Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het vaststellen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels die effectief en gestaag zuivere en levensvatbare fibroblasten kunnen leveren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie, cultuur en karakterisering van primaire dermale fibroblasten uit menselijk keloïde weefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fibroblasten, het belangrijkste celtype in keloïde weefsel, spelen een essentiële rol bij de vorming en ontwikkeling van keloïden. De isolatie en kweek van primaire fibroblasten afgeleid van keloïde weefsel vormen de basis voor verdere studies van de biologische functie en moleculaire mechanismen van keloïden, evenals nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling ervan. De traditionele methode voor het verkrijgen van primaire fibroblasten heeft beperkingen, zoals een slechte cellulaire toestand, menging met andere soorten cellen en gevoeligheid voor besmetting. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerd en gemakkelijk reproduceerbaar protocol dat het optreden van mogelijke problemen bij het verkrijgen van fibroblasten zou kunnen verminderen. In dit protocol kunnen fibroblasten 5 dagen na isolatie worden waargenomen en bijna 80% confluentie bereiken na 10 dagen cultuur. Vervolgens worden de fibroblasten gepasseerd en geverifieerd met behulp van PDGFRα- en vimentine-antilichamen voor immunofluorescentietests en CD90-antilichamen voor flowcytometrie. Kortom, fibroblasten uit keloïde weefsel kunnen gemakkelijk worden verkregen via dit protocol, dat een overvloedige en stabiele bron van cellen in het laboratorium kan bieden voor keloïde onderzoek.
Inleiding
Keloïde, een fibroproliferatieve ziekte, manifesteert zich als de continue groei van plaques die vaak de omliggende normale huid binnendringen zonder zelfbeperking en verschillende gradaties van jeuk, pijn en cosmetische en psychologische lasten voor patiënten veroorzaken1. Fibroblasten, de primaire cellen die betrokken zijn bij keloïden, spelen een essentiële rol bij de vorming en ontwikkeling van deze ziekte door overmatige proliferatie, redundante extracellulaire matrixproductie en ongeorganiseerd collageen 2,3. De onderliggende pathogenese blijft echter onduidelijk en een effectieve therapeutische methode voor keloïde ontbreekt nog steeds; Daarom is er dringend behoefte aan verder onderzoek 4,5.
Aangezien er geen ideaal diermodel is voor keloïde onderzoek in vivo 6,7, kan het bouwen van een in vitro model door het verkrijgen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels haalbaarheid en betrouwbaarheid bieden voor keloïde onderzoek 2,6. Primaire cellen zijn cellen die rechtstreeks afkomstig zijn van levend weefsel, en het wordt algemeen erkend dat deze cellen meer kunnen lijken op de fysiologische toestand en genetische achtergrond van meerdere individuen in vergelijking met cellijnen 8,9. Het kweken van primaire cellen biedt een krachtig middel om de groei en het metabolisme van cellen te bestuderen, evenals andere celfenotypen.
Op dit moment zijn er twee methoden voor het verkrijgen van primaire fibroblasten: enzymvertering en explantcultuur. Er zijn echter verschillende obstakels geïdentificeerd voor het verkrijgen van primaire fibroblasten, zoals het risico van besmetting door verschillende bacteriën of schimmels, vermenging met andere soorten cellen die niet gemakkelijk kunnen worden verwijderd, de lange periode van de kweekcyclus, de daaropvolgende veranderingen in de celkenmerken in vergelijking met de oorspronkelijke cellen, enzovoort9. Daarom is het ontwikkelen van een haalbaar en effectief proces voor het verkrijgen van primaire fibroblasten de basis voor verdere studies en toepassingen. Deze studie beschrijft een geoptimaliseerd protocol voor het extraheren van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels die effectief en gestaag zuivere en levensvatbare fibroblasten kunnen leveren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele review board van het Dermatology Hospital, Southern Medical University (2020081). Geïnformeerde toestemming van de patiënt werd verkregen voordat weefsels van de individuen werden verzameld.
1. Voorbereiding
OPMERKING: De volgende procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele omgeving onder een biologische veiligheidskast.
