laat de gesneden uiteinden door een vlam lopen zodat ze glad worden.
2. Bereid Sylgard-gerechten zoals elders beschreven³² en steriliseer van tevoren met 70% ethanol voor gebruik bij het vastzetten van de poot en spier tijdens isolatie.
   OPMERKING: Sylgard gerechten kunnen worden hergebruikt na grondige reiniging met gedeïoniseerd water en 70% ethanol.
3. Bereid de volgende oplossingen voorafgaand aan de isolatieprocedure: dissectiemedium, fibrinekweekmedium en spierverteringsmedium (zie tabel 1).
   OPMERKING: Het spierverteringsmedium moet worden gefilterd met behulp van een filter van 0,22 μm. Alle bereide oplossingen moeten gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik in een standaard celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 worden gebalanceerd.
4. Bereid na de spiervertering de volgende oplossingen voor om de hydrogel te gieten: celmix en matrixmengsel (zie tabel 2). Combineer de celmix en matrixmix in een verhouding van 1:1 voor een uiteindelijke fibrineconcentratie van 2,5 mg/ml.
   OPMERKING: Bereid de matrix voor op ijs en gebruik voorgekoelde pipetpunten om voortijdige polymerisatie van de keldermembraanmatrix te voorkomen. De trombine:fibrinogeenverhouding van 1:10 (eenheden per mg fibrinogeen) die hier wordt gebruikt, is geoptimaliseerd voor een polymerisatietijd van 30 minuten. Als de gel binnen 30 minuten polymeriseert, moet een lagere trombineconcentratie worden gebruikt. Zie de discussie voor meer informatie.

2. FDB spierdissectie

1. Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie. Desinfecteer de achterpoot met 70% alcohol.
2. Snijd het onderste achterbeen boven de enkel af. Snijd de huid aan de dorsale kant van de voet open richting de tenen.
   OPMERKING: Snijd het onderste achterbeen bij het enkelgewricht af om schade aan de spieren van de onderste ledematen en het scheenbeen te voorkomen als ze later nodig zijn.
3. Pel de huid voorzichtig naar de tenen. Pas op dat je de spier niet beschadigt. De FDB is de meest oppervlakkige spier aan de ventrale kant van de voet.
4. Plaats de ontlede voet in een schaal met 10 ml voorverwarmd dissectiemedium bij 37 °C. Pin de voet door de huid die nog aan de tenen vastzit en pin het onderbeen voorbij de enkel.
5. Verwijder voorzichtig het bindweefsel bovenop de spier. Snijd de pees bij de hiel door en til de spier op bij zijn pees.
6. Snijd naast en onder de spier door het bindweefsel. Blijf snijden totdat de teenpezen bloot komen te liggen.
7. Wanneer de helft van de lengte van de drie pezen bloot ligt, snijdt u de pezen door en laat u de spier los van de voet. OPTIONEEL: Knip de vierde laterale pees en zijn spiervezels af.
8. Reinig het bindweefsel van de spier en breng het over naar een buis met voorverwarmd dissectiemedium.

3. FDB spiervertering

1. Bereid het spierverteringsmedium voor volgens tabel 1.
2. Breng de FDB-spieren over naar het spierverteringsmedium met behulp van een serologische pipet. Incubeer in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂ gedurende 80 min.
   OPMERKING: Deze tijd moet worden geoptimaliseerd voor elke collagenasebatch. De spijsvertering is voltooid wanneer de spier begint te rafelen en er vergroot uitziet. Zie de discussie voor de optimalisatie van de verteringstijd.
3. Breng na de spijsvertering de spier over in een buis van 15 ml met 3 ml dissectiemedium en incubeer gedurende 30 minuten vóór de trituratie.

4. FDB spiertrituratie en zwaartekracht sedimentatie

1. Triturate de spier met behulp van de eerder voorbereide trituratietips (stap 1.1) door de spier te pipetteren, gaande van de grootste naar de kleinste maat. Als deze stap langer dan 5 minuten duurt, plaats de spier dan 5 minuten in de couveuse om hem te laten rusten.
2. Triturate totdat de spiervezels grotendeels van de pees zijn afgekomen en de pees door een P200-punt kan gaan. Verwijder de pezen.
3. Voeg de gedissocieerde FDB-vezels toe aan een buis van 15 ml met 10 ml dissectiemedium en laat de vezels 20 minuten in de couveuse bezinken. Observeer de gevormde pellet.
4. Optioneel: Verwijder 10 ml medium van de bovenkant en herhaal stap 4.3. Deze stap vergemakkelijkt de verwijdering van overtollig puin en bijbehorende mononucleated cellen.

