Methodenartikel

Celgebaseerd elektrisch impedantieplatform om Zika-virusremmers in realtime te evalueren

DOI:

10.3791/65149

⸱

24 maart 2023

 ,  , 
1Department of Microbiology, Immunology and Transplantation, Rega Institute for Medical Research, Laboratory of Virology and Chemotherapy, KU Leuven

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier demonstreren we het gebruik van celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) als een zeer eenvoudige en eenvoudige methode om Zika-virusinfectie en -replicatie in menselijke cellen in realtime te bestuderen. Bovendien is de CEI-test nuttig voor de evaluatie van antivirale verbindingen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) -technologie meet veranderingen in impedantie veroorzaakt door een groeiende of gemanipuleerde aanhangende celmonolaag op kweekplaatputten ingebed met elektroden. De technologie kan worden gebruikt om de gevolgen van Zika-virus (ZIKV) -infectie en adherente celreplicatie in realtime te volgen, omdat dit virus zeer cytopathogeen is. Het is een eenvoudige test die geen gebruik van labels of invasieve methoden vereist en het voordeel heeft dat het realtime gegevens oplevert. De kinetiek van ZIKV-infectie is sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn, virusstam en multipliciteit van infectie (MOI), die niet gemakkelijk kunnen worden bestudeerd met conventionele eindpunttests. Bovendien kan de CEI-test ook worden gebruikt voor de evaluatie en karakterisering van antivirale verbindingen, die ook dynamische remmende eigenschappen kunnen hebben in de loop van de infectie. Dit methodeartikel geeft een gedetailleerde uitleg van de praktische uitvoering van de CEI-test en de mogelijke toepassingen ervan in ZIKV-onderzoek en antiviraal onderzoek in het algemeen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uitbraken van het Zika-virus (ZIKV) gaan gepaard met ernstige ziektecomplicaties, zoals microcefalie en guillain-barresyndroom 1,2,3. Hoewel toekomstige epidemieën plausibel zijn vanwege verschillende risicofactoren, zoals de verspreiding van muggenvectoren en de toenemende verstedelijking, heeft tot op heden nog geen vaccin of antiviraal medicijn 3,4 op de markt gebracht. Daarom moeten traditionele ZIKV-onderzoeksmethoden worden aangevuld met nieuwe hulpmiddelen om dit virus en zijn potentiële antivirale verbindingen te bestuderen. Antiviraal onderzoek is vaak gebaseerd op fenotypische assays, waarbij het eindpunt de aanwezigheid van een specifieke parameter is, zoals het optreden van een virus-geïnduceerd cytopathisch effect (CPE) of de productie van een bepaald virus-geïnduceerd eiwit door middel van een reportergen 5,6,7. Deze methoden hebben echter eindpuntuitlezingen, zijn arbeidsintensief en vereisen mogelijk complexe analyse. Daarom bieden op impedantie gebaseerde methoden een aantrekkelijk alternatief.

Celgebaseerde elektrische impedantie (CEI) wordt gedefinieerd als de weerstand tegen stroom van de ene elektrode naar de andere, veroorzaakt door een aanhangende cellaag gezaaid op elektrodehoudende putten. De gevestigde CEI-technologie die in deze methodologie wordt gebruikt, is Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS), oorspronkelijk ontwikkeld door Giaever en Keese 8,9. Dit wordt gebruikt in een breed veld van biologische onderzoeksdomeinen, zoals kankermetastase, toxicologie en wondgenezing10,11,12. Het principe is gebaseerd op een elektrisch veld dat wordt gegenereerd door een continue veeg van wisselstroom (AC) spanningen over een bereik van frequenties13. De cellen worden blootgesteld aan deze niet-invasieve elektrische velden en met vooraf bepaalde intervallen worden de impedantieveranderingen veroorzaakt door celgroei of veranderingen in celtrouw of morfologie gemeten14. Bovendien leidt veranderde levensvatbaarheid van cellen ook tot impedantieveranderingen, waardoor de technologie een nuttig hulpmiddel is om infectie met cytopathogene virussen te monitoren15,16,17. Omdat morfologische veranderingen van de cellaag op nanoschaal worden gedetecteerd, biedt de technologie een zeer gevoelig detectiemiddel. De CEI-test die in dit artikel wordt beschreven, is een eenvoudige, niet-invasieve, real-time, labelvrije methode om de impedantieveranderingen van de cellaag in de loop van de tijd te meten.

