Methodenartikel

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

DOI:

10.3791/65172

⸱

7 april 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Medical Research Unit in Biochemistry, Specialties Hospital, National Medical Center SXXI, Instituto Mexicano de Seguro Social, 3Department of Agricultural and Animal Production, Division of Biological and Health Science, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, 4Molecular Biology Research Laboratory, Center for Congenital Malformations, Children Hospital of Mexico Federico Gomez (HIMFG)

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volwassen mesenchymale cellen hebben de afgelopen decennia een revolutie teweeggebracht in de moleculaire en celbiologie. Ze kunnen differentiëren in verschillende gespecialiseerde celtypen, naast hun grote vermogen tot zelfvernieuwing, migratie en proliferatie. Vetweefsel is een van de minst invasieve en meest toegankelijke bronnen van mesenchymale cellen. Er is ook gemeld dat het hogere opbrengsten heeft in vergelijking met andere bronnen, evenals superieure immunomodulerende eigenschappen. Onlangs zijn verschillende procedures voor het verkrijgen van volwassen mesenchymale cellen uit verschillende weefselbronnen en diersoorten gepubliceerd. Na het evalueren van de criteria van sommige auteurs, hebben we een methodologie gestandaardiseerd die toepasbaar is voor verschillende doeleinden en gemakkelijk reproduceerbaar. Een pool van stromale vasculaire fractie (SVF) uit perirenaal en epididymaal vetweefsel stelde ons in staat om primaire culturen te ontwikkelen met optimale morfologie en functionaliteit. De cellen werden waargenomen die gedurende 24 uur aan het plastic oppervlak kleefden en vertoonden een fibroblastachtige morfologie, met verlengingen en een neiging om kolonies te vormen. Flowcytometrie (FC) en immunofluorescentie (IF) technieken werden gebruikt om de expressie van de membraanmarkers CD105, CD9, CD63, CD31 en CD34 te beoordelen. Het vermogen van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC's) om te differentiëren in de adipogene afstamming werd ook beoordeeld met behulp van een cocktail van factoren (4 μM insuline, 0,5 mM 3-methyl-iso-butyl-xanthine en 1 μM dexamethason). Na 48 uur werd een geleidelijk verlies van fibroblastoïde morfologie waargenomen en na 12 dagen werd de aanwezigheid van lipidedruppeltjes positief voor olierode kleuring bevestigd. Samenvattend wordt een procedure voorgesteld om optimale en functionele ASC-culturen te verkrijgen voor toepassing in de regeneratieve geneeskunde.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stamcellen (MSC's) hebben een sterke invloed gehad op de regeneratieve geneeskunde vanwege hun hoge capaciteit voor zelfvernieuwing, proliferatie, migratie en differentiatie in verschillende cellijnen 1,2. Momenteel richt veel onderzoek zich op hun potentieel voor de behandeling en diagnose van verschillende ziekten.

Er zijn verschillende bronnen van mesenchymale cellen: beenmerg, skeletspieren, vruchtwater, haarzakjes, placenta en vetweefsel, onder anderen. Ze worden verkregen van verschillende soorten, waaronder mensen, muizen, ratten, honden en paarden3. Van beenmerg afgeleide MSC's (BMSC's) worden al vele jaren gebruikt als een belangrijke bron van stamcellen in de regeneratieve geneeskunde en als alternatief voor het gebruik van embryonale stamcellen4. Van vetweefsel afgeleide MSC's, of van vetweefsel afgeleide stamcellen (ASC's), zijn echter een belangrijk alternatief met grote voordelen vanwege hun gemak van verzameling en isolatie, evenals de opbrengst van cellen verkregen per gram vetweefsel 5,6. Er is gemeld dat de oogstsnelheid van ASC's over het algemeen hoger is dan die van BMSCs7. Aanvankelijk werd voorgesteld dat het herstellende/regeneratieve vermogen van ASC's te wijten was aan hun vermogen om te differentiëren in andere cellijnen8. Onderzoek in de afgelopen jaren heeft echter de primaire rol van paracriene factoren die door ASC's worden vrijgegeven in hun herstelpotentieelversterkt 9,10.