5. FDB-vezelinbedding

1. Verwijder voorzichtig al het medium van de bovenkant van de vezelkorrel. Resuspendeer de cellen in 875 μL celmix per FDB-spier (op ijs).
   OPMERKING: Eén FDB-spier levert genoeg vezels op voor zeven putten van een plaat met 24 putten. Deze dichtheid kan worden aangepast aan de behoeften van het experiment. Het volgende gelvolume (250 μL) is geoptimaliseerd voor een 24-well-formaat, maar kan dienovereenkomstig worden geschaald voor andere formaten.
2. Aliquot 125 μL van de cel mengen in enkele microcentrifugebuizen.
3. Voeg één put per keer 125 μL matrixmengsel toe aan een celsuspensie aliquot en meng door voorzichtig op en neer te pipetteren, waardoor de vorming van bellen wordt vermeden.
4. Breng de uiteindelijke mix onmiddellijk over in een put.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat u het mengsel in het midden van de put pipet. Herhaal stap 5.3 en stap 5.4 voor elke put.
5. Stol de gels in een incubator gedurende 30-45 minuten. Voeg na het stollen voorzichtig het kweekmedium toe aan de putten.
   OPMERKING: Snel pipetteren kan de hydrogel losmaken van de put. Vanaf dit punt kunnen de vezels worden gestimuleerd en gemeten. Onze ervaring is echter dat het laten aanpassen van de vezels aan de kweekomstandigheden gedurende 24 uur de vezelcontractiliteit kan verbeteren.
6. Voor langere cultuur vult u het kweekmedium aan met een halve verandering om de 2 dagen. Verwijder hiervoor de helft van het kweekmedium en vervang het door een gelijke hoeveelheid vers medium.