- Bereid het volledige kweekmedium door 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-amfotericine B-oplossing (PSA) toe te voegen aan het gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) van dulbecco met een hoog glucosegehalte.
- Bereid fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met PSA door 1% PSA toe te voegen aan 1x PBS. Bereid PBS voor met FBS door 1% FBS toe te voegen aan 1x PBS.
- Bereid verschillende gesteriliseerde scharen, tangen en scalpels voor door autoclaveren.
2. Het verkrijgen van verwijderde weefsels
- Verkrijg weefsels van keloïde patiënten door middel van een operatie. Verzamel de verse keloïde weefsels in een steriele verpakkingszak of steriele centrifugebuis en breng ze zo snel mogelijk over naar een biologische veiligheidskast in het laboratorium.
OPMERKING: In dit protocol was de grootte van het verworven keloïde weefsel ongeveer ~ 20 x 20 x 10 mm3, en de grootte kan variëren afhankelijk van de operatie.
3. Isolatie
- Verwijder het keloïde weefsel met een steriel pincet en plaats het in een steriele centrifugebuis van 50 ml met 10-25 ml PBS met 1% PSA gedurende 10 minuten. Bereid vervolgens een plaat met 6 putten voor en voeg 4 ml PBS aangevuld met 1% PSA toe aan elke put. Verwijder het weefsel met een gesteriliseerd pincet en was het twee keer met PBS aangevuld met 1% PSA. Breng met een steriele tang het weefsel achtereenvolgens over van de ene put naar de andere.
- Verwijder de vet- en epidermislagen met een chirurgische schaar of een chirurgisch scalpel en laat de dermislaag onaangeroerd. Knip en ontleed de dermislaag in3-5 mm 2 stukken met een schaar, breng deze stukken met een steriele tang over naar de volgende put en was ze opnieuw in PBS met 1% PSA-oplossing.
4. Cultuur
- Plaats de stukjes dermisweefsel in petrischaaltjes met behulp van een gesteriliseerde tang; Zorg ervoor dat het aantal stuks tussen 10 en 30 ligt en dat de afstand tussen elk stuk >5 mm is. Zet de petrischaaltjes ondersteboven in een 5% CO 2-incubator bij 37 °C gedurende 30-60 minuten tot de stukjes weefsel een beetje drogen en aan de petrischaal blijven plakken. Voeg vervolgens DMEM aangevuld met 10% FBS en 1% PSA toe en plaats de petrischalen voorzichtig in een 5% CO 2-incubator bij 37 °C.
OPMERKING: Fibroblasten zijn een morfologisch en functioneel heterogene celpopulatie. Gezien deze complexiteit moeten de isolatie- en cultuurstappen met zorg worden uitgevoerd; selecteer de keloïde dermale weefselstukjes gelijkmatig en meng deze stukjes goed voordat u ze in de petrischaal plaatst. - Vervang na 3 dagen de helft van het supernatant door een compleet kweekmedium. Verander het kweekmedium elke 2-3 dagen. Observeer de fibroblasten onder een microscoop met een vergroting van 40x elke dag.
OPMERKING: Alle stappen moeten voorzichtig worden uitgevoerd. Verplaats de petrischaal niet gedurende 2 dagen na het isoleren, omdat de weefselstukken tijd nodig hebben om zich aan de petrischalen te hechten. - Wanneer de fibroblasten die rond de weefselstukken groeien ongeveer 90% confluentie bereiken, verwijdert u de weefselstukken en het kweekmedium. Was de fibroblasten met steriele 1x PBS en voeg 2 ml steriele 1x trypsine-EDTA-oplossing toe aan de platen. Incubeer de cellen gedurende ongeveer ~3-5 minuten bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2-incubator. Tik zachtjes op de kweekschaal en observeer deze onder een microscoop. Wanneer de meerderheid van de cellen loskomt van de plaat, voeg dan 2 ml volledig medium toe om het verteringsproces te beëindigen.
- Breng de celsuspensie over in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 300 × g. Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspensie van de celkorrel in volledig medium. Zaai de fibroblasten in een celkweekschaal van 9 cm en incubeer bij 37 °C in een bevochtigde 5% CO 2-incubator.
