Method Article

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

DOI:

10.3791/65172

⸱

April 7th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volwassen mesenchymale cellen hebben de afgelopen decennia een revolutie teweeggebracht in de moleculaire en celbiologie. Ze kunnen differentiëren in verschillende gespecialiseerde celtypen, naast hun grote vermogen tot zelfvernieuwing, migratie en proliferatie. Vetweefsel is een van de minst invasieve en meest toegankelijke bronnen van mesenchymale cellen. Er is ook gemeld dat het hogere opbrengsten heeft in vergelijking met andere bronnen, evenals superieure immunomodulerende eigenschappen. Onlangs zijn verschillende procedures voor het verkrijgen van volwassen mesenchymale cellen uit verschillende weefselbronnen en diersoorten gepubliceerd. Na het evalueren van de criteria van sommige auteurs, hebben we een methodologie gestandaardiseerd die toepasbaar is voor verschillende doeleinden en gemakkelijk reproduceerbaar. Een pool van stromale vasculaire fractie (SVF) uit perirenaal en epididymaal vetweefsel stelde ons in staat om primaire culturen te ontwikkelen met optimale morfologie en functionaliteit. De cellen werden waargenomen die gedurende 24 uur aan het plastic oppervlak kleefden en vertoonden een fibroblastachtige morfologie, met verlengingen en een neiging om kolonies te vormen. Flowcytometrie (FC) en immunofluorescentie (IF) technieken werden gebruikt om de expressie van de membraanmarkers CD105, CD9, CD63, CD31 en CD34 te beoordelen. Het vermogen van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC's) om te differentiëren in de adipogene afstamming werd ook beoordeeld met behulp van een cocktail van factoren (4 μM insuline, 0,5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine en 1 μM dexamethason). Na 48 uur werd een geleidelijk verlies van fibroblastoïde morfologie waargenomen en na 12 dagen werd de aanwezigheid van lipidedruppeltjes positief voor olierode kleuring bevestigd. Samenvattend wordt een procedure voorgesteld om optimale en functionele ASC-culturen te verkrijgen voor toepassing in de regeneratieve geneeskunde.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een sterke invloed gehad op de regeneratieve geneeskunde vanwege hun hoge capaciteit voor zelfvernieuwing, proliferatie, migratie en differentiatie in verschillende cellijnen 1,2. Momenteel richt veel onderzoek zich op hun potentieel voor de behandeling en diagnose van verschillende ziekten.

Er zijn verschillende bronnen van mesenchymale cellen: beenmerg, skeletspieren, vruchtwater, haarzakjes, placenta en vetweefsel, onder anderen. Ze worden verkregen van verschillende soorten, waaronder mensen, muizen, ratten, honden en paarden

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Mexicaanse richtlijnen voor dierenverzorging, gebaseerd op aanbevelingen van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Het protocol werd beoordeeld, goedgekeurd en geregistreerd door de Ethische Commissie voor Gezondheidsonderzoek van het Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Verwijdering van vetweefsel van ratten door chirurgische resectie

  1. Bereid twee conische buisjes met 20 ml steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing-antibioticum antim....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetweefsel werd verkregen van volwassen Sprague Dawley-ratten van 3-4 maanden oud en met een lichaamsgewicht van 401 ± 41 g (geometrisch gemiddelde ± SD). Een gemiddelde waarde van 3,8 g epididymaal en perirenaal vetweefsel kwam overeen met de analyse van 15 experimentele extracties. Na 24 uur kweek bleven celpopulaties aan het plastische oppervlak kleven en vertoonden ze een heterogene morfologie. De eerste passage werd gerealiseerd na 8 ± 2 dagen, met een opbrengst van 1,4 ± 0,6 x 106 cellen in een totaal va.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen vier decennia sinds de ontdekking van MSC's hebben verschillende groepen onderzoekers procedures beschreven voor het verkrijgen van MSC's uit verschillende weefsels en soorten. Een van de voordelen van het gebruik van ratten als diermodel is hun eenvoudige onderhoud en snelle ontwikkeling, evenals het gemak van het verkrijgen van MSC's uit vetweefsel. Verschillende weefselbronnen zijn beschreven voor het verkrijgen van ASC's, zoals visceraal, perirenaal, epididymaal en onderhuids vet 12,13,14,15,16.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn het Mexicaanse Instituut voor Sociale Zekerheid (IMSS) en het Kinderziekenhuis van Mexico, Federico Gomez (HIMFG) en de Bioterio-medewerkers van de IMSS Research Coordination dankbaar voor de steun die is gegeven om dit project uit te voeren. We danken de National Council of Science and Technology voor de AOC (815290) beurs en Antonio Duarte Reyes voor de technische ondersteuning in het audiovisuele materiaal.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amphotericin BHyCloneSV30078.01
Analytical balanceSartoriusAX224
Antibody anti- CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Antibody anti-C63Santa CruzSc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)RD Systems.No. F103B
Bottle Top Filter SterileCORNING10718003
Cell and Tissue Culture FlasksBIOFIL170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slidesSIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with LidCORNING25810
Centrifuge conical tubesHeTTICHROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubesFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Culture tubesGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterFree version
CytoFlex LX cytometerBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin yellowishHycel300
Ethanol 96%Baker64-17-5
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING35-010-CV
GelatinSIGMA Aldrich128111163
GentamicinGIBCO15750045
Glycerin-High PurityHerschi Trading 56-81-5
HematoxylinAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc.50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)ArandaSV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5Free version
Biological Safety Cabinet Class IINuAire12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40CK40-G100
Non-essential amino acids 100XGIBCO11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mLSarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μLFinnpipetteE97743
Micropipettes 2-20 μLFinnpipetteF54167
Micropipettes 20-200 μLFinnpipetteG32419
Micropipettes 100-1000 μLFinnpipetteFJ39895
Nitrogen tank liquidTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehydeSIGMA AldrichSLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell cultureCORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker7447-40-7
Potassium Phosphate DibasicJ.T Baker2139900
S1 Pipette FillersThermo Sc9531
Serological pipette 5 mLPYREXL010005
Serological pipette 10 mLPYREXL010010
Sodium bicarbonateJ.T Baker144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker15368426
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousJ.T Baker7558-79-4
Sodium pyruvateGIBCO BRL11840-048
Syringe Filter SterileCORNING431222
SpectrophotometerPerkinElmer Lambda 25L6020060
Titer plate shakerLAB-LINE1250
Transfer pipetsSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue stainGIBCO1198566
Trypsin From Porcine PancreasSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-64-5
Universal Blocking Reagent 10xBioGenexHK085-GP
Xilapet 2% (xylazine hydrochloride)Pet's PharmaQ-7972-025

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mesenchymal Stem CellsAdipose TissueStem Cell IsolationStromal Vascular FractionFlow CytometryImmunofluorescence AnalysisAdipogenic DifferentiationSprague Dawley RatsCell Surface MarkersRegenerative Medicine

Related Articles