6. Op optica gebaseerde contractiele metingen

1. Schakel het op optica gebaseerde contractiele meetsysteem (zie de materiaaltabel), de fluorescentielamp, de elektrische celpacer en de computer in. Stel de elektrische stimulator in op 1,0 Hz, 10,0 V en een pulsduur van 5,00 ms om de geïsoleerde spiervezels te stimuleren.
2. Plaats de plaat in het meetsysteem. Sluit de pacer aan op de pacing insert en steek deze in de kweekplaat.
3. Open het programma IonWizard en open een nieuw bestand door te klikken op Bestand (linksboven in het scherm) | Nieuw.
4. Controleer of het programma op het juiste experiment, Skeletal Sarcomere, is door op Nieuw | Experimenten verzamelen. Als u het experiment wilt wijzigen, klikt u op het gewenste experiment en drukt u op toevoegen. Pas voor het skeletsarcomeerexperiment de volgende instellingen toe: Sarc 20x, Gemiddelde lijnen, enkele FFT, 250 Hz bemonsteringsfrequentie en een acquisitietijd van 10 s.
   OPMERKING: De experimentele instellingen moeten voorafgaand aan het experiment worden voorbereid. De instellingen kunnen worden aangepast aan de behoeften van het experiment.
5. Stel de temperatuur van het meetsysteem in op 25 °C. Klik op open cell finder onder de werkbalk en wacht tot er een nieuw scherm verschijnt. Selecteer rechtsboven in dit scherm het plaattype en actieve putten.
   OPMERKING: De metingen worden uitgevoerd bij 25 °C om de contractiesnelheid van de snel trillende FDB-spiervezels te verminderen, waardoor ondersampling van de contractiele gebeurtenis wordt voorkomen.
6. Breng de vezels in beeld door de schuifbalk voor scherpstelling aan te passen. U kunt ook de W- en S-toets gebruiken voor deze scherpstelfunctie.
7. Schakel de pacing in om de elektrische stimulatie te starten. Merk op dat de vezels nu beginnen te trillen.
   OPMERKING: Als er geen vezels trillen, zorg er dan voor dat alle draden zijn aangesloten en dat de pacer volledig is ondergedompeld. Als er hierna nog steeds geen beweging is, reageren de vezels mogelijk niet als gevolg van overdigestie of overmatige schade tijdens trituratie.
8. Focus het meetgebied op het uiteinde van een vezel, zodat de sarcomeren verticaal lopen. Zorg ervoor dat de sarcomeren scherp zijn. Als de sarcomeren scherp zijn, is een enkele piek zichtbaar in de werkbalk. Tijdens de krimp zal deze piek naar rechts bewegen naarmate het sarcomeer korter wordt.
   OPMERKING: Het paarse meetgebied kan worden aangepast voordat het experiment wordt gestart. Om een goede meting te garanderen, neemt u ~ 20 sarcomeren op. Als deze piek tijdens de contractie van vorm verandert, kan dit erop wijzen dat het sarcomeer tijdens de contractie verduisterd of onscherp is, wat ruis introduceert.
9. Start het experiment door op start te klikken in de werkbalk. Druk op de Q-toets om een meting te starten en wacht tot het programma 10 contractietransiënten meet. Als meer dan vier transiënten er ruisvrij uitzien, accepteert u de meting door op de Z-toets te drukken. Als de transiënten te veel ruis bevatten, weigert u de meting door op de X-toets te drukken.
10. Meet tussen de 10 vezels en 20 vezels per aandoening. De locaties van de eerder gemeten vezels blijven behouden.
11. Optioneel: Voeg verbindingen toe, waarna vezels op dit punt opnieuw kunnen worden gemeten.
12. Wanneer het experiment is voltooid, drukt u op de stopknop in de onderste werkbalk om het celzoekervenster te sluiten. Sla het bestand op en start een nieuw bestand.
13. Om de gegevens te analyseren, opent u het programma "Cytosolver desktop". Klik op importeren en selecteer de bestanden die u wilt analyseren.
14. Nadat het programma de analyse heeft voltooid, zoekt u naar blauwe, rode en grijze pieken. De blauwe pieken zijn transiënten die door het programma worden geaccepteerd. De rode pieken zijn transiënten die door het programma worden afgewezen en de grijze pieken zijn transiënten die door de gebruiker worden afgewezen.
    OPMERKING: De afwijzingscriteria kunnen worden aangepast in de analysesoftware. Over het algemeen worden waarden afgewezen als ze een maximale afgeleide limiet overschrijden en transiënten worden afgewezen op basis van curve fit R^2-waarden van <0,95.
15. Klik op exporteren. Vink de volgende vakjes aan: Gemiddelde transiënte gegevens en exporteren naar Excel.
16. Als u klaar bent, schakelt u alle machines uit. Haal de kweekplaat eruit en gooi hem weg. Reinig de pacer-elektroden met gedeïoniseerd water en 70% ethanol.

Resultaten

Met behulp van dit protocol werden enkele FDB-spiervezels geïsoleerd en ingebed in hydrogel. Een overzicht van de spierdissectieprocedure is weergegeven in figuur 1. De FDB-spier wordt blootgesteld met intacte pezen en losgesneden van de fascia. Het onderhouden van de pezen van de spieren als fixatiepunten minimaliseert potentiële schade aan de spiervezels tijdens de isolatieprocedure. Overtollig bindweefsel kan worden afgesneden om puin en de groei van secundaire celtypen te verminderen. Zodra de spier voldoende is weggesneden en gereinigd, wordt de spier enzymatisch verteerd met behulp van collagenase en worden enkele spiervezels vrijgegeven door trituratie voordat de geïsoleerde cellen in hydrogels worden ingebed. De isolatie van FDB-spiervezels zorgt voor relatief korte spiervezels, die het voordeel hebben dat ze gemakkelijk te manipuleren zijn. Vanwege hun grootte kunnen FDB-spiervezels veilig worden gepipetteerd zonder door klitten veroorzaakte schade en zijn ze gemakkelijk ingebed in een hydrogel. Omdat enkelvoudige spiervezels niet goed hechten aan kweekplaten, zorgt het inbedden van de vezels in hydrogel ervoor dat de vezels blijven zitten tijdens de celkweek en contractiele metingen. Bovendien zorgt de toevoeging van een keldermembraanmatrix aan de fibrinegel voor interacties tussen de spiervezels en de matrix, waardoor de inheemse in vivo omgeving wordt nagebootst. Geïsoleerde enkele spiervezels kunnen worden gemanipuleerd en gedurende enkele dagen na isolatie in cultuur worden gehouden. In figuur 2 wordt een voorbeeld getoond van geïsoleerde FDB-vezels ingebed in een hydrogelmatrix. De gezonde vezels hebben zichtbare sarcomeren en zijn recht uitgerekt (blauwe pijl), terwijl de gebogen vezels meestal beschadigd of niet levensvatbaar zijn (gele pijl) en moeten worden uitgesloten van de metingen. Hypercontracted vezels verschijnen als donkere bolvormige objecten in de matrix (rode pijl). Als de isolatieprocedure succesvol was, zou het aandeel gezonde vezels ~ 75% moeten zijn. Een groter deel van de hypercontracted vezels duidt meestal op schade tijdens de isolatieprocedure. Het membraan van de spiervezels kan worden beschadigd door overdigestie van de spier of schade aan de vezels tijdens trituratie. Trituratieschade treedt vooral op als de spier onderverteerd is en dus niet gemakkelijk uit elkaar valt.

