Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nicotine gebruiken in een aan silica blootgesteld muismodel om de overgang van longepitheel naar mesenchym te bevorderen

1.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65127

⸱

3 maart 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Industrial Dust Control and Occupational Health of the Ministry of Education, Anhui University of Science and Technology, 2Key Laboratory of Industrial Dust Deep Reduction and Occupational Health and Safety of Anhui Higher Education Institutes, Anhui University of Science and Technology, 3Anhui Province Engineering Laboratory of Occupational Health and Safety, 4School of Medicine, Department of Medical Frontier Experimental Center, Anhui University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie beschrijft een muismodel om het synergetische effect van nicotine op de progressie van longfibrose bij experimentele silicosemuizen te bestuderen. Het muismodel met dubbele blootstelling simuleert de pathologische progressie in de long na gelijktijdige blootstelling aan nicotine en silica. De beschreven methoden zijn eenvoudig en zeer reproduceerbaar.

Samenvatting

Roken en blootstelling aan silica komen vaak voor bij beroepswerkers, en silica heeft meer kans om de longen van rokers te beschadigen dan niet-rokers. De rol van nicotine, het belangrijkste verslavende ingrediënt in sigaretten, bij de ontwikkeling van silicose is onduidelijk. Het muismodel dat in deze studie werd gebruikt, was eenvoudig en gemakkelijk te controleren, en simuleerde effectief de effecten van chronische nicotine-inname en herhaalde blootstelling aan silica op longfibrose door epitheliale-mesenchymale overgang bij mensen. Bovendien kan dit model helpen bij de directe studie van de effecten van nicotine op silicose, terwijl de effecten van andere componenten in sigarettenrook worden vermeden.

Na aanpassing aan de omgeving werden muizen subcutaan geïnjecteerd met 0,25 mg/kg nicotine-oplossing in de losse huid boven de nek, elke ochtend en avond met tussenpozen van 12 uur gedurende 40 dagen. Bovendien werd kristallijn silicapoeder (1-5 μm) gesuspendeerd in normale zoutoplossing, verdund tot een suspensie van 20 mg/ml en gelijkmatig gedispergeerd met behulp van een ultrasoon waterbad. De met isofluraan verdoofde muizen inhaleerden 50 μL van deze silicastofsuspensie via de neus en werden gewekt via borstmassage. Blootstelling aan silica werd dagelijks toegediend op dag 5-19.

Het dubbel blootgestelde muismodel werd blootgesteld aan nicotine en vervolgens aan silica, wat overeenkomt met de blootstellingsgeschiedenis van werknemers die aan beide schadelijke factoren zijn blootgesteld. Bovendien bevorderde nicotine longfibrose door epitheliale-mesenchymale transformatie (EMT) bij muizen. Dit diermodel kan worden gebruikt om de effecten van meerdere factoren op de ontwikkeling van silicose te bestuderen.

Inleiding

Blootstelling aan silica bij werknemers is onvermijdelijk in sommige beroepsomgevingen, en eenmaal blootgesteld aan silica vordert de verslechtering, zelfs na verwijdering uit het milieu. Bovendien roken de meeste van deze werknemers en bevatten traditionele sigaretten duizenden chemicaliën, met als belangrijkste verslavende bestanddeel nicotine1. E-sigaretten worden steeds populairder in jongere leeftijdsgroepen2; Deze e-sigaretten fungeren als een nicotineafgiftesysteem en vergroten de toegang tot nicotine, waardoor de longgevoeligheid en longontsteking toenemen3. Sigarettenrook versnelt ook longfibrose bij aan bleomycine blootgestelde muizen4 en verhoogt de longtoxiciteit en fibrose bij aan silica blootgestelde muizen 5,6. Of nicotine het ontstekings- en longfibroseproces veroorzaakt door silica kan beïnvloeden, moet echter nog worden onderzocht.