Vetweefsel (AT), naast het feit dat het een energiereserve is, interageert met het endocriene, nerveuze en cardiovasculaire systeem. Het is ook betrokken bij postnatale groei en ontwikkeling, het onderhoud van weefselhomeostase, weefselherstel en regeneratie. De AT bestaat uit adipocyten, vasculaire gladde spiercellen, endotheelcellen, fibroblasten, monocyten, macrofagen, lymfocyten, preadipocyten en ASC's. Deze laatste spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun lage immunogeniciteit11,12. ASC's kunnen worden verkregen door enzymatische vertering en mechanische verwerking of door vetweefselexplantaten. Primaire culturen van ASC's zijn gemakkelijk te onderhouden, te kweken en uit te breiden. Fenotypische karakterisering van ASC's is essentieel om de identiteit van de cellen te verifiëren door de expressie van specifieke membraanmarkers te beoordelen met behulp van methoden zoals immunofluorescentie en flowcytometrie13. De International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) en de International Society for Cellular Therapy (ISCT) hebben gedefinieerd dat ASC's CD73, CD90 en CD105 uitdrukken, terwijl ze de expressie van CD11b, CD14, CD19, CD45 en HLA-DR14 missen. Deze markers, zowel positief als negatief, worden daarom als betrouwbaar beschouwd voor de karakterisering van ASC's.

Dit project was gericht op het beschrijven van een procedure voor de isolatie en identificatie van volwassen mesenchymale cellen geëxtraheerd uit het AT van ratten, omdat deze bron van cellen geen ethische uitdagingen met zich meebrengt, in tegenstelling tot embryonale stamcellen. Dit stolt de procedure als een haalbare optie vanwege de gemakkelijke toegang en de minimaal invasieve methode in vergelijking met van beenmerg afgeleide stamcellen.

Mesenchymale cellen uit deze weefselbron spelen een belangrijke rol in de regeneratieve geneeskunde vanwege hun immunomodulerende mogelijkheden en lage immuunafstoting. Daarom is de huidige studie een fundamenteel onderdeel van toekomstig onderzoek naar hun secretoom en hun toepassing als regeneratieve therapie bij verschillende ziekten, waaronder metabole ziekten zoals diabetes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle experimentele procedures werden uitgevoerd volgens de Mexicaanse richtlijnen voor dierenverzorging, gebaseerd op aanbevelingen van de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (Norma Oficial Mexicana NOM-062-200-1999, Mexico). Het protocol werd beoordeeld, goedgekeurd en geregistreerd door de Ethische Commissie voor Gezondheidsonderzoek van het Instituto Mexicano del Seguro Social (R-2021-785-092).

1. Verwijdering van vetweefsel van ratten door chirurgische resectie

  1. Bereid twee conische buisjes met 20 ml steriele 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing-antibioticum antimycotische (PBS-AA) oplossing (1x PBS, gentamicine [20 μg / ml] en amfotericine [0,5 μg / ml]) en onderhoud op ijs.
  2. Selecteer twee volwassen mannelijke Sprague Dawley-ratten (R. norvegicus) in goede gezondheidstoestand. Zorg ervoor dat de ratten tussen de 3-4 maanden oud zijn en een coporal gewicht van 350-450 g hebben.
  3. Ga over tot sedatie met 20 mg / kg xylazinehydrochloride en dien 5 minuten later een verdovingsmiddel toe met een dosis van 120 mg / kg ketaminehydrochloride intraperitoneaal. Smeer beide ogen in met een oogzalf om uitdroging te voorkomen. Bevestig vervolgens de anesthesiediepte via een gebrek aan pedaalreflex.
  4. Scheer en desinfecteer de buik- en liesstreek met een jodiumoplossing. Breng chirurgische gordijnen aan om de steriliteit te behouden. Maak vervolgens een mediane longitudinale incisie van het borstbeen naar het testiculaire gebied.
  5. Verwijder het vetweefsel rond zowel de bijbal als de nieren met een steriele tang en plaats het in de 1x PBS-AA-oplossing. Bewaar de monsters op ijs.
  6. Hecht de incisie gesloten indien nodig volgens de institutionele richtlijnen en euthanaseer de dieren met een intracardiale dosis van 40 mg / kg natriumpentobarbital. Zodra de dood is bevestigd, gooit u het karkas weg volgens de institutionele procedure(s).
    OPMERKING: De dood lokt signaleringsmechanismen uit die het immunofenotype, de differentiatiecapaciteit en het paracriene effect van mesenchymale cellen beïnvloeden. Daarom wordt weefselverzameling uitgevoerd vóór euthanasie. 