De vezelfunctionaliteit en levensvatbaarheid werden beoordeeld door middel van contractiele metingen van de spiervezels met behulp van een op optica gebaseerd, high-throughput contractiel meetsysteem. Het systeem voert verschillende parameters uit, zoals de sarcomeerlengte, het percentage sarcomeerverkorting, de contractiele snelheid en de relaxatiesnelheid. Met behulp van het contractiele meetsysteem kan sarcoomcontractie per spiervezel worden gemeten. Figuur 3 toont voorbeelden van spiervezelcontracties gemeten met behulp van het meetsysteem. Uit een enkele contractietransiënt worden de volgende parameters verkregen: sarcomeerlengte bij baseline, contractieduur, sarcomeerlengte bij maximale contractie en relaxatieduur (figuur 3A). Deze parameters worden gebruikt om het percentage sarcomeerverkorting, contractie en relaxatiesnelheden te berekenen. Gemiddelde snelheidswaarden kunnen indien nodig ook worden berekend uit de duur en absolute verkortingswaarden. Een geldige contractiemeting heeft een rechte basislijn, gevolgd door een dip naar de piek en een terugkeer naar de basislijn (figuur 3A). Ruis, ongerichte sarcomeren of afwijkende beweging van de vezel kunnen de meettransiënt beïnvloeden (figuur 3B, C), en deze metingen kunnen handmatig worden weggegooid of worden afgewezen door het analyseprogramma. In deze benadering is de duidelijke visualisatie van de sarcomeren belangrijk voor het meten van de weeën; Dus alles wat de zichtbaarheid van de sarcomeren vermindert, kan ruis veroorzaken. Dit kan gebeuren als er beweging van het sarcomeer buiten het brandpuntsvlak is tijdens de samentrekking. Metingen waarbij een reeks contracties in snelheid of diepte verschilt, moeten ook uit de dataset worden uitgesloten.

De contractiele gegevens van enkele spiervezels die met dit systeem zijn verkregen, kunnen worden gebruikt om verschillende kweekomstandigheden te vergelijken. De effectiviteit van het systeem wordt geïllustreerd in figuur 4. Hier hebben we de samentrekkingen van FDB-spiervezels gemeten in zowel 2D (laminine-gecoate kweekplaten) als 3D (fibrinehydrogel) cultuurformaten. Een hoger percentage bruikbare metingen werd bereikt in 3D, omdat het inbedden van de vezels in de gel voorkwam dat laterale beweging en andere bewegingsartefacten de meting beïnvloedden (figuur 4A). Het inbedden van de vezels had geen significant effect op de sarcomeerverkorting of de maximale contractiesnelheidswaarden in vergelijking met de 2D-gekweekte vezels (figuur 4B). Om te illustreren hoe verschillende matrices de samentrekking van FDB-spiervezels beïnvloeden, vergeleken we deze fibrinehydrogel ook met een zuivere keldermembraanmatrix (4 mg / ml) (figuur 4C). De verminderde contractiliteit waargenomen in de zuivere keldermembraanmatrix was waarschijnlijk te wijten aan de stijfheid van de gel of verhoogde cel-matrixinteracties. Fibrineconcentraties tot 7 mg / ml zijn ook getest, zonder significant effect op contractiele snelheid en verkorting (ongepubliceerde gegevens). Het gebruik van deze op fibrine gebaseerde hydrogel zorgt voor minimale interferentie met contractiele parameters.