Het silicose-muismodel dat tot stand komt door de eenmalige inademing van een hoge dosis silica in de luchtpijp is traumatisch voor muizen. Hoewel deze methode snel een silicosemodel oplevert, komt het niet overeen met de realiteit van een omgeving waar werknemers herhaaldelijk worden blootgesteld aan silica. Daarom hebben we een aan silica blootgesteld muismodel opgesteld door herhaaldelijk een lage dosis silicasuspensies te geven via een neusinfuus; Deze dosis kan ontstekingen en fibrose bij muizen veroorzaken.

Om de effecten van andere sigarettencomponenten te omzeilen, werd dit muismodel subcutaan met nicotine in de losse huid van de nek geïnjecteerd om het effect van de verslavende component, nicotine, op silicose te bepalen. Door subcutane injecties toe te dienen, kan een nauwkeurige dosering worden bereikt, waardoor het mogelijk wordt om nicotineblootstellingsmodellen te maken en dosistoxiciteitsreacties en verslaving te observeren. Bij mannelijke muizen is een nicotineverslavingsmodel ontwikkeld, met een nicotine-injectiedosis van 0,2-0,4 mg/kg 7,8. In dat model werden, om te voldoen aan de drugsbehoeften van de verslaafde muizen, twee subcutane injecties toegediend met tussenpozen van 12 uur. Dit nicotineverslavingsmodel bij muizen is nuttig voor het simuleren van menselijke rookgewoonten en blootstelling aan silica.

Enkelvoudige diermodellen hebben beperkingen in ziektestudies, terwijl de hier beschreven methode een tweefactormuismodel van gelijktijdige blootstelling aan nicotine en silica omvat. Voorafgaand aan de blootstelling aan silica werden de muizen vooraf blootgesteld aan nicotine om de blootstelling aan nicotine bij mensen die roken na te bootsen. Vervolgens vond van dag 5 tot dag 19 blootstelling aan silica plaats om blootstelling aan silica na te bootsen in een werkomgeving voor personen met een voorgeschiedenis van roken.

Van alveolaire macrofagen is bekend dat ze een belangrijke rol spelen bij de regulatie van longontsteking en fibrose. Macrofagen kunnen silica niet afbreken bij het inademen van silica, wat leidt tot macrofaagpolarisatie of apoptose9 en het vrijkomen van cytokines zoals tumornecrosefactor-alfa (TNF-α) en transformerende groeifactor bèta (TGF-β). M1-macrofagen, die worden geïdentificeerd door de aanwezigheid van de oppervlaktemarker CD86, zijn de primaire aanstichters van de ontstekingsreactie bij silicose, terwijl M2-macrofagen, die worden gemarkeerd door CD206, verantwoordelijk zijn voor de fibrotische fase van de aandoening10. Bij dubbel blootgestelde muizen induceerde nicotine de polarisatie van macrofagen in de richting van het M2-fenotype in door silica beschadigde longen, waardoor longfibrose werd bevorderd. Bovendien is TGF-β1 de sleutel tot de inductie van fibrose en EMT11; de verhoogde expressie van TGF-β1 versnelde de progressie van longfibrose door EMT. Dit model analyseerde met succes de effecten van nicotine op silicose en benadrukte verder het belang van stoppen met nicotine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van de National Institutes of Health's Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (de 8e editie van de NRC) en werden goedgekeurd door de Anhui University of Science and Technology Animal Ethics Committee.

1. Voorbereiding van dieren

  1. Huisvest 32 mannelijke C57/BL6 muizen van 8 weken oud in een laboratorium met een licht/donkercyclus van 12 uur. Zorg ervoor dat de muizen vrije toegang hebben tot voedsel en water.
  2. Na 2 weken gewenning aan de omgeving, wanneer de 10 weken oude muizen 23-26 g wegen, gebruikt u willekeurige getallen die door een computer zijn gegenereerd om de dieren willekeurig te groeperen zonder te partitioneren, wat resulteert in vier groepen muizen: de controlegroep (Con), de nicotinegroep (Nic), de silicagroep (SiO 2) en de nicotinegroep gecombineerd met silicagroep (Nic+ SiO2).