2. Isolatie van mesenchymale cellen uit vetweefsel

  1. Verwijder het vetweefsel met een steriele tang in een bioveiligheidskast en plaats het op steriel filterpapier in een petrischaal met een diameter van 100 mm om overtollig PBS te absorberen.
  2. Breng het vetweefsel over naar een andere petrischaal en voer drie wasbeurten uit gedurende 5 minuten elk met 10 ml 1x PBS-AA-oplossing met behulp van een pipet van 10 ml.
  3. Splits het weefsel mechanisch in fragmenten van ongeveer 1 cm2 met behulp van een schaar en een scalpel.
  4. Bereid collagenase type IV (0,075%) in 20 ml niet-aangevulde Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM). Filtreer door een spuitfilter van 0,22 μm en houd het op 37 °C.
  5. Voeg de collagenase-oplossing (20 ml) bereid in stap 2.4 toe aan een kristalbeker met het gefragmenteerde weefsel en een magnetische staaf. Sluit de container af en incubeer onder langzaam en continu roeren bij 37 °C.
    OPMERKING: De enzymatische vertering duurt ongeveer 90 minuten (blijf langzaam roeren om de integriteit van de celmembranen te behouden).
  6. Filtreer het homogenaat door een roestvrijstalen, 40 mazen, 0,38 mm diafragmafilter op een petrischaal van 100 mm en vang de celsuspensie op in een steriele conische buis van 50 ml.
  7. Voeg 20 ml verwarmde, aangevulde DMEM toe (10% foetaal runderserum [FBS], 2 mM glutamine, 2 mM natriumpyruvaat, 100x niet-essentiële aminozuuroplossing en 100x antibiotische antimycotische oplossing [AA]). Suspensie voorzichtig de stromale vasculaire fractie (SVE).
  8. Centrifugeer de celsuspensie gedurende 10 minuten op 290 x g , gooi het supernatant weg met een pipet van 25 ml en was de cellen voorzichtig met 40 ml van een niet-aangevuld DMEM-medium.
  9. Herhaal deze stap. Gebruik een nieuwe steriele conische buis tussen de stappen om de minste hoeveelheid cellulair afval en vet te slepen.
  10. Suspensie de pellet in 5 ml aangevuld DMEM met een pipet van 5 ml en breng over in een T-25 cm2 fles. Incubeer gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO2.
  11. Voer de volgende dag drie wasbeurten uit met 5 ml verwarmde 1x PBS-AA en twee wasbeurten met niet-aangevulde DMEM om celresten en niet-hechtende cellen te verwijderen. Voeg 5 ml verse, verwarmde, aangevulde DMEM toe met een pipet van 5 ml en vervang het medium om de 3-4 dagen.