Figuur 1: Een overzicht van de FDB spierdissectie procedure. (A) De achterpoot wordt boven de enkel gesneden (rode stippellijn) en (B) de huid wordt verwijderd door langs de bovenkant van de voet langs de blauwe stippellijn te snijden. (C) De voet wordt vastgepind door de enkel en de huid bij de tenen. (D) Microscopisch beeld van de blootgestelde spier en het omliggende bindweefsel. De fascia is zichtbaar als een witte ondoorzichtige laag waar de vasculatuur doorheen loopt. (E) De fascia wordt uit de spier verwijderd en de pees wordt langs de rode stippellijn doorgesneden. (F) De FDB-spier wordt gescheiden van het onderliggende weefsel door onder en naast de spier op te tillen en te snijden. (G) Wanneer de pezen van de tenen duidelijk zichtbaar zijn, wordt de FDB losgesneden langs de rode stippellijn. (H) De FDB wordt vastgezet door de pezen en de vierde laterale pees en zijn vezels kunnen worden verwijderd door langs de rode stippellijn te snijden. Overtollige fascia kan nu worden afgesneden. (I) Na reiniging wordt de FDB-spier overgebracht naar de collagenase-oplossing. Schaalstaven = (D-I) 2 mm. Afkorting: FDB = flexor digitorum brevis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Microscopisch beeld van FDB-spiervezels ingebed in hydrogel na 24 uur cultuur. Blauwe pijl: Voorbeeld van een levensvatbare FDB-spiervezel. Gele pijl: Voorbeeld van een gedraaide FDB-spiervezel. Gedraaide spiervezels kunnen verminderde levensvatbaarheid en verminderde contracties hebben en moeten daarom worden uitgesloten van de metingen. Rode pijl: Voorbeeld van een hypervervormde FDB-spiervezel. Overmatige hypercontractie treedt op wanneer trituratie te krachtig wordt uitgevoerd of kan worden veroorzaakt door collagenase-overdigestie of het gebruik van niet-gebalanceerd kweekmedium. Schaalbalk = 100 μm. Afkorting: FDB = flexor digitorum brevis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbeeld van vezelcontractietransiënten gemeten met behulp van het op optica gebaseerde, high-throughput contractiele systeem. (A) Voorbeeld van een normale contractietransiënt. Deze transiënt wordt verkregen uit de sarcomeren omsloten door het paarse vierkant in de onderste werkbalk. De transiënt bestaat uit de volgende componenten: sarcomeerlengte bij baseline (groen), contractieduur (blauw), sarcomeerlengte bij maximale contractie (paars) en relaxatieduur (rood). Parameters zoals de snelheid en het percentage van de contractie worden berekend op basis van deze waarden. (B) Voorbeeld van een ontoereikende contractietransiënt. Deze metingen vinden plaats wanneer het sarcomeersignaal niet wordt opgepikt door ruis (zie rode pijlen). (C) Voorbeeld van een contractietransiënt met een bewegingsartefact (zie groene pijlen). Bewegingsartefacten treden op wanneer de spiervezel buiten de focus beweegt tijdens de samentrekking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatieve gegevens verkregen met behulp van het op optica gebaseerde contractiele systeem met hoge doorvoer bij het vergelijken van 2D- versus 3D-omstandigheden en verschillende hydrogels. (A) Percentage geaccepteerde en afgewezen contractiemetingen gevonden door het data-analyseprogramma in 2D-cultuur en in 3D-cultuur op basis van 30 metingen. (B) Vergelijking van de maximale contractiesnelheid in 2D-gekweekte en 3D-gekweekte spiervezels geïsoleerd uit drie muizen na 24 uur kweek. (C) Vergelijking van de sarcomeerverkorting in 2D-gekweekte en 3D-gekweekte spiervezels geïsoleerd uit drie muizen na 24 uur kweek. (D) Vergelijking van de maximale contractiesnelheid van zuivere keldermembraanmatrix (Matrigel)-ingebedde en fibrinehydrogel-ingebedde spiervezels geïsoleerd uit drie muizen na 24 uur cultuur. (E) Vergelijking van de sarcomeerverkorting van zuivere keldermembraanmatrix (Matrigel)-ingebedde en fibrinehydrogel-ingebedde spiervezels geïsoleerd uit drie muizen na 24 uur cultuur. De gegevens werden geanalyseerd met behulp van een Student's t-test en worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Elk datapunt is één spiervezel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van het dissectiemedium dat wordt gebruikt om de spier te ontleden, het fibrinekweekmedium dat wordt gebruikt om de geïsoleerde spiervezels te kweken en het spierverteringsmedium dat wordt gebruikt om de geïsoleerde spieren enzymatisch te verteren. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Samenstelling van het celmengsel dat wordt gebruikt om de hydrogels te gieten en het matrixmengsel dat wordt gebruikt om de hydrogels te gieten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Hier beschrijven we een protocol om de enzymatische isolatie en cultuur van FDB-spiervezels in een 3D-cultuurformaat uit te voeren, gevolgd door contractiele metingen met behulp van een op optica gebaseerd contractiel meetsysteem. Dit protocol heeft een aantal voordelen, waaronder de 1) rechttoe rechtaan en tijdige isolatie van veel intacte spiervezels uit een enkele spier; 2) de inbedding van de spiervezels in een afstembare hydrogelmatrix; 3) het uitvoeren van contractiliteitsmetingen met hoge doorvoer met behulp van het op optica gebaseerde systeem; en 4) het vermogen om herhaalde metingen van dezelfde spiervezels uit te voeren na een interventie. De isolatie van enkele levende spiervezels zorgt voor volwassen spiercellen die hun contractiele functie behouden. Omdat de spiervezels verkregen uit de FDB van de muis relatief klein zijn, zijn ze gemakkelijk te manipuleren tijdens isolatie en behouden ze hun rechte vorm, waardoor stroomafwaartse contractiele metingen mogelijk zijn. Hoewel het systeem in de eerste plaats is ontwikkeld om de contractie van cardiomyocyten te bestuderen, bevatten skeletspiervezels dezelfde contractiele machinerie met gemakkelijk te onderscheiden sarcomeerpatronen en kunnen ze dus ook met dit systeem worden gemeten²⁹. De koppeling van eencellige contractiele metingen met levende ex vivo spiervezelcultuur is een krachtig hulpmiddel om de gezondheid en functie van volwassen spiervezels te beoordelen als reactie op elektrische activering.