2. Nicotine preparaat

OPMERKING: De nicotinedichtheid is 1.01 g/ml.

  1. Los de nicotine op in watervrije ethanol en verdun 20x om een nicotinevoorraadoplossing van 50 mg/ml te bereiden.
  2. Verdun de nicotinevoorraadoplossing 1.000x met steriele normale zoutoplossing om een werkoplossing te maken met een concentratie van 0,05 mg/ml.
    NOTITIE: Bewaar nicotine uit de buurt van licht. De stockoplossing kan maximaal 1 week bij 4 °C worden bewaard.

3. Silica bereiding

  1. Suspendeer steriel kristallijn silica in zoutoplossing om een silicasuspensie van 20 mg/ml te bereiden en oscilleer het gedurende 25 minuten in een ultrasoon schudwaterbad.
  2. Schud de silicasuspensie met een vortex-oscillator gedurende 3 minuten voordat de muizen het neusinfuus krijgen. Meng de silicasuspensie door 2x-3x op en neer te pipetteren met een pipet van 200 μL en neem vervolgens 50 μL op voor het neusinfuus.
    OPMERKING: De siliciumdioxide-suspensie moet zo snel mogelijk worden gemengd en toegediend via een neusinfuus.

4. Muizenvangst en blootstelling aan nicotine

  1. Weeg de muizen en noteer de gewichten dagelijks voor blootstelling.
  2. Injecteer op dag 1-40 tweemaal daags subcutaan nicotine (met een tussenpoos van 12 uur) in de muizen in de Nic- en Nic+ SiO2-groepen . Gebruik een nicotinedosis van 0,25 mg/kg; Zorg er bijvoorbeeld voor dat een muis van 25 g 6,25 μg nicotine binnenkrijgt. Voor deze muis zou het injectievolume als volgt zijn: 6,25/0,05 = 125 μL. Injecteer tegelijkertijd de muizen in de Con-groep met een gelijk volume zoutoplossing.
  3. Bereid de vereiste spuiten van 1 ml voor elke groep voor en gebruik ze om het injectievolume van nicotine of zoutoplossing op te zuigen. Voordat u de nicotine opneemt, zuigt u eerst 0,1-0,2 ml lucht in de spuit en zuigt u vervolgens 125 μL nicotine op. Tik voorzichtig op de spuit om de naald en het voorste uiteinde van de spuit met de nicotine te vullen. Plaats de nicotinehoudende spuit in een bakje dat beschermd is tegen licht.
    OPMERKING: Op het moment van injectie bevindt zich 0,1-0,2 ml lucht achter de nicotine, wat garandeert dat alle vloeistof met succes aan de muis wordt toegediend.
  4. Pak de staart van de muis vast met de rechterhand en wanneer het dier ontspant, gebruik dan de linkerduim en wijsvinger om de huid op de achterkant van de nek van de staart naar het hoofd tot aan de rand van het oor te drukken, waarbij u matige druk uitoefent. Laat daarna de rechterhand los en gebruik de linker kleine duim en ringvinger om de staart en achterpoten te knijpen, waarna de muis volledig wordt geïmmobiliseerd door de linkerhand.
    NOTITIE: Pak de muis met de juiste kracht vast. Onvoldoende kracht maakt het gemakkelijk voor muizen om te bijten, terwijl overmatige kracht kan leiden tot verstikking van de muizen.
  5. Gebruik de rechterhand om te injecteren, doorboor de huid aan de achterkant van de nek bij de oorrand van de muizen in een kop-tot-staartrichting met de spuit en injecteer met nicotine met een uniforme snelheid. Zoek naar een halfronde huiduitstulping die wijst op een succesvolle injectie.
    OPMERKING: Wanneer de naald in de huid is geprikt, zal er een gevoel van weerstand zijn; De weerstand verdwijnt nadat de naald is ingebracht. Op dit punt moet de naald iets worden teruggetrokken om langzaam en gelijkmatig te injecteren.