Hoewel CEI niet is gebruikt om het verloop van ZIKV-infectie of de potentiële antivirale middelen te evalueren, is het gebruik ervan als diagnostisch hulpmiddel vóór18 onderzocht. In een recente studie werd het gebruik van de CEI-test om de antivirale activiteit van verschillende ZIKV-remmers in A549-cellen te bepalen voor het eerst gevalideerd19. Dit artikel over methoden beschrijft deze CEI-test in meer detail en breidt deze uit naar verschillende adherente cellijnen, evenals een verscheidenheid aan ZIKV-stammen bij verschillende multiplicities of infection (MOI). Hiermee wordt het veelzijdige gebruik van deze methode in flavivirus antiviraal onderzoek aangetoond. De methode heeft het cruciale voordeel van real-time celmonitoring, die de detectie van belangrijke infectietijdpunten en de dynamische remmende activiteit door potentiële antivirale verbindingen mogelijk maakt. Alles bij elkaar biedt de CEI-technologie een krachtig en waardevol hulpmiddel om het huidige scala aan antivirale methodologieën aan te vullen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle beschreven stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een laminaire flowkast van een Biosafety level 2 laboratorium. Alle gebruikte virussen werden verkregen en gebruikt zoals goedgekeurd, volgens de regels van een Belgische institutionele toetsingscommissie (Departement Leefmilieu, Natuur en Energie, protocol SBB 219 2011/0011) en het Bioveiligheidscomité van de KU Leuven.

1. Onderhoud van celkweek

OPMERKING: Dit protocol wordt uitgevoerd met een selectie van cellijnen, maar kan natuurlijk worden aangepast aan elke aanhangende cellijn, waarbij alleen optimalisatie van de celzaaidichtheid nodig is.

  1. Kweek de A549 humane long adenocarcinoom cellijn, de U87 humane maligne glioblastoom cellijn en de HEL 299 humane embryonale long fibroblastcellen in T75 kweekkolven bij 37 °C en 5% CO2 in een bevochtigde couveuse.
  2. Subcultuur de cellen op 80% -95% confluentie. Alle reagentia moeten op kamertemperatuur (RT) zijn voordat de cellen worden gekweekt.
  3. Verwijder het geconditioneerde kweekmedium uit de cellen. Gebruik 5 ml Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) om de cel monolaag eenmaal te wassen.
  4. Verdeel 1 ml 0,25% trypsine-ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) gelijkmatig over de celmonolaag. Incubeer vervolgens gedurende maximaal 3 minuten bij 37 °C totdat de cellen beginnen los te komen.
  5. Voeg 9 ml vers volledig groeimedium toe (zie materiaaltabel voor meer informatie). Pipetteer zachtjes op en neer om de cellen te resuspenderen.
  6. Breng het gewenste volume celsuspensie over in een nieuwe T75-kweekkolf en voeg een geschikt volume vers groeimedium toe om een totaal volume van 15 ml te verkrijgen.
    OPMERKING: De in vitro cellijnen die in dit protocol worden gebruikt, worden gesubcultureerd in verdunningen van 1:4 tot 1:10, afhankelijk van de specifieke cellijn, om ideale groeiomstandigheden mogelijk te maken. Subculturen worden elke 3-4 dagen uitgevoerd, dus het gewenste celsuspensievolume kan ook variëren op basis van het aantal incubatiedagen.

2. Voorbereiding van CEI-plaat

  1. Neem een 96-putplaat met interdigitated elektroden (zie Materiaaltabel) en vul alle putjes met 100 μL groeikweekmedium.
  2. Vul de ruimtes tussen de putten met DPBS.
    OPMERKING: Dit wordt gedaan om het randeffect te verminderen als gevolg van verdamping die wordt waargenomen bij het kweken van cellen in 96-putplaten.
  3. Incubeer de plaat gedurende 4 uur bij 37 °C in een incubator met 5% CO2.

3. Zaaien van cellen

  1. Maak de cellen los van de kweekkolf, zoals beschreven in rubriek 1, en resuspensie in vers groeimedium in een buis van 50 ml.
  2. Tel het aantal levensvatbare cellen met behulp van de methode van keuze.
    OPMERKING: In het geval van A549-cellen bereikt de levensvatbaarheid over het algemeen ~ 100%. Om het celnummer te bepalen, gebruiken we een geautomatiseerd celanalysesysteem op basis van acridinesinaasappel / propidiumjodidekleuring (zie tabel met materialen). Andere methoden voor het tellen van cellen werken even goed.
  3. Resuspendeer de cellen in vers groeimedium om de gewenste celdichtheid te verkrijgen. In deze studie is de optimale A549-celdichtheid 0,15 × 106 (levensvatbare) cellen / ml.
  4. Haal de 96-well plaat met interdigitated elektroden uit de incubator en verwijder het medium met een meerkanaals pipet.
  5. Doseer 100 μL van de celsuspensie (overeenkomend met 15 × 103 cellen in dit geval) per put in de 96-putplaat.
  6. Laat de cellen gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur balanceren voordat u ze in het CEI-apparaat plaatst.