3. Behoud en uitbreiding van de ASC primaire culturen

  1. Zodra de cellen 90% -100% samenvloeiing bereiken (8 ± 2 dagen), was twee keer met 5 ml niet-aangevulde DMEM. Voeg 1 ml verwarmd 0,025% trypsine-2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe en incubeer gedurende 5-7 minuten bij 37 °C.
  2. Wanneer de celmonolaag is losgemaakt, voegt u 4 ml aangevulde DMEM toe en splitst u de celsuspensie voorzichtig uit.
  3. Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml, voeg 5 ml verwarmde, aangevulde DMEM toe en suspensie voorzichtig om te homogeniseren.
  4. Centrifugeer op 290 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en meng de pellet voorzichtig in 1 ml aangevulde DMEM. Tel de cellen in een Neubauer-kamer na kleuring met Trypan-blauw.
  5. Tot slot, zaad 2,5 x 103 cellen/cm2 in een gesplitste verhouding van 1:4 in T-75 kolven. Deze stap zorgt voor kolonievorming en een hoge proliferatiesnelheid.

4. Morfologische karakterisering van ASC primaire culturen

  1. Observeer de morfologie van ASC's onder omgekeerde microscopie.
    OPMERKING: Voordat u monteert voor histologie en ASC-identificatie, behandelt u de coverslips met een 1% gelatine-oplossing. Bestralen met UV gedurende 15 min.
    1. Verwijder de coverslips uit de 70% ethanoloplossing en laat ze 5 minuten drogen.
    2. Dompel de coverslips onder in een steriele 1% gelatineoplossing, giet af en droog op kamertemperatuur (RT).
    3. Plaats elke coverslip in elke put van een 6-putplaat en bestraal de platen gedurende 15 minuten met UV-licht.
    4. Zaai een druppel met 25 x 103 cellen in het midden van de put, wacht 1 minuut en voeg 1 ml aangevuld DMEM-medium toe. Incubeer gedurende 96 uur bij 37 °C en 5% CO2.
    5. Verwijder het medium en voer drie wasbeurten uit met 1x PBS-AA met behulp van een transferpipet.
    6. Voeg 1 ml 3,5% neutrale formaline toe aan elke put en incubeer gedurende 1 uur bij RT. Verwijder voorzichtig de formaline en voeg 1 ml koude 70% ethanol toe aan elk putje.
    7. Sluit de plaat af met parafilm tot gebruik, om uitdroging te voorkomen.
      OPMERKING: De cellulaire morfologie van ASC's worden ook geëvalueerd door hematoxyline-eosinekleuring tijdens verschillende passages.
    8. Verwijder de 70% ethanol uit elke put en hydrateer de cellen gedurende 5 minuten met gedestilleerd water. Filter ondertussen de kleuringsoplossingen.
    9. Verwijder het water en kleurt de cellen onder langzaam roeren gedurende 15 minuten met Harris 'hematoxyline-oplossing.
    10. Verwijder de vlekoplossing en voer twee wasbeurten uit met 1x PBS.
    11. Kleur de cellen met eosine-oplossing onder langzaam roeren gedurende 1 min. Verwijder vervolgens de oplossing en voer twee wasbeurten uit met 1x PBS.
    12. Verwijder voorzichtig de afdekstroken uit elke put en monteer de dia's op een druppel PBS-glycerolmontage-oplossing (1:1 v/v).
    13. Plaats een lijn nagellak rond de deklaag en observeer de histologische glaasjes onder de lichtmicroscoop.

5. Expressiemarkers van ASC's door immunofluorescentie

  1. Bereid de wasbuffer met 1x PBS-0,05% Tween 20 voor. Voer de wasbeurten uit bij RT en met langzaam schudden. Was de borden drie keer met 2 ml buffer/put (incubeer gedurende 3 minuten voor elke wasbeurt).
  2. Plaats 1 ml blokkerend reagens (1:10) en incubeer met langzaam roeren gedurende 20 minuten.
  3. Voeg 200 μL (1:50 verdunning) van de volgende primaire antilichamen toe aan elk putje: CD9 (monoklonale muis), CD34 (polyklonaal konijn) en anti-CD63 (polyklonale geit). Incubeer een nacht bij 4 °C.
  4. Was de platen drie keer opnieuw en incubeer met 200 μL (1:50 verdunning) van de volgende secundaire antilichamen: antimuis IgG FITC geconjugeerde geit, ezel anti-geit IgG DyeLight 550 en geit antikonijn IgG Cy3.
  5. Was drie keer met 1x PBS-0,05% Tween 20 en contrakleur de celkernen met 100 μL DRAQ-7 (verdunning: 17 μL in 1 ml dubbel gedestilleerd water) gedurende 20 min.
  6. Was nog drie keer en monteer de dia's volgens de stappen 4.1.12-4.1.13. Bewaar de monsters beschermd tegen licht en bevroren tot gebruik.
  7. Visualiseer de monsters onder epifluorescentie confocale microscopie met behulp van de juiste instellingen en software die voor deze apparatuur worden aanbevolen.