5. Blootstelling aan silica in vivo

  1. Breng op dag 5-19 de siliciumdioxidesuspensie in de neusholte van de muizen in de SiO 2- en Nic+ SiO2-groepen. Verdoof elke muis snel met 2% isofluraan in een anesthesieapparaat in een dosis van 3,6 ml/uur. Plaats de muis na anesthesie op de palm van één hand en leg de neusholte van de muis bloot. Druppel 50 μL silicasuspensie in de neusholte binnen 4-8 s.
  2. Om de silicasuspensie zo snel mogelijk in de longen te laten komen, drukt u na indruppeling zachtjes met de wijsvinger op het hart van de muis gedurende 3-5 s, 3x-5x per seconde, om de ademhalingsfrequentie te bevorderen.
  3. Nadat de ademhaling van de muis geleidelijk uniform is geworden, plaatst u de muis in een kooi om gedurende 3 minuten te observeren.
  4. Herhaal stap 1-3 voor alle muizen die de silicasuspensie krijgen. Druppel in de controlegroep 50 μL steriele zoutoplossing in de neusholte op dag 5-19.

6. Verwerving van vers en gefixeerd longweefsel

  1. Gebruik op dag 41 50 mg/kg natriumpentobarbital om de muizen intraperitoneaal te verdoven in een dosis van 0,1 ml/20 g op basis van hun lichaamsgewicht. Bevestig de ledematen op een schuimrubberen testplaat en spuit de vacht in met 75% alcohol.
  2. Voer hartperfusie uit om vers longweefsel te verkrijgen, snijd de middellijn van de buik door om de borstholte bloot te leggen en maak een kleine opening aan de top van het rechterhart. Injecteer vervolgens langzaam en gelijkmatig 20 ml voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) vanaf de top van het linkerhart, waardoor het bloed uit de opening stroomt die aan de top van het rechterhart is gemaakt. Haal de hele longkwab eruit, plaats deze in een voorgekoelde centrifugebuis van 1,5 ml en breng over naar -80 °C voor opslag in afwachting van eiwitextractie.
  3. Doordrenk andere muizen met 20 ml voorgekoelde PBS gevolgd door 10 ml 4% paraformaldehyde op dezelfde locatie om de hele longen te fixeren; bewaar elke long in 30 ml 4% PFA.
  4. Na 72 uur het vaste longweefsel inbedden in paraffine.
    1. Dompel het longweefsel onder in het bereide fixeermiddel in een ultrasoon waterbad bij 40 °C gedurende 30 minuten, gevolgd door een dehydratatieproces in 75% ethanol, 95% ethanol en watervrije ethanol gedurende elk 50 minuten.
    2. Was 2x met xyleen gedurende 50 min elk.
    3. Plaats het weefsel gedurende 2-3 uur in gesmolten paraffinewas bij 55-60 °C, zodat het xyleen in het longweefsel geleidelijk wordt vervangen door paraffinewas.
    4. Fixeer het longweefsel in het inbeddingsframe met paraffine en wacht tot het wasblok is uitgehard. Nadat het wasblok is uitgehard, gebruikt u de paraffinesnijmachine om de long op 4-5 μm te snijden.
  5. Plaats de longsecties in ultrapuur water van 45 °C. Zodra de paraffine is gesmolten, laadt u het longgedeelte op een aanhangend microscoopglaasje.