Een beperking van het gebruik van gedissocieerde spiervezels is het ontbreken van externe krachten (d.w.z. passieve rek) toegepast op de vezels, wat resulteert in lagere rustende sarcomeerlengtes in vergelijking met die in vivo. Hoewel een sarcomeerlengte van 2,4-2,5 μm zorgt voor een optimale krachtproductie, kan de rustende sarcomeerlengte sterk variëren³³. Hoewel de in vivo rustende sarcomeerlengte van de FDB nog niet is beschreven, suggereren onze eigen ongepubliceerde gegevens een gemiddelde lengte van 2,2 μm. De huidige resultaten tonen een gemiddelde rustsarcomeerlengte van ~1,95 μm in onbelaste FDB-vezels na 24 uur in cultuur (figuur 3). Hoewel deze lagere rustsarcomeerlengte zou resulteren in een lagere krachtproductie, zou een lengte van ~ 1,95 μm nog steeds >90% van de maximale kracht³⁴ moeten produceren. Als zodanig moeten deze sarcomeerlengtes voldoende zijn om verschillen in vezelfunctie tussen verschillende genetische modellen of na medicamenteuze behandelingen te bepalen. Bovendien biedt de inbedding van vezels in een hydrogel veel extra punten voor hechting in vergelijking met vrij zwevende 2D-gekweekte vezels, wat verdere verkorting van sarcomeer in de loop van de tijd zou beperken.