6. Expressiemarkers van ASC's door flowcytometrie

  1. Pas een eencellige suspensie van trypsinized of ontdooide cellen (subpassages 3 of 4) aan bij een concentratie van 1 x 106 cellen / ml van 1x PBS-5% FBS. Aliquot 100 μL met 100.000 cellen in 1,5 ml centrifugebuizen. Gebruik één aliquot zonder labeling voor de autofluorescentieregeling.
  2. Voeg alle juiste hoeveelheden Anti-CD105 AF-594 en Anti-CD31 AF-680 toe volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer in het donker gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  3. Was de overtollige vlek met 1 ml 1x PBS-5% FBS door centrifugeren op 250 x g gedurende 5 minuten en suspensie in 300 μL van 1% formaline.
  4. Voer monsterverwerving uit op een flowcytometer. De gatingstrategie van de cellen is gebaseerd op FSC-A vs. SSC-A gating, single cells gated using SSC-H vs. SSC-A gevolgd door FSC-A vs. FSC-H.
  5. Gebruik Y610-mCherry-A detector voor CD105 AF-594 en R660-APC-A detector voor CD31 AF-680.

7. Differentiatie van ASC's naar de adipogene afstamming

  1. Zaai in een 6-well plaat 1 x 104 cellen (P-4) per cm 2 en incubeer bij 37 °C, 5% CO2, tot 60-80% samenvloeiing (~72-96 h). Induceer differentiatie, rechtstreeks van toepassing op het kweekmedium: 4 μM insuline, 1 μM dexamethason 21-acetaat (Dxa) en 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (MIX). Verander het differentiatiemedium elke 2-3 dagen.
  2. Bereid een stockoplossing van 800 μM insuline in 2 ml steriel ultrapuur water (voeg 20 μL 1 N HCl toe om volledige oplossing te garanderen) en bewaar bij -20 °C. Voeg 10 μL insulinebouillon toe, eerder verdund 1:100, en breng 10 μL aan met een eindvolume van 2 ml per put.
  3. Bereid een stamoplossing van 1 mM Dxa in 5 ml steriel ultrapuur water (merk op dat volledige oplossing niet optreedt). Bewaren bij 4 °C. Voeg 40 μL/well van een 1:4 verdunning van Dxa bouillon toe.
  4. Bereid een voorraad van 100 mM MIX in 2,5 ml 0,1 N NaOH, vortex, en voeg 40 μL 1 N NaOH toe voor volledige oplossing. Bewaren bij -70 °C. Voeg 10 μL/put MIX-bouillon toe.
  5. Filtreer de stamoplossingen door een steriele spuitfilter van 0,22 μm voordat u ze opbergt.
  6. Was op dag 12 de cellen drie keer met 1x PBS en incubeer met 500 μL 4% formaline gedurende 1 uur bij RT. Was elke put twee keer met gedestilleerd water gevolgd door 60% isopropanol gedurende 5 minuten en laat drogen.
  7. Voeg 0,5% olierood O verdund in 60% isopropanol (500 μL/put) toe en incubeer gedurende 20 minuten bij RT. Was drie keer met 1 ml gedestilleerd water en observeer onder een omgekeerde microscoop.
    OPMERKING: Voor de benodigde reagentia, apparatuur en materialen raadpleegt u de materiaaltabel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetweefsel werd verkregen van volwassen Sprague Dawley-ratten van 3-4 maanden oud en met een lichaamsgewicht van 401 ± 41 g (geometrisch gemiddelde ± SD). Een gemiddelde waarde van 3,8 g epididymaal en perirenaal vetweefsel kwam overeen met de analyse van 15 experimentele extracties. Na 24 uur kweek bleven celpopulaties aan het plastische oppervlak kleven en vertoonden ze een heterogene morfologie. De eerste passage werd gerealiseerd na 8 ± 2 dagen, met een opbrengst van 1,4 ± 0,6 x 106 cellen in een totaal va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In de afgelopen vier decennia sinds de ontdekking van MSC's hebben verschillende groepen onderzoekers procedures beschreven voor het verkrijgen van MSC's uit verschillende weefsels en soorten. Een van de voordelen van het gebruik van ratten als diermodel is hun eenvoudige onderhoud en snelle ontwikkeling, evenals het