7. Hematoxyline en eosine (HE) kleuring

  1. Bak de glaasjes 2 uur op 60 °C en leg de glaasjes 2 x 30 min in xyleen om te ontwaxen. Plaats vervolgens de objectglaasjes elk gedurende 5 minuten in watervrije ethanol, 95% ethanol, 85% ethanol en 75% ethanol. Was ze tot slot 3 x 5 min met ultrapuur water.
  2. Druppel 50 μL hematoxylinekleuringsoplossing op het longweefsel met een pipetpistool en kleuring gedurende 5 minuten; Was de plakjes vervolgens 5 minuten onder stromend water.
  3. Voeg 50 μL 2% zoutzuur in ethanol toe aan de sectie en spoel gedurende 30 s af met gedestilleerd water. Voeg vervolgens 50 μL eosinekleuringsoplossing toe aan het longweefsel om gedurende 1 minuut te kleuren.
  4. Dehydrateer, transparantiseer en sluit de paraffinesecties af.
    1. Voeg 100-150 ml 75% ethanol, 85% ethanol, 95% ethanol, watervrije ethanol en xyleen toe aan een gecombineerde plastic verftank. Leg de glaasjes in 75%, 85%, 95% en watervrije ethanol gedurende elk 5 minuten om uit te drogen.
    2. Plaats de objectglaasjes vervolgens 5 minuten in xyleen om te transparanteren.
    3. Laat ten slotte 20 μL neutrale kauwgom op het longgedeelte vallen en plaats een dekglaasje over het glaasje om het af te dichten.
      NOTITIE: De bovenstaande stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.

8. Masson-kleuring

  1. Ontwax, hydrateer en was de paraffinesecties zoals beschreven in stap 7.1.
  2. Kleur de secties met 50 μL geconfigureerde Weigert's hematoxylinekleuringsoplossing gedurende 7 minuten, gevolgd door 50 μL zure ethanolfractioneringsoplossing gedurende 10 s, en was met stromend water om de kernen blauw te kleuren.
  3. Kleur de secties gedurende 4 minuten met 50 μL Masson trichroomoplossing en was ze met water.
  4. Spoel de secties gedurende 1 minuut af met gedestilleerd water en beits ze vervolgens gedurende 7 minuten met Lichun red acid magenta.
  5. Was de secties gedurende 1-2 minuten met een zwakke zure werkoplossing (30% zoutzuur), gedurende 1-2 minuten met fosfomolybdinezuur en gedurende 1-2 minuten met een zwakke zure werkoplossing.
  6. Kleur de secties gedurende 2 minuten in anilineblauwe kleuroplossing en was ze vervolgens gedurende 1 minuut met een zwak zure werkoplossing.
  7. Dehydrateer de secties gedurende 1 s met 95% ethanol, gevolgd door watervrije ethanol, transparant met xyleen gedurende 1 s en sluit ten slotte af met neutrale hars zoals beschreven in stap 7.4.

9. Immunohistochemie

  1. Bak de plakken 6 uur op 60 °C. Ontwax, hydrateer en was de paraffinesecties zoals beschreven in stap 7.1.
  2. Antigeenretje: plaats de plakjes in een hittebestendige plastic snijdoos met voldoende citraatantigeenoplossing om de plakjes onder te dompelen en kook gedurende 20-30 minuten.
  3. Koel af tot kamertemperatuur, verwijder de secties en spoel af met gedeïoniseerd water. Laat vervolgens 2 x 5 minuten weken in PBS met 0,5% Tween-20 (PBST).
  4. Teken met een hydrofobe pen een lus in de buurt van het longgedeelte op het objectglaasje om een hydrofobe cirkel te vormen.
  5. Voeg 50 μL 3% waterstofperoxide-oplossing (3% H2Ø2) druppelsgewijs toe aan de plakjes en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht voor de inactivering van endogeen peroxidase.
  6. Week de plakjes 3 x 5 minuten in PBST.
  7. Voeg druppelsgewijs 50 μL 5% runderserumeiwit (BSA)-PBST toe aan de plakjes en laat 1 uur bij kamertemperatuur staan.
  8. Gooi de blokkerende oplossing weg, voeg 50 μl van de verdunde primaire antilichamen CD206 (verdunning: 1:1.500), TGF-β1 (verdunning: 1:200) en vimentine (verdunning: 1:2.000) druppelsgewijs toe aan de plakjes en incubeer een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: In dit werk werden alle antilichamen verdund in 5% BSA.
  9. Zet de plakjes de volgende dag terug op kamertemperatuur (40 min). Was de plakjes zoals beschreven in stap 9.6.
  10. Verdun het secundaire antilichaam in 5% BSA. Voeg druppelsgewijs 50 μl mierikswortelperoxidase-gelabeld secundair antilichaam (verdunning: 1:500) toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was de plakjes zoals beschreven in stap 9.6.
  11. Druppel 50 μL 3,3'-diaminobenzidine (DAB)-oplossing overeenkomend met het enzymgelabelde secundaire antilichaam op het longweefsel en incubeer gedurende 5-10 minuten in een zwarte immunohistochemische natte doos. Observeer onder de microscoop totdat de kleur zich ontwikkelt tot een sterk bruin. Spoel de plakjes af met gedestilleerd water om de reactie te beëindigen.
    OPMERKING: Bruine verkleuring wordt beschouwd als positieve kleuring.
  12. Vlek met 50 μL hematoxylinevlek gedurende 30 s en was met stromend water. Week vervolgens de plakjes in 75%, 85%, 95% en watervrije ethanol gedurende elk 3 minuten en vervolgens in xyleen gedurende 2 x 10 minuten. Sluit de glaasjes af zoals beschreven in stap 7.4.