4. De CEI-test instellen en uitvoeren

  1. Plaats de incubator met de CEI-apparaatplaathouder op 37 °C en 5% CO2.
  2. Plaats de 96-putplaat in het apparaat.
  3. Open de software van het apparaat en stel een nieuw experiment in door te klikken op Instellen in het deelvenster Gegevens verzamelen. Wacht tot de laptop is aangesloten op het ECIS-apparaat en configureer de plaat door de impedanties van de putten te controleren. Controleer of alle putten correct zijn geconfigureerd, zoals aangegeven door een groene kleur. Als dit niet het geval is, herhaalt u stap 4.2 totdat alle putjes groen zijn.
  4. Selecteer in het deelvenster Putconfiguratie het arraytype op basis van de gebruikte cultuurware.
  5. Selecteer Multiple Frequency/Time mode.
    OPMERKING: In deze modus meet het apparaat impedantieveranderingen bij een reeks frequenties.
  6. Start de meting door op Start te klikken.
    OPMERKING: Real-time impedantie kan worden bewaakt op de interface van de software. Selecteer de gewenste frequentie die moet worden weergegeven. In dit voorbeeld wordt gekozen voor 16 kHz.

5. Samengestelde bereiding en incubatie

OPMERKING: Als voorbeeld van een antivirale verbinding wordt labyrintopptine A1 gebruikt (zie materiaaltabel). Omdat dit protocol kan worden gegeneraliseerd naar alle verbindingen met potentiële antivirale activiteit, noemen we het 'de verbinding'.

  1. Laat het volledige celkweekmedium zonder toevoeging van foetaal runderserum (FBS) (aangeduid als 'assaybuffer') in evenwicht zijn bij RT.
  2. Bewaar de verbindingen op ijs.
  3. Bereid een 10x geconcentreerde verdunning van elke verbinding in testmedium in polypropyleenbuizen van 5 ml.
  4. Verdun de verbindingen serieel in testmedium in polypropyleenbuizen van 5 ml om de gewenste 10x-concentraties te verkrijgen.
  5. Pauzeer het CEI-apparaat door te klikken op Onderbreken in het deelvenster Instellingen voor gegevensverzameling. Wacht tot het huidige tijdstip is voltooid en haal de 96-putplaat eruit.
  6. Controleer de hechting en monolaagvorming van de cellen onder een lichtmicroscoop.
  7. Verwijder 20 μL uit elke put met een meerkanaals pipet.
  8. Voeg 20 μL samengestelde oplossing of voertuig toe in de gewenste putjes. Bereid een lay-out voor met de specifieke voorwaarden voor goed pipetteren.
  9. Incubeer de plaat gedurende 15 minuten bij 37 °C met 5% CO2.
    OPMERKING: Voor deze incubatiestap wordt een normale celincubator gebruikt in plaats van een CEI-apparaat. Celcontrole (CC) putten zijn met voertuigen behandelde putten.

6. Virusvoorbereiding en infectie

  1. Ontdooi een flesje virusmateriaal. In dit voorbeeld worden ZIKV MR766 en ZIKV PRVABC59 gebruikt.
  2. Bereid virusverdunningen bij de gewenste MOI of verdunningen in testmedium in een polypropyleenbuis van 15 ml.
    OPMERKING: In dit representatieve voorbeeld worden MOI 0.5, 0.1, 0.05, 0.01, 0.005, 0.001, 0.005 en 0.00005 gebruikt.
  3. Voeg 100 μL virusverdunning toe in de toegewezen putjes van de 96-putplaat. Voeg assay medium toe aan de CC wells.
  4. Ontsmet de gebruikte viruscontainers.
  5. Plaats de plaat terug in het CEI-apparaat en ga door met de metingen gedurende 6 opeenvolgende dagen door op Experiment hervatten te klikken.
    OPMERKING: Virusbeheersingsputten (VC) zijn met voertuigen behandelde geïnfecteerde cellen, terwijl in CC-putten testmedium wordt toegevoegd in plaats van virusverdunning. Als de cytotoxiciteit van de verbindingen wordt geëvalueerd, voeg dan 100 μL testbuffer toe in plaats van virusverdunning.