gemak van het verkrijgen van MSC's uit vetweefsel. Verschillende weefselbronnen zijn beschreven voor het verkrijgen van ASC's, zoals visceraal, perirenaal, epididymaal en onderhuids vet 12,13,14,15,16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs zijn het Mexicaanse Instituut voor Sociale Zekerheid (IMSS) en het Kinderziekenhuis van Mexico, Federico Gomez (HIMFG) en de Bioterio-medewerkers van de IMSS Research Coordination dankbaar voor de steun die is gegeven om dit project uit te voeren. We danken de National Council of Science and Technology voor de AOC (815290) beurs en Antonio Duarte Reyes voor de technische ondersteuning in het audiovisuele materiaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Amphotericin BHyCloneSV30078.01
Analytical balanceSartoriusAX224
Antibody anti- CD9 (C-4)Santa CruzSc-13118
Antibody anti-CD34 (C-18)Santa CruzSc-7045
Antibody anti-C63Santa CruzSc-5275
Antibody anti-Endoglin/CD105 (P3D1) Alexa Fluor 594 Santa CruzSc-18838A594
Antibody anti-CD31/PECM-1 Alexa Fluor 680Santa CruzSc-18916AF680
Antibody Goat anti-rabitt IgG (H+L) Cy3 NovusNB 120-6939
Antibody Donkey anti-goat IgG (H+L) DyLight 550 InvitrogenSA5-10087
Antibody anti-mouse IgG FITC conjugated goat F (ab´)RD Systems.No. F103B
Bottle Top Filter SterileCORNING10718003
Cell and Tissue Culture FlasksBIOFIL170718-312B
Cell Counter Bright-Line Hemacytometer with cell counting chamber slidesSIGMA Aldrich Z359629
Cell wells: 6 well with LidCORNING25810
Centrifuge conical tubesHeTTICHROTANA460R
Centrifuge eppendorf tubesFischer ScientificM0018242_44797
Collagen IV WorthingtonLS004186
CryovialSPL Life Science43112
Culture tubesGreiner Bio-One 191180
CytExpert 2.0Beckman CoulterFree version
CytoFlex LX cytometerBeckman CoulterFLOW-2463VID03.17
DMEMGIBCO31600-034
DMSOSIGMA Aldrich 67-68-5
DraQ7 DyeThermo Sc. D15106
EDTASIGMA Aldrich60-00-4
Eosin yellowishHycel300
Ethanol 96%Baker64-17-5
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum CORNING35-010-CV
GelatinSIGMA Aldrich128111163
GentamicinGIBCO15750045
Glycerin-High PurityHerschi Trading 56-81-5
HematoxylinAMRESCO 0701-25G
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo Sc.50116047
Ketamin Pet (Ketamine clorhidrate)ArandaSV057430
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
LSM software Zen 2009 V5.5Free version
Biological Safety Cabinet Class IINuAire12082100801
Epifluorescent microscope Zeiss Axiovert 100M21.0028.001
Inverted microscope Olympus CK40CK40-G100
Non-essential amino acids 100XGIBCO11140050
Micro tubes 2 mL Sarstedt 72695400
Micro tubes 1,5 mLSarstedt 72706400
Micropipettes 0.2-2 μLFinnpipetteE97743
Micropipettes 2-20 μLFinnpipetteF54167
Micropipettes 20-200 μLFinnpipetteG32419
Micropipettes 100-1000 μLFinnpipetteFJ39895
Nitrogen tank liquidTaylor-Wharton681-021-06
ParaformaldehydeSIGMA AldrichSLBC3029V
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Cell cultureCORNING Inc480167
Pipet TipsAxygen Scientific301-03-201
Pisabental (pentobarbital sodium)PISA AgropecuariaQ-7833-215
Potassium chloride J.T.Baker7447-40-7
Potassium Phosphate DibasicJ.T Baker2139900
S1 Pipette FillersThermo Sc9531
Serological pipette 5 mLPYREXL010005
Serological pipette 10 mLPYREXL010010
Sodium bicarbonateJ.T Baker144-55-8
Sodium chloride J.T.Baker15368426
Sodium Phosphate Dibasic AnhydrousJ.T Baker7558-79-4
Sodium pyruvateGIBCO BRL11840-048
Syringe Filter SterileCORNING431222
SpectrophotometerPerkinElmer Lambda 25L6020060
Titer plate shakerLAB-LINE1250
Transfer pipetsSamco/Thermo Sc728NL
Trypan Blue stainGIBCO1198566
Trypsin From Porcine PancreasSIGMA Aldrich102H0234
Tween 20SIGMA Aldrich9005-6