10. Analyse van de western blot

  1. Haal het longweefsel uit de vriezer en weeg het. Voeg vervolgens 150 μL RIPA lysisbuffer met PMSF per 20 mg longweefsel toe. Lyseer de longen van de muis gedurende 3-5 minuten op ijs met behulp van een handhomogenisator, schud zachtjes gedurende 2 uur bij 4 °C om voldoende lysis van het longweefsel mogelijk te maken, centrifugeer bij 4 °C en 14.800 × g gedurende 15 minuten en vang het supernatant op.
    OPMERKING: Voeg een paar minuten voor gebruik van de RIPA lysisbuffer 100 mM fenylmethaansulfonylfluoride (PMSF) toe. De uiteindelijke concentratie PMSF is 1 mM (bijv. 10 μL PMSF + 990 μL RIPA).
  2. Gebruik een BCA-eiwitconcentratiekit om de eiwitconcentratie van het monster te bepalen door de instructies van de fabrikant te volgen. Verdun na bepaling, met de kleinste concentratie eiwitlysaat als basis, dezelfde partij eiwitlysaat met RIPA tot de kleinste concentratie om dezelfde massa en hetzelfde volume te bereiken.
    OPMERKING: De totale hoeveelheid longweefsel die wordt belast, is 30 μg.
  3. Voeg 40 μL 5x laadbuffer toe aan 160 μL eiwitlysaat en verwarm dit gedurende 10 minuten op 100 °C.
  4. Monteer de voorbereide 10% natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE)-gel in het western blotting-elektroforesesysteem, voeg de SDS-PAGE-elektroforesebuffer toe, trek voorzichtig de elektroforesekam eruit en voeg langzaam en gelijkmatig 20 μL eiwitmonster per putje toe. Schakel de stroom in en start de elektroforese op 80 V gedurende 30 minuten. Nadat de eiwitten de onderste gellaag hebben bereikt, schakelt u over naar 100 V en gaat u door met de elektroforese gedurende 60-70 minuten.
    OPMERKING: Elektroforese heeft een nieuwe elektroforesebuffer nodig.
  5. Breng de eiwitten over naar een PVDF-membraan door middel van natte overdracht. Activeer het PVDF-membraan vooraf met methanol (5-30 s). Haal de elektroforese-gelplaat eruit, wrik deze voorzichtig open, plaats de separatorgel in de natte transferbuffer, maak de elektrische transfersandwich en monteer het natte transfersysteem. Vul de elektroforesetank met overdrachtsbuffer en breng gedurende 90 minuten over op 400 mA.
    OPMERKING: De transferbuffer wordt van tevoren gekoeld om de effecten van hoge temperaturen tijdens de natte transfer te voorkomen.
  6. Was het PVDF-membraan met Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,5% Tween-20 (TBST) gedurende 3 x 5 min. Blokkeer het PVDF-membraan met 5% magere melk verdund in TBST en incubeer op een shaker bij kamertemperatuur gedurende 60 minuten; Was vervolgens met TBST gedurende 2 min. Na het wassen het membraan een nacht bij 4 °C incuberen met het primaire antilichaam vimentine (1:5.000) en GAPDH (1:10.000) verdund in 5% BSA.
  7. Plaats het membraan 30 minuten op kamertemperatuur en was het 5 x 5 minuten met TBST. Incubeer na het wassen het membraan met het secundaire antilichaam (1:10.000) verdund in 5% magere melk gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Plaats het membraan met de eiwitkant naar boven, laat de bereide ECL-werkoplossing vallen, incubeer gedurende 1-2 minuten en observeer de resultaten met een gelimager. Gebruik de grijswaardenwaarden die door de software in de gelimager worden gemeten om de eiwitexpressieniveaus te evalueren.