Een voordeel van dit spiervezelisolatieprotocol is het gebruik van een gemakkelijk te ontleden fast-twitch spier bestaande uit relatief kleine spiervezels in vergelijking met andere spieren, zoals de extensor digitorum longus (EDL). Hun kleinere formaat maakt de spierisolatie meer geschikt voor trituratie op basis van scheiding, waardoor de kans op door pipet of klitten veroorzaakte schade aan de spiervezels wordt verminderd. De extracellulaire matrix van FDB-spieren kan gemakkelijk enzymatisch worden verteerd met collagenase, waardoor honderden spiervezels in korte tijd kunnen worden geïsoleerd. Overdigestie kan echter leiden tot schade aan de spiervezels. De overdigestie van de spiervezels kan worden herkend wanneer de spier vrijwel onmiddellijk uit elkaar valt bij het tritureren van de spier of wanneer een groot deel van het celvolume wordt samengetrokken tijdens de celzaaiprocedure. Om overdigestie van de spier te voorkomen, moet de verteringstijd voor elke collagenasebatch worden geoptimaliseerd. Om dit te testen, moeten twee FDB-spieren parallel worden verteerd met een gespreide verteringstijd van 5 minuten ertussen. De verteringstijd met de hoogste opbrengst van levensvatbare spiervezels moet worden gekozen. Deze optimalisatie moet vervolgens een tweede keer worden uitgevoerd, opnieuw met 5 minuten scheiding in de verteringstijd. De verteringstijd die de hoogst levensvatbare spiervezels oplevert, moet worden gebruikt als de optimale verteringstijd voor de huidige partij collagenase. Een andere manier om de batch-to-batch variabiliteit van collagenase te beperken, zou zijn om de activiteitseenheden per milliliter stockoplossing direct te berekenen en vervolgens de volgende collagenasebatches tot dezelfde hoeveelheid te reconstitueren. Ten slotte moeten de verteringstijden mogelijk worden geoptimaliseerd voor verschillende muizenstammen, bijvoorbeeld bij het bestuderen van oudere of zieke dieren die een verhoogde extracellulaire matrixafzetting vertonen^35,36.

De mogelijkheid om levensvatbare geïsoleerde spiervezels te pipetteren opent mogelijkheden om FDB-spiervezels in verschillende kweekomstandigheden te kweken. Een van die opties is het kweken van deze vezels in hydrogels om de inheemse weefselkweekomgeving na te bootsen. Dit inbeddingsprotocol zorgt ervoor dat de vezels op hun plaats blijven tijdens de contractiele metingen en is geoptimaliseerd om de vezels naar de bodem van de plaat te laten zakken voordat de gel uitzet. Dit protocol moet echter mogelijk worden aangepast om rekening te houden met verschillen in de trombine- en fibrinogeenvoorraden. Als de trombineactiviteit te hoog is, zal de gel voortijdig uitzetten en kunnen de vezels op hogere locaties buiten het brandpuntsvlak van de microscoop blijven hangen. Als dit gebeurt, moet de trombine:fibrinogeenverhouding worden aangepast. Dit kan worden getest door vezels in steeds lagere trombineconcentraties te plateren en te noteren hoe lang de polymerisatie duurt. Meestal mag dit niet sneller dan 30 minuten gebeuren. Het hebben van een te lage trombineconcentratie kan echter ook het polymerisatieproces schaden. Een andere methode om ervoor te zorgen dat de vezels zich in het juiste brandpuntsvlak bevinden, is om ze eerst te zaaien met behulp van een 2D-protocol en vervolgens een laag hydrogel over de vezels toe te voegen nadat ze zich aan de kweekplaat hebben gehecht. Men moet zich er echter van bewust zijn dat het verwijderen van het medium uit de vezels hypercontractie kan veroorzaken, omdat ze gevoelig zijn voor uitdroging. Het is ook onduidelijk of de hydrogel zich volledig aan de kweekplaat zal hechten en deze kan gemakkelijker loskomen. Daarom heeft deze inbeddingsprocedure de voorkeur om vezels levensvatbaar te houden en op hun plaats te houden voor contractiemetingen.