7. Data-analyse

  1. Beëindig het experiment door op Voltooien te klikken en voeg optionele samenvattingsopmerkingen toe, zoals informatie over de specifieke experimentele omstandigheden in het weergavevenster. Klik op OK wanneer het verzamelen van gegevens is voltooid.
  2. Selecteer de gewenste frequentie in het grafiekvenster waarin het grootste impedantieverschil tussen CC en VC wordt gemeten aan het einde van het experiment.
    1. Om de beste frequentie te bepalen, voert u een proefexperiment uit met niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen en kiest u de frequentie die - op het tijdstip waarop de impedantie van de geïnfecteerde cellen is gedaald tot het basisniveau - leidt tot het grootste waargenomen impedantieverschil tussen de niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde cellen. In het geval van A549-cellen die zijn geïnfecteerd met ZIKV, is dit 16 kHz.
  3. Als u alle gegevens in een spreadsheetindeling wilt exporteren, controleert u of alle putjes zijn geselecteerd in het deelvenster Putconfiguratie en klikt u op Bestand | Gegevens exporteren | Grafiekgegevens.
  4. Normaliseer de gegevens door de gemiddelde VC-impedantiewaarde die aan het einde van het experiment is gemeten af te trekken van alle gegevenspunten en deze te delen door de gemiddelde CC-impedantiewaarde van het laatste tijdstip dat vóór infectie is gemeten.
  5. Plot de genormaliseerde gegevens in de functie van de tijd om CEI-profielgrafieken te verkrijgen.
  6. Bereken het genormaliseerde gebied onder de curve (AUCn) van elke aandoening om parameters te bepalen zoals 50% remmende concentraties (IC50).
  7. Bereken andere nuttige parameters, zoals CIT50, om bijvoorbeeld de infectiviteit van verschillende virusstammen te vergelijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit artikel wordt het gebruik van de CEI-test in ZIKV-onderzoek in detail beschreven. De workflow van deze test wordt geïllustreerd in figuur 1. We demonstreren het gemak van real-time monitoring van ZIKV-infectie in een gewenst celtype, evenals de evaluatie van infectieremming door een antivirale verbinding. Als antiviraal voorbeeld gebruiken we het goed beschreven peptide labyrinthopeptine A1 (Laby A1); We noemen dit 'de verbinding', omdat de specifieke eigenschappen ervan buiten het bestek van dit artikel vallen en elders worden besproken20,21. Van belang is dat de reproduceerbaarheid van de methode niet wordt besproken in de resultatensectie, omdat we ons willen concentreren op de individuele impedantieprofielen die zijn verkregen met behulp van de methodologie. Dit is echter al eerder beschreven19.

In de eerste reeks experimenten tonen we het belang aan van celdichtheidsoptimalisatie bij het uitvoeren van CEI-infectietests (figuur 2). Wanneer er te veel cellen worden gezaaid, is de celmonolaag volgroeid en kan deze zich niet verder verspreiden over de CEI-elektroden. Dit leidt tot een kleiner verschil tussen CC en VC, en dus een lagere resolutie, waardoor het detectievenster van antivirale activiteit afneemt. Dit wordt goed geïllustreerd in figuur 2E. Voor bepaalde grotere celtypen, zoals U87-cellen, kan het te dicht zaaien van cellen zelfs leiden tot volledige loslating van de celmonolaag bij het manipuleren van de plaat, zoals hier wordt aangetoond (figuur 2F). Dit wordt ook microscopisch waargenomen.

Figuur 2 laat ook zien dat de test zeer nuttig is voor het uitvoeren van celgevoeligheidsstudies. Uit figuur 2A,B blijkt duidelijk dat de infectiekinetiek sterk afhankelijk is van het celtype. Figuur 2C laat zien dat U87-cellen alleen gevoelig zijn voor ZIKV-infectie bij hoge MOI's.