5. Onderhoud en behoud
- Ongeveer 3-4 dagen later, wanneer de fibroblasten zijn gegroeid tot 80% confluentie, herhaalt u stap 4.2-4.4 en passeert u de fibroblasten in een verhouding van 1: 3. Gebruik de gepasseerde fibroblasten voor verdere experimenten.
OPMERKING: De fibroblastcultuur moet na 10 passages worden gestopt, omdat de cellen veranderde kenmerken kunnen gaan vertonen in vergelijking met de oorspronkelijke cellen. - Cryopreserveer de gepasseerde cellen van P1-P3 in vloeibare stikstof voor verder gebruik.
- Herhaal stap 4.2-4.3. Breng de celsuspensie over in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer de buis gedurende 3 minuten bij 300 × g. Gooi het supernatant voorzichtig weg, resuspensie van de celkorrel in 1 ml celvriesmedium met 90% FBS en 10% DMSO en breng de suspensie over in celcryobuizen.
- Verplaats de cellen in een bevroren doos en plaats de bevroren doos vervolgens in een vriezer van −80 °C. Breng de cellen na 1 dag over naar vloeibare stikstof voor langdurig behoud.
6. Identificatie van fibroblasten door immunofluorescentiekleuring
- Plaats ronde coverslips in een plaat met 24 putten en kweek de gepasseerde fibroblasten in een concentratie van 1 × 104 cellen / put. Wanneer de fibroblasten 60% confluentie bereiken, verwijdert u het kweekmedium. Voeg 1 ml 4% paraformaldehyde toe om de fibroblasten gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur te fixeren en was 3x met PBS gedurende 1 minuut elke keer.
OPMERKING: Tel het aantal cellen met behulp van een hemocytometerglaasje onder een microscoop of een automatische celteller. - Verwijder de PBS, incubeer met 0,5% Triton X-100 gedurende 20 minuten voor de permeabilisatie van celmembranen en was vervolgens 3x met PBS gedurende 1 minuut elke keer. Voeg PBS toe met 0,5% runderserumalbumine en laat 30 minuten weken. Verwijder het vervolgens en voeg het PDGFR-α / vimentine-antilichaam verdund in antilichaamverdunningsmiddel toe bij 1: 1.000. Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Verwijder de volgende dag het primaire antilichaam, was de cellen 3x met PBS gedurende 3 minuten en voeg het secundaire antilichaam Alexa Fluor-555 geiten anti-konijn IgG verdund met antilichaamverdunningsmiddel toe op 1:200 om 1 uur te weken.
- Verwijder het secundaire antilichaam en was de cellen 3x met PBS. Verwijder de ronde coverslips met een tang, leg ze op glazen dia's en voeg 50 μL 5 μg / ml 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) oplossing toe om de celkernen te kleuren. Bewaar de monsters in een natte, donkere doos en observeer ze onder een laser confocale fluorescentiemicroscoop.
OPMERKING: Voeg een negatieve controlegroep toe zonder een primair antilichaam maar met een secundair antilichaam om niet-specifieke kleuring uit te sluiten.
7. Identificatie van fibroblasten door flowcytometrie
- Verzamel de celpellet in een steriele centrifugebuis van 1,5 ml en resuspensie met 50 μL PBS met 1% FBS. Incubeer met anti-CD90 gedurende 30 minuten in het donker en voeg een anti-IgG isotypecontrole toe aan de controlegroep. Voeg vervolgens 200 μL PBS met 1% FBS toe en centrifugeer de buis gedurende 10 minuten bij 300 × g bij 4 °C.
- Verwijder het supernatant en voeg 200 μL PBS met 1% FBS toe. Resuspensie en filter de suspensie door een celzeef (70 mesh). Voeg een 5 μg/ml stockoplossing van DAPI op 1:100 toe aan het filtraat en verkrijg vervolgens de resultaten door flowcytometrie. Stel de voorwaartse verstrooiing (FSC) in als de abscis en de zijverstrooiing (SSC) als de ordinaat en omcirkel de hoofdcelpopulatie. Selecteer de celpopulatie en stel de phycoerythrin in als de abscis en de telling als de ordinaat voor analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De tijdlijn van het protocol is samengevat in figuur 1A. Enkele representatieve beelden van het isolatieproces zijn weergegeven in figuur 2; de epidermis- en vetlagen werden zorgvuldig verwijderd en de dermislaag werd gescheiden in kleine fragmenten van 3-4 mm2, die in de petrischalen werden ingeënt.