Het gebruik van dit protocol maakt de studie van de contractiele dynamiek van volwassen spiervezels ex vivo mogelijk en kan worden toegepast op zowel gezonde muizen als degenen die genetische mutaties voor spierziekten dragen. Op dezelfde manier maakt het het mogelijk om te testen hoe kweekomstandigheden of de toevoeging van verbindingen de spiervezelfunctie beïnvloeden. De contractiele gegevens verkregen met behulp van het op optica gebaseerde systeem geven een indicatie van het contractiele vermogen van levende enkele spiervezels, en veranderingen in dit vermogen kunnen worden gecorreleerd aan de gezondheid van vezels. Deze gegevens alleen zijn echter niet voldoende om te bepalen of deze veranderingen optreden in de actine-myosine kruisoverbruggings- of calciumafgiftestadia van spiercontractie. Hoewel we in dit protocol geen methoden beschrijven om calciumsignalering te meten, is deze opstelling ook in staat om op Fura gebaseerde calciumtransiënten te meten in samentrekkende spiercellen²⁹. Een nadeel van dit systeem is dat de FDB-spier alleen fast-twitch type IIa / IIx-spiervezels bevat, en spieren die slow-twitch type I-vezels van deze grootte bevatten, zijn nog niet beschreven³⁷. Dit elimineert de mogelijkheid om vezeltype-specifieke werking te bestuderen met behulp van deze methode. Het protocol dat we hier voorstellen, kan mogelijk worden aangepast voor andere spieren zoals de EDL of de soleus om vezeltypeverschillen te bestuderen. Vanwege hun grotere omvang zou dit protocol verder moeten worden geoptimaliseerd voor deze spieren. Langere vezels hebben de neiging om verstrikt te raken tijdens de zwaartekrachtbezinkingsstap en zullen scheuren als ze worden gemanipuleerd door pipetteren, wat zou leiden tot een lagere opbrengst. Door hun incompatibiliteit met pipetteren zijn langere vezels daarom ook minder compatibel met de gel-embedding techniek. Metingen van deze vezels kunnen nog steeds worden uitgevoerd in een 2D-cultuurformaat, maar de vezels kunnen meer bewegen tijdens de contractie vanwege hun grootte, waardoor de signaal-ruisverhouding wordt beïnvloed. Een andere beperking van dit systeem is het onvermogen om krachtmetingen uit te voeren naast de contractiele metingen, zoals die krachtmetingen die kunnen worden verkregen met behulp van andere intacte spiervezelpreparaten²⁸. Deze beperking kan echter worden omzeild door de kracht te schatten die door de spiervezel wordt gegenereerd. De gegenereerde kracht van spiervezels kan worden geschat als de spiervezelvorm tijdens samengetrokken en ontspannen toestanden en de Young's modulus van de matrix bekend zijn²⁵. Niettemin biedt dit op optische basis gebaseerde systeem een eenvoudig te gebruiken, high-throughput benadering voor het bestuderen van spiercontractiele functie en opent het een reeks nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van genetische spierziekten en therapeutische interventies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Aprotinin, van runderlongen	Thermo Scientific	AAJ63039MC	100 mM stockoplossing in PBS kan worden bewaard bij -20 °C.  Steriliseer stockoplossing met behulp van een 0,22 µm filter.
Collagenase type 2	Worthington	77336	10% (w/v) stockoplossing kan worden bewaard bij -20 °C. Weging van collageenase dient te worden gedaan in een veiligheidskast omdat inademing gevaarlijk is.
Fetusrunder Serum	Thermo Fisher	10500064
Fibrinogeen uit runderplasma	Sigma Aldrich	50-176-5054	20 mg/mL stockoplossing in PBS kan worden bewaard bij -80 °C. Steriliseer stockoplossing met behulp van een 0,22 µm filter.
Geltrex LDEV-vrije gereduceerde groeifactor basaalmembraanmatrix	Thermo Fisher	A1413201	4 mg/mL stockoplossing wordt bereid in MEM en wordt bewaard bij -20 °C.
Gibco MEM Hoge glucose + pyruvaat	Thermo Fisher	11095080
Paarden serum	Thermo Fisher	H1270
Matrigel GFR membraanmatrix	Corning	CB-40230	4 mg/mL stockoplossing wordt bereid in MEM en wordt bewaard bij -20 °C.
Penicilline/Streptomycine	Sigma Aldrich	P4333
Serumvervanger 2 (50x)	Sigma Aldrich	S9388
Trombine, runderplasma	Thermo Scientific	AAJ63383EXP	125 U/mL stock in PBS kan worden bewaard bij -20 °C. Steriliseer stockoplossing met behulp van een 0,22 µm filter.
Tranexamzuur	Thermo Scientific	AC228042500	80 mM stockoplossing in PBS kan worden bewaard bij -20 °C.  Steriliseer stockoplossing met behulp van een 0,22 µm filter.
Apparatuur
24-wels elektrische stimulator	IonOptix	N/a
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11295-51
Extra Fijn Bonn Schaartjes	Fine Science Tools	14084-08
MultiCell Cytocypher	IonOptix	N/a
MyoCam-S3	IonOptix	N/a
MyoPacer	IonOptix	N/a
SYLGARD 184 siliconen elastomeer, Basis & uithardingsmiddel	Dow corning	N/a
Vannas Spring Schaartje - 25 mm snijkant	Fine Science Tools	15002-08
Software
CytoSolver	IonOptix	N/a
IonWizard	IonOptix	N/a