In de tweede reeks experimenten wordt het veelzijdige gebruik van de CEI-infectietest benadrukt met behulp van verschillende ZIKV-stammen bij verschillende MOI's en in de aanwezigheid van een goed beschreven antivirale verbinding (figuur 3). Deze experimenten worden uitgevoerd met A549-cellen, een model dat vaak wordt gebruikt in flavivirusonderzoek22,23. Deze cellijn is ook gebruikt in andere studies die de geschiktheid ervan hebben aangetoond in CEI-testen24. Ten eerste wordt de infectiekinetiek door een representatieve ZIKV-stam van de Afrikaanse afstamming MR766 vergeleken met die van de Aziatische afstamming PRVABC59. Figuur 3A laat zien dat beide stammen vergelijkbare CEI-patronen hebben, waarbij PRVABC59 iets langzamere CPE-inducerende eigenschappen heeft. Dit komt ook tot uiting in de CIT50-waarden (figuur 3B). Deze interessante parameter werd voor het eerst geïntroduceerd door Fang et al.16 en houdt rekening met de kinetiek van CEI-metingen. Het wordt gedefinieerd als de tijd die nodig is om de impedantie met 50% te verminderen in vergelijking met de celcontrole.

Vervolgens werden de cellen geïnfecteerd met drie verschillende MOI's van ZIKV MR766 of PRVABC59, in de aan- of afwezigheid van verschillende concentraties van verbindingen, en de impedantieprofielen werden gecontroleerd. Zoals kan worden waargenomen in figuur 3C-H, remmen of vertragen bepaalde concentraties van verbindingen de impedantieval veroorzaakt door ZIKV-infectie. Dit wordt ook weerspiegeld wanneer de AUC-waarden worden berekend. De CEI-testresultaten tonen ook visueel aan dat de antivirale activiteit afhankelijk is van de MOI en van het tijdstip van potentie-evaluatie. AUCn-berekeningen kunnen worden gebruikt om IC50-waarden te bepalen, zoals weergegeven in figuur 3I. Ten slotte laat figuur 3H zien dat CIT50-waarden ook kunnen worden gebruikt om samengestelde potenties te bepalen en te vergelijken. Inactieve verbindingen of concentraties van verbindingen worden gekenmerkt door CEI-profielen, AUC en CIT50-waarden die vergelijkbaar zijn met die van VC.

figure-results-1
Figuur 1: Schematisch overzicht van de workflow van de assay. De tijdlijn en de verschillende hanterings- en incubatiestappen van de CEI-test worden hier weergegeven. Afkortingen: CEI = celgebaseerde elektrische impedantie; ZIKV = Zika-virus; D = dagen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Genormaliseerde CEI-profielen van ZIKV-geïnfecteerde cellen bij verschillende dichtheden. (A,D) A549, (B,E) HEL 299, of (C,F) U87 cellen werden gezaaid op (A-C) 15.000-20.000 ("optimaal") of (D-F) 75.000 ("suboptimale") cellen per put in een 96-well CEI-plaat. Na 24 uur impedantiemonitoring werden de cellen geïnfecteerd met tienvoudige MOI-verdunningen van ZIKV MR766. De impedantie werd verder gecontroleerd gedurende 5 opeenvolgende dagen. CEI-profielen (gemiddelde ± bereik van twee technische replicaties) van een representatief experiment worden weergegeven. Afkortingen: CEI = celgebaseerde elektrische impedantie; MOI = veelvoud van infectie; ZIKV = Zika-virus; Norm = genormaliseerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Genormaliseerde CEI-profielen van A549-cellen na infectie met twee ZIKV-stammen en remming door een antivirale verbinding. (A) Adherente A549-cellen werden geïnfecteerd met verschillende MOI's van ZIKV MR766 of ZIKV PRVABC59 en de impedantie werd continu gecontroleerd. Gemiddelde ± SD van drie technische replicaties van een representatief experiment wordt getoond. (B) CIT50-waarden werden berekend op basis van het CEI-profiel van A en vergeleken. Het gemiddelde ± SD van drie uitgevoerde technische replicaties wordt weergegeven. (C-H) Aanhangende A549-cellen werden behandeld met verschillende concentraties van verbindingen en vervolgens geïnfecteerd met een specifieke MOI van ZIKV MR766 (C-E) of ZIKV PRVABC59 (F-H). De impedantie werd continu gemonitord. Het gemiddelde ± bereik van twee technische replicaties van een representatief experiment wordt weergegeven. (I) Om de remming van verbindingen te vergelijken met verschillende ZIKV-stammen en verdunningen, werd de AUC n berekend en werden remmende percentages bepaald door alle omstandigheden af te trekken van de CC AUC n en te delen door de VC AUCn. (J) De CIT50-waarden van het experiment in C-H werden berekend om de verschillende ZIKV-stammen en MOI te vergelijken. Het gemiddelde ± bereik van twee technische replicaties wordt weergegeven. Afkortingen: CEI = celgebaseerde elektrische impedantie; MOI = veelvoud van infectie; ZIKV = Zika-virus; Norm = genormaliseerd; CIT 50 = tijdstip waarop de impedantie met50% afnam ten opzichte van onbehandelde controle; AUC = oppervlakte onder de curve; CC = celbesturing; VC = virusbestrijding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft het gebruik van de CEI-test in ZIKV-antiviraal onderzoek. De test heeft het voordeel van real-time monitoring en kan daarom worden gebruikt om de kinetiek van ZIKV-infectie en antivirale remming met selectieve verbindingen te evalueren. De gegevens die met deze methode worden verkregen, maken een objectieve en visuele observatie van de door het virus geïnduceerde CPE en de potentie van een potentiële antivirale verbinding mogelijk.