    OPMERKING: Hier diende GAPDH als interne referentie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een muismodel om nicotine in combinatie met blootstelling aan silica te bestuderen, werd opgesteld om de mogelijke rol van nicotine in de progressie van silicose bij muizen te onderzoeken. Figuur 1 toont de experimentele procedure voor het gebruik van een muismodel met dubbele belichting, waarbij een nicotine-injectie werd gecombineerd met de nasale instillatie van een silicasuspensie. De pathologische veranderingen van de muizen in elke groep werden waargenomen met behulp van HE-kleuring. D...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Een diermodel met dubbele blootstelling is nodig om de rol en de mogelijke mechanismen van gelijktijdige blootstelling aan nicotine en kristallijn siliciumdioxide te onderzoeken. Dit model werd in dit werk bereikt door de subcutane injectie van nicotine en het neusinfuus van silica. Om een succesvolle nicotine-injectie te garanderen, moet de operator vertrouwd raken met het vastpakken van de muizen, omdat het vastpakken van de huid aan de achterkant van de nek pijnlijk voor hen kan zijn. Daarom is het belangrijk om de mu...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Alle auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door het University Synergy Innovation Program van de provincie Anhui (GXXT-2021-077) en het Anhui University of Science and Technology Graduate Innovation Fund (2021CX2120).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% formaline neutral fixatiefNanchang Yulu Experimental Equipment Co.
alcohol desinfectiemiddelXintai Kanyuan Disinfection Products Co.
BSA, Fraction VBeyotime BiotechnologyST023-200g
CD206 monoklonaal antilichaamProteintech60143-1-IG
Citrate Antigeen Retrieval Solutionbiosharp life scienceBL619A
dimethyl benzeenWest Asia Chemical Technology (Shandong) Co
Enhanced BCA Protein Assay KitBeyotime BiotechnologyP0009
GAPDH polyklonaal antilichaamProteintech10494-1-AP
Hematoxyline en Eosine (H&E)Beyotime BiotechnologyC0105S
HRP substraatMillipore CorporationP90720
HRP-geconjugeerd Affinipure Geit Anti-Muis IgG(H+L)ProteintechSA00001-1
HRP-geconjugeerd Affinipure Geit Anti-Konijn IgG(H+L)ProteintechSA00001-2
ImmPACT[R] DAB EqV Peroxidase (HRP) SubstraatVector LaboratoriesSK-4103-100
Masson's Trichrome Stain KitSolarbioG1340
MethanolMacklin
NicotineSigmaN-3876
fosfaatbufferoplossing (PBS) BiosharpBL601A
fysiologische zoutoplossing The First People's Hospital of Huainan City
PMSFBeyotime BiotechnologicalST505
Positieve fluorescentiemicroscoopOlympusCorporationBX53+DP74
Voorgekleurde kleurproteïne moleculair gewicht marker, of voorgekleurde kleurproteïne ladderBeyotime BiotechnologyP0071
PVDF-membranenMillipore3010040001
RIPA Lysis BufferBeyotime BiotechnologyP0013B
SDS-PAGE gelvoorbereidingskitBeyotime BiotechnologyP0012A
SiliciumdioxideSigma#BCBV6865
TGF-βBiossbs-0086R
Vimentin polyklonaal antilichaamProteintech10366-1-AP
Naam van materiaal/ apparatuurBedrijfCatalogusnummer
0.5 mL-buisBiosharpBS-05-M
Oscillerende thermostatische metalen badAbson
Paraffine inbeddingsmachinePrecision (Changzhou) Medical Equipment Co.PBM-A
Paraffine snijderJinhua Kratai Instruments Co.
PipettenEppendorf
Gepolariseerd lichtmicroscoopOlympusBX51
PrecisiebalansAcculabALC-110.4
RODI IOT intelligent multifunctioneel waterzuiveringssysteemRSJRODI-220BN
Scilogex SK-D1807-E 3D ShakerScilogex
Kleine dier anesthesie machineAnhui Yaokun Biotech Co., Ltd.ZL-04A
Universele pipettentipsKIRGENKG1011
Universele pipettentipsKIRGENKG1212
Universele pipettentipsKIRGENKG1313
Vortex mixers VWR
Naam van materiaal/ apparatuur
Adobe Illustrator
ImageJ
Photoshop
Prism7.0