Zoals te zien is in figuur 3A, werden 5 dagen na verwerking verschillende fibroblastuitwass...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het verkrijgen van primaire fibroblasten uit keloïde weefsels is een kritische basis voor verder onderzoek. Tot nu toe waren er twee methoden voor het verkrijgen van primaire fibroblasten: enzymvertering en explantatiecultuur11,12,13,14. Beide traditionele methoden hebben echter beperkingen, zoals gevoeligheid voor besmetting, menging met andere soorten cellen, een lange kweekperiode en een laa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Er zijn geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 81903189 en 82073418) en de Science and Technology Foundation of Guangzhou (subsidienummer 202102020025).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL steriele centrifugeerbuis | JETBIOFIL | CFT002015 | |
| 15 mL steriele centrifugeerbuis | JETBIOFIL | 8076 | |
| 4% polyformaldehyd | Beyotime Biotechnology | P0099 | Cel fixatie |
| 50 mL steriele centrifugeerbuis | JETBIOFIL | 8081 | Keloïdweefsel plaatsen |
| Alexa Fluor-555 geit anti-konijn IgG | Abcam | Alexa Fluor 555 | Tweede antilichaam voor immunofluorescentiekleuringstest |
| Anti menselijk CD90 | BioLegend | B301002 | Identificeer de zuiverheid van fibroblasten |
| Antilichaam verdunningsmiddel | Beyotime Biotechnology | P0262 | |
| Biologische veiligheidskast | Thermo Scientific | 1300 series A2 | Isolatie en kweek cellen |
| Rund serum albumine | aladdin | B265993 | Blokkade voor immunofluorescentiekleuringstest |
| Koolstofdioxide incubator | ESCO | CCL-170B-8 | Gebruiken voor het kweken van cellen |
| Cel cryotubes | Corning | 43513 | Bewaar de cellen op lage temperatuur |
| Centrifuge machine | Thermo Fisher | ST 16R | Supernatant weggooien |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1006 | De celkern kleuren |
| DMSO | MP Biomedicals | 196055 | Gebruiken voor het bewaren van cellen |
| Dulbecco's gemodificeerd arendsmedium | Gibco | C11995500BT | Kweekmediumoplossing |
| Fetaal rund serum | BI | 04-001-1A | |
| Flow cytometer | BD | BD FACSCelesta | Observeren van de identiteit van cellen |
| Bevroren doos | Thermo Scientific | 5100-0050 | |
| Omgekeerd microscoop | Nikon | ECLIPSE Ts2 | |
| Laser confocale microscoop | Nikon | AIR-HD25 | Observeren van de immunofluorescentiekleuringstest |
| PDGFR-α antilichaam | CST | 3174T | Eerste antilichaam voor immunofluorescentiekleuringstest |
| Penicilline-streptomycine-Am oplossing | Solarbio | P1410 | Toevoegen aan kweekmediumoplossing om besmetting te voorkomen |
| Petrischaal | JETBIOFIL | 7556 | Fibroblasten kweken |
| Fosfaat gebufferde zoutoplossing | Gibco | C10010500BT | Kweekmediumoplossing |
| Konijn (DAIE) mAB IgG XR (R) Isotuge Control (PE) | Cell Signaling Technology | 5742S | Als controle voor flowcytometrie |
| Ronde dekglas | Biosharp | 801007 | Cellen kweek |
| Triton X 100 | Solarbio | T8200 | Gatjes in het celmembraan ponsen |
| Trypsine-EDTA | Gibco | 25200072 | Gebruikt voor het passeren van cellen |
| Vimentin antilichaam | Abcam | ab8978 | Eerste antilichaam voor immunofluorescentiekleuringstest |
Referenties
- Zhu, Y. Q., et al. Genome-wide analysis of Chinese keloid patients identifies novel causative genes. Annals Of Translational Medicine. 10 (16), 883(2022).