Aangezien CEI een zeer gevoelige methode is, moet grote voorzichtigheid worden betracht bij het uitvoeren van deze cellulaire test. Het is van cruciaal belang dat nauwkeurig pipetteren wordt uitgevoerd om pipetteervariatie zoveel mogelijk te voorkomen. Bovendien moeten andere factoren die de experimentele uitkomsten kunnen beïnvloeden, zoals het aantal cellen en de gebruikte virale voorraad, constant worden gehouden tussen de herhalingen van het experiment. Dit zijn factoren die de kinetiek van celgroei en infectie sterk beïnvloeden en daarom kunnen leiden tot variatie in berekende CIT50-waarden en/of andere parameters.

Bij het uitvoeren van de CEI-test in aanwezigheid van (potentiële) antivirale verbindingen is het belangrijk om te bepalen of ze de impedantie van de cellen beïnvloeden in afwezigheid van een virus. De techniek is zo gevoelig dat impedantieveranderingen ver onder de cytotoxische concentraties van de verbinding kunnen worden gemeten19.

Hoewel in dit artikel alleen ZIKV-gegevens worden getoond, kan de test eenvoudig worden toegepast op andere cytopathogene (flavi) virussen, met slechts minimale optimalisatie-inspanning, zoals optimale CEI-monitoringfrequentiebepaling. Aanpassingen van de CEI-test zijn toegepast met verschillende menselijke en dierlijke virussen, zoals chikungunya, influenza A en herpesvirussen bij mens en paard25,26,27,28. Hier wordt het ook gebruikt als een eenvoudige methode voor de kwantificering van virale titers of voor de identificatie van antivirale verbindingen. Deze studies gebruikten real-time celanalyse, een alternatieve CEI-methode.

Het gebruik van de CEI-technologie is beperkt tot adherente celtypen, omdat het principe van de test afhankelijk is van de eigenschappen van adherente cellen om zich over de in elektroden ingebedde putten te verspreiden. Putoppervlakcoatings zoals fibronectine kunnen worden gebruikt om de celaanhechtingte verbeteren 29. De methodologie heeft enkele andere nadelen, de eerste heeft betrekking op de kosten. Afgezien van de investering in het CEI-bewakingsapparaat en de bijbehorende hard- en software, zijn de verbruiksartikelen ook wat duur. Verder, omdat het protocol vereist dat virale infectie gedurende meerdere dagen wordt gevolgd, kan één 96-well-plaat per week worden geëvalueerd. Samen met de hoge kosten beperkt dit het gebruik tot instellingen voor lage tot gemiddelde doorvoer.