Referenties

  1. Wonnacott, S. Presynaptic nicotinic ACh receptors. Trends in Neurosciences. 20 (2), 92-98 (1997).
  2. Berry, K., et al. Association of electronic cigarette use with subsequent initiation of tobacco cigarettes in US youths. JAMA Network Open. 2 (2), 187794(2019).
  3. Masso-Silva, J., et al. Chronic e-cigarette aerosol inhalation alters the immune state of the lungs and increases ACE2 expression, raising concern for altered response and susceptibility to SARS-CoV-2. Frontiers in Physiology. 12, 649604(2021).
  4. Cisneros-Lira, J., Gaxiola, M., Ramos, C., Selman, M., Pardo, A. Cigarette smoke exposure potentiates bleomycin-induced lung fibrosis in guinea pigs. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 285 (4), 949-956 (2003).
  5. Sager, T., et al. Tobacco smoke exposure exacerbated crystalline silica-induced lung toxicity in rats. Toxicological Sciences. 178 (2), 375-390 (2020).
  6. Zhou, L., et al. Cigarette smoking aggravates bleomycin-induced experimental pulmonary fibrosis. Toxicology Letters. 303, 1-8 (2019).
  7. Liu, J., et al. Behavior and hippocampal Epac signaling to nicotine CPP in mice. Translational Neuroscience. 10, 254-259 (2019).
  8. Cao, J., et al. RNA deep sequencing analysis reveals that nicotine restores impaired gene expression by viral proteins in the brains of HIV-1 transgenic rats. PLoS One. 8 (7), 68517(2013).
  9. Zhao, Y., et al. Silica particles disorganize the polarization of pulmonary macrophages in mice. Ecotoxicology and Environmental Safety. 193, 110364(2020).
  10. Tang, Q., et al. Pirfenidone ameliorates pulmonary inflammation and fibrosis in a rat silicosis model by inhibiting macrophage polarization and JAK2/STAT3 signaling pathways. Ecotoxicology and Environmental Safety. 244, 114066(2022).
  11. Hinz, B., et al. The myofibroblast: One function, multiple origins. The American Journal of Pathology. 170 (6), 1807-1816 (2007).
  12. Liu, Y., et al. Long non-coding RNA-ATB promotes EMT during silica-induced pulmonary fibrosis by competitively binding miR-200c. Biochimica et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1864 (2), 420-431 (2018).
  13. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
  14. Chellian, R., et al. Rodent models for nicotine withdrawal. Journal of Psychopharmacology. 35 (10), 1169-1187 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

blootstelling aan nicotinesilica muismodellongfibrosepulmonale fibrosesubcutane injectienasale silica blootstellingimmunohistochemische kleuringcollagedepositieTGF b ta n
Nicotine gebruiken in een aan silica blootgesteld muismodel om de overgang van longepitheel naar mesenchym te bevorderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.