Xenogene (chemische of dierlijke afgeleide) producten die worden geïntroduceerd in de voorbereidings-/manipulatiestappen voor celtherapie zijn geassocieerd met een verhoogd risico op immuunreactiviteit en pathogene overdracht bij gastheerpatiënten. Hier wordt een volledig xenogeneïsche vrije methode beschreven voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en kweek van menselijke vetstamcellen met een innovatieve xenogene-vrije methode voor menselijke therapie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Gezien de toenemende impact van stamceltherapie zijn er zorgen geuit over de bioveiligheid met betrekking tot mogelijke besmetting of infectieoverdracht als gevolg van de introductie van dierlijke producten tijdens in vitro manipulatie. De xenogene componenten, zoals collagenase of foetaal runderserum, die vaak worden gebruikt tijdens de celisolatie en expansiestappen, kunnen worden geassocieerd met de potentiële risico's van immuunreactiviteit of virale, bacteriële en prioninfectie bij de ontvangende patiënten. Volgens de richtlijnen voor goede productiepraktijken moet dissociatie van chemisch weefsel worden vermeden, terwijl foetaal runderserum (FBS) kan worden vervangen door xenogene-vrije supplementen. Om de veiligheid van celproducten te waarborgen, is bovendien de definitie van betrouwbaardere en reproduceerbare methoden belangrijk. We hebben een innovatieve, volledig xenogeneïsche vrije methode ontwikkeld voor de isolatie en in vitro expansie van menselijke vet-afgeleide stamcellen zonder hun eigenschappen te veranderen in vergelijking met collagenase FBS-gekweekte standaardprotocollen. Hier werden menselijke vet-afgeleide stamcellen (hASCs) geïsoleerd uit abdominaal vetweefsel. Het monster werd mechanisch gehakt met een schaar / een scalpel, micro-ontleed en mechanisch gedispergeerd in een petrischaal van 10 cm, en bereid met scalpelincisies om de aanhechting van de weefselfragmenten en de migratie van hASCs te vergemakkelijken. Na de wasstappen werden hASC's geselecteerd vanwege hun plastische hechting zonder enzymatische vertering. De geïsoleerde hASCs werden gekweekt met medium aangevuld met 5% heparinevrij humaan bloedplaatjeslysaat en losgemaakt met een diervrij trypsinesubstituut. Volgens de aanwijzingen voor goede productiepraktijken (GMP) voor de productie van celproducten die bedoeld zijn voor menselijke therapie, werden in geen enkel kweekmedium antibiotica gebruikt.
Inleiding
In de afgelopen decennia heeft de toenemende vraag naar innovatieve therapeutische behandelingen geleid tot aanzienlijke inspanningen en investeringen in middelen op het gebied van translationele geneeskunde1. Celgebaseerde producten worden geassocieerd met risico's die worden bepaald door de celbron, het productieproces (isolatie, expansie of genetische modificatie) en de niet-cellulaire supplementen (enzymen, groeifactoren, kweeksupplementen en antibiotica), en deze risicofactoren zijn afhankelijk van de specifieke therapeutische indicatie. De kwaliteit, veiligheid en werkzaamheid van het eindproduct kunnen sterk worden beïnvloed door de hier....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
hASCs werden geïsoleerd uit het buikvetweefsel van een gezonde vrouw die een borstreconstructie onderging met behulp van abdominale autologe flappen (diepe inferieure epigastrische perforatorflappen, [DIEP]) in het Universitair Ziekenhuis van Lausanne, CHUV, Lausanne, Zwitserland. Het weggegooide deel van de flap en het vetweefsel werd verkregen nadat de patiënt geïnformeerde toestemming had ondertekend. Alle protocollen werden beoordeeld en goedgekeurd door de Biobank afdeling DAL (nummer 314 GGC) van het ziekenhuis en ethische commissies in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki.
OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd on....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Door de hierboven beschreven isolatiemethode toe te passen, werden hASCs met succes verkregen uit abdominale vetweefselmonsters zonder het gebruik van collagenase. Bovendien werden de hASCs uitgebreid in volledig xenogene-vrije omstandigheden in aanwezigheid van hPL en zonder andere componenten van dierlijke oorsprong. De volgende resultaten ondersteunen het protocol en worden verkregen uit hASCs die parallel met hPL en met FBS als controlevoorwaarde zijn gekweekt.
Na het eerste clusteroptrede.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Van vetweefsel afgeleide stamcellen hebben de afgelopen tien jaar de belangstelling van translationeel onderzoek getrokken vanwege hun overvloed, snelle en betaalbare isolatiemethoden, hoge in vitro / in vivo proliferatiesnelheid en stam / differentiatie-eigenschappen18,19,20. Als gevolg hiervan worden hASCs beschouwd als een uitstekende kandidaat voor celgebaseerde strategieën in regeneratieve geneeskunde
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen erkenningen.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 15 mL tubes | euroclone | et5015b | |
| anti-CD105 | BD Biosciences | BD560839 | |
| anti-CD34 | BD Biosciences | BD555821 | |
| anti-CD45 | BD Biosciences | BD555482 | |
| anti-CD73 | BD Biosciences | BD561254 | |
| autoMACS Rinsing Solution (FACS buffer) | Miltenyi | 130-091-222 | |
| BD Accuri C6 apparatus (flow cytometry instrument) | BD accuri | - | |
| Burker chamber | Blaubrand | 717810 | |
| Cell freezing container | corning | CLS432002 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | |
| CoolCell Freezing container | Corning | CLS432002 | |
| Cryovials | clearline | 390701 | |
| Dimethyl sulfide | Sigma Aldrich | D2650-100mL | |
| disposabile blade scalpel | paragon | bs 2982 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium - high glucose | GIBCO | 11965092 | |
| Human Platelet Lysate FD (GMP grade) | Stemulate | PL-NH-500 | |
| Infinite F50 spectrophotometer | Tecan | - | |
| Optical microscope with 4x and 10x magnification objectives | Olympus | CKX41 | |
| Petri dish 10 cm | Greiner bio-one | 664160 | |
| Sterile scalpels | Reda | 07104-00 | |
| Sterile scissors | Bochem | 4071 | |
| Sterile tweezers | Bochem | 1152 | |
| Swinging bucket centrifuge | Sigma | 3-16K | |
| T25 flasks | Greiner bio-one | 6910170 | |
| TrypLe (animal free trypsin substitute) | GIBCO | 12604-013 |
Referenties
- Naderi, N., et al. The regenerative role of adipose-derived stem cells (ADSC) in plastic and reconstructive surgery. International Wound Journal. 14 (1), 112-124 (2017).
- Guiotto, M., Riehle, M. O., Raffoul, W., Hart, A., di Summa, P. G.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