Vanwege deze doorvoerproblemen is de technologie niet geschikt voor antivirale screeningsinstellingen. Het is echter zeer aantrekkelijk in de eerste experimentele fasen, bijvoorbeeld bij het evalueren van de celgevoeligheid voor de studie van ZIKV-infectie in een bepaalde ziektegerelateerde omgeving. De technologie is ook nuttig met getransfecteerde of knock-out cellijnen om gemakkelijk veranderingen in infectiekinetiek waar te nemen, bijvoorbeeld in de aan- of afwezigheid van bepaalde ingangsreceptoren. Dit is interessant bij het onderzoeken van de betrokkenheid van cellulaire factoren bij ZIKV-infectie. Verder kan in latere preklinische fasen, wanneer een bepaalde hoofdkandidaat is geselecteerd, de CEI-test worden gebruikt voor verdere diepgaande karakterisering van een geselecteerde verbinding. CEI-biosensoren kunnen ook worden gewijzigd door bepaalde bioherkenningselementen, zoals virusspecifieke antilichamen, te immobiliseren voor de detectie vanvirussen 18. Al met al benadrukt dit het veelzijdige gebruik van CEI in een virologische omgeving.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bevestigen dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Clément Heymann en Gorrit Lootsma voor het proeflezen van het manuscript. De studie werd ondersteund door interne subsidies van het Laboratorium voor Virologie en Chemotherapie (Rega Instituut, KU Leuven).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A549-cellenAmerican Type Culture Collection (ATCC)CCL-185Deze cellen worden gekweekt in MEM Rega-3 aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine, 0,075% natriumbicarbonaat.
Acridine Orange/Propidium Iodide StainLogos BiosystemsF23001Live/dead-kleuring
Cellstar polypropyleenbuizen, 15 mLGreiner bio-one1,88,271
Cellstar polypropyleenbuizen, 50 mLGreiner bio-one2,27,261
Dulbecco's Modified Essential Medium (DMEM)Gibco, Thermo Fisher Scientific41965-039Celkweekmedium voor U87 en HEL 299-cellen
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)Gibco, Thermo Fisher Scientific14190-094
ECIS cultureware 96W20idfApplied BioPhysics96W20idf PETTestplaat voor CEI-apparaat
Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) Z array stationApplied BioPhysicsCEI-apparaat, inclusief 96-wells station, externe besturingsmodule en laptop met besturings-, acquisitie- en weergavesoftware. De nodige software is geïnstalleerd voor verzending. OPMERKING: dit apparaat is momenteel uit productie en is vervangen door het meer geavanceerde ECIS Z-Theta-apparaat
Falcon polystyreenbuizen, 5 mLCorning352054
Fetal Bovine Serum (FBS)CytivaSV30160.03Celkweekmediumadditief voor alle gebruikte cellen
HEL 299-cellenATCCCCL-137Deze cellen worden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS en 0,01 M HEPES.
HEPES-buffer, 1 MGibco, Thermo Fisher Scientific15630-056Celkweekmediumadditief voor U87-cellen
Labyrinthopeptin A1Vriendelijk geschonken door Prof. Dr. Roderich Süssmuth, Technische Universität Berlijn, DuitslandAntiviraal verbinding gebruikt als voorbeeld in dit protocol. Het is opgelost in DMSO.
L-Glutamine, 200 mMGibco, Thermo Fisher Scientific25030-024Celkweekmediumadditief voor A549-cellen
Luna cell counting slidesLogos BiosystemsL12001
Luna-FL dubbele fluoresceine celtellerLogos BiosystemsL20001Cellevensvatbaarheidsteller
Minimum Essential Medium Rega-3 (MEM Rega-3)Gibco, Thermo Fisher Scientific19993013Celkweekmedium voor A549-cellen
Natriumbicarbonaat, 7,5%Gibco, Thermo Fisher Scientific25080-060Celkweekmediumadditief voor A549-cellen
Weefselkweekfles T75TPPY9076
Trypsine-EDTA, 0,25%Gibco, Thermo Fisher Scientific25200-056Dissociëringsreagens
U87-cellenATCCHTB-14Deze cellen worden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% FBS en 0,01 M HEPES.
 Virkon Rely+On-tablettenLanxess115-0020Desinfectieoplossing
Zika-virus (ZIKV) MR766ATCCVR-84ZIKV-prototypestam, geïsoleerd uit sentinel Rhesus-aap in Oeganda in 1968
ZIKV PRVABC59ATCCVR-1843ZIKV-stam geïsoleerd van een patiënt in Puerto Rico in 2015