- Feng, F., et al. Biomechanical regulatory factors and therapeutic targets in keloid fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 13, 906212(2022).
- Cohen, A. J., Nikbakht, N., Uitto, J. Keloid disorder: Genetic basis, gene expression profiles, and immunological modulation of the fibrotic processes in the skin. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2022).
- Wang, W., et al. Current advances in the selection of adjuvant radiotherapy regimens for keloid. Frontiers in Medicine. 9, 1043840(2022).
- Ghadiri, S. J., Kloczko, E., Flohr, C. Topical treatments in the management of keloids and hypertrophic scars: A critically appraised topic. British Journal of Dermatology. 187 (6), 855-856 (2022).
- Neves, L. M. G., Wilgus, T. A., Bayat, A. In vitro, ex vivo, and in vivo approaches for investigation of skin scarring: Human and animal models. Advances in Wound Care. 12 (2), 97-116 (2023).
- Supp, D. M. Animal models for studies of keloid scarring. Advances in Wound Care. 8 (2), 77-89 (2019).
- Künzel, S. R., et al. Ultrasonic-augmented primary adult fibroblast isolation. Journal of Visualized Experiments. (149), e59858(2019).
- He, Y., et al. An improved explants culture method: Sustainable isolation of keloid fibroblasts with primary characteristics. Journal of Cosmetic Dermatology. 21 (12), 7131-7139 (2022).
- Philippeos, C., et al. Spatial and single-cell transcriptional profiling identifies functionally distinct human dermal fibroblast subpopulations. Journal of Investigative Dermatology. 138 (4), 811-825 (2018).
- Li, L., et al. Hydrogen sulfide suppresses skin fibroblast proliferation via oxidative stress alleviation and necroptosis inhibition. Medicine and Cellular Longevity. 2022, 7434733(2022).
- Zhou, B. Y., et al. Nintedanib inhibits keloid fibroblast functions by blocking the phosphorylation of multiple kinases and enhancing receptor internalization. Acta Pharmacologica Sinica. 41 (9), 1234-1245 (2020).
- Wang, X. M., Liu, X. M., Wang, Y., Chen, Z. Y. Activating transcription factor 3 (ATF3) regulates cell growth, apoptosis, invasion and collagen synthesis in keloid fibroblast through transforming growth factor beta (TGF-beta)/SMAD signaling pathway. Bioengineered. 12 (1), 117-126 (2021).
- Sato, C., et al. Conditioned medium obtained from amnion-derived mesenchymal stem cell culture prevents activation of keloid fibroblasts. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (2), 390-398 (2018).
- Li, J., et al. Long-term explant culture: An improved method for consistently harvesting homogeneous populations of keloid fibroblasts. Bioengineered. 13 (1), 1565-1574 (2022).
- Wang, Q., et al. Altered glucose metabolism and cell function in keloid fibroblasts under hypoxia. Redox Biology. 38, 101815(2021).
- Fan, C., et al. Single-cell transcriptome integration analysis reveals the correlation between mesenchymal stromal cells and fibroblasts. Frontiers in Genetics. 13, 798331(2022).
- Yao, L., et al. Temporal control of PDGFRα regulates the fibroblast-to-myofibroblast transition in wound healing. Cell Reports. 40 (7), 111192(2022).
- Domdey, M., et al. Consecutive dosing of UVB irradiation induces loss of ABCB5 expression and activation of EMT and fibrosis proteins in limbal epithelial cells similar to pterygium epithelium. Stem Cell Research. 40, 102936(2022).
- Lin, Z., et al. Renal tubular epithelial cell necroptosis promotes tubulointerstitial fibrosis in patients with chronic kidney disease. FASEB Journal. 36 (12), e22625(2022).
- Korosec, A., et al. Lineage identity and location within the dermis determine the function of papillary and reticular fibroblasts in human skin. Journal of Investigative Dermatology. 139 (2), 342-351 (2019).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