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao-Lormeau, V. M., et al. Guillain-Barré Syndrome outbreak associated with Zika virus infection in French Polynesia: a case-control study. Lancet. 387 (10027), 1531-1539 (2016).
  2. Mlakar, J., et al. Zika virus associated with microcephaly. The New England. Journal of Medicine. 374 (10), 951-958 (2016).
  3. Pierson, T. C., Diamond, M. S. The emergence of Zika virus and its new clinical syndromes. Nature. 560 (7720), 573-581 (2018).
  4. Pergolizzi, J., et al. The Zika virus: Lurking behind the COVID-19 pandemic. Journal of Clinical Pharmacy and Therapeutics. 46 (2), 267-276 (2021).
  5. Bernatchez, J. A., et al. Development and validation of a phenotypic high-content imaging assay for assessing the antiviral activity of small-molecule inhibitors targeting Zika virus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (10), e00725(2018).
  6. Zou, J., Shi, P. Y. Strategies for Zika drug discovery. Current Opinion in Virology. 35, 19-26 (2019).
  7. Mottin, M., et al. Discovery of new Zika protease and polymerase inhibitors through the open science collaboration Project OpenZika. Journal of Chemical Information and Modeling. 62 (24), 6825-6843 (2022).
  8. Giaever, I., Keese, C. R. Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field. Proceedings of the National Academy of Sciences. 81 (12), 3761-3764 (1984).
  9. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366 (6455), 591-592 (1993).
  10. Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. Journal of Visualized Experiments. (50), e2792(2011).
  11. Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric cell-substrate impedance sensing for the quantification of endothelial proliferation, barrier function, and motility. Journal of Visualized Experiments. (85), e51300(2014).
  12. Li, X., et al. Hsp70 suppresses mitochondrial reactive oxygen species and preserves pulmonary microvascular barrier integrity following exposure to bacterial toxins. Frontiers in Immunology. 9, 1309(2018).
  13. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Experimental Cell Research. 259 (1), 158-166 (2000).
  14. Xu, Y., et al. A review of impedance measurements of whole cells. Biosensors and Bioelectronics. 77, 824-836 (2016).
  15. Pennington, M. R., Van de Walle, G. R. Electric cell-substrate impedance sensing to monitor viral growth and study cellular responses to infection with alphaherpesviruses in real time. mSphere. 2 (2), e00039(2017).
  16. Fang, Y., Ye, P., Wang, X., Xu, X., Reisen, W. Real-time monitoring of flavivirus induced cytopathogenesis using cell electric impedance technology. Journal of Virological Methods. 173 (2), 251-258 (2011).
  17. McCoy, M. H., Wang, E. Use of electric cell-substrate impedance sensing as a tool for quantifying cytopathic effect in influenza a virus infected MDCK cells in real-time. Journal of Virological Methods. 130 (1-2), 157-161 (2005).
  18. Stukovnik, Z., Bren, U. Recent developments in electrochemical-impedimetric biosensors for virus detection. International Journal of Molecular Sciences. 23 (24), 15922(2022).
  19. Oeyen, M., Meyen, E., Doijen, J., Schols, D. In-depth characterization of Zika virus inhibitors using cell-based electrical impedance. Microbiology Spectrum. 10 (4), e0049122(2022).
  20. Prochnow, H., et al. Labyrinthopeptins exert broad-spectrum antiviral activity through lipid-binding-mediated virolysis. Journal of Virology. 94 (2), e01471(2020).
  21. Oeyen, M., et al. Labyrinthopeptin A1 inhibits dengue and Zika virus infection by interfering with the viral phospholipid membrane. Virology. 562, 74-86 (2021).
  22. Vicenti, I., et al. Comparative analysis of different cell systems for Zika virus (ZIKV) propagation and evaluation of anti-ZIKV compounds in vitro. Virus Research. 244, 64-70 (2018).
  23. Gobillot, T. A., Humes, D., Sharma, A., Kikawa, C., Overbaugh, J. The robust restriction of Zika virus by type-I interferon in A549 cells varies by viral lineage and is not determined by IFITM3. Viruses. 12 (5), 503(2020).
  24. Verma, N. K., Moore, E., Blau, W., Volkov, Y., Babu, P. R. Cytotoxicity evaluation of nanoclays in human epithelial cell line A549 using high content screening and real-time impedance analysis. Journal of Nanoparticle Research. 14, 1137(2012).
  25. Thieulent, C. J., et al. Screening and evaluation of antiviral compounds against Equid alpha-herpesviruses using an impedance-based cellular assay. Virology. 526, 105-116 (2019).
  26. Labadie, T., Grassin, Q., Batéjat, C., Manuguerra, J. -C., Leclercq, I. Monitoring influenza virus survival outside the host using real-time cell analysis. Journal of Visualized Experiments. (168), e61133(2021).
  27. Piret, J., Goyette, N., Boivin, G. Novel method based on real-time cell analysis for drug susceptibility testing of herpes simplex virus and human cytomegalovirus. Journal of Clinical Microbiology. 54 (8), 2120-2127 (2016).
  28. Zandi, K. A real-time cell analyzing assay for identification of novel antiviral compounds against chikungunya virus. Methods in Molecular Biology. 1426, 255-262 (2016).
  29. Ebrahim, A. S., et al. Functional optimization of electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) using human corneal epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 14126(2022).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Celgebaseerde impedantiereal time monitoringelektrische impedantie assayevaluatie van antivirale verbindingenvirusinfectiekinetiekmultipliciteit van infectievorming van celmonolayercytopathisch effectIC50 bepaling

Gerelateerde artikelen