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Djian, P., Roncari, A. K., Hollenberg, C. H. Influence of \anatomic site and age on the replication and differentiation of rat adipocyte precursors in culture. The Journal of Clinical Investigation. 72 (4), 1200-1208 (1983).
  2. Greenwood, M. R., Hirsch, J. Postnatal development of adipocyte cellularity in the normal rat. Journal of Lipid Research. 15 (5), 474-483 (1974).
  3. González, M. Engineering of the cartilage tissue: application of mesenchymal stem cells derived from adipose tissue and bone marrow for use in cartilage tissue regeneration. , Universidad de León. PhD thesis, http://hdl.handle.net/10612/3600 (2014).
  4. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  5. Sherman, L. S., Conde-Green, A., Naaldijk, Y., Lee, E. S., Rameshwar, P. An enzyme-free method for isolation and expansion of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Visualized Experiments. (154), e59419(2019).
  6. Cowan, C. M., et al. Adipose-derived adult stromal cells heal critical-size mouse calvarial defects. Nature Biotechnology. 22 (5), 560-567 (2004).
  7. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68(2019).
  8. Gittel, C., et al. Isolation of equine multipotent mesenchymal stromal cells by enzymatic tissue digestion or explant technique: comparison of cellular properties. BMC Veterinary Research. 9, 221(2013).
  9. Aliborzi, G., Vahdati, A., Mehrabani, D., Hosseini, S. E., Tamadon, A. Isolation, characterization and growth kinetic comparison of bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells of guinea pig. International Journal of Stem Cells. 9 (1), 115-123 (2016).
  10. Jurgens, W. J., et al. Effect of tissue-harvesting site on yield of stem cells derived from adipose tissue: implications for cell-based therapies. Cell and Tissue Research. 332 (3), 415-426 (2008).
  11. Secunda, R., et al. Isolation, expansion and characterisation of mesenchymal stem cells from human bone marrow, adipose tissue, umbilical cord blood and matrix: a comparative study. Cytotechnology. 67 (5), 793-807 (2015).
  12. Tholpady, S. S., Katz, A. J., Ogle, R. C. Mesenchymal stem cells from rat visceral fat exhibit multipotential differentiation in vitro. The Anatomical Record. Part A, Discoveries in Molecular, Cellular, and Evolutionary Biology. 272 (1), 398-402 (2003).
  13. Yoshimura, K., et al. Cell-assisted lipotransfer for cosmetic breast augmentation: supportive use of adipose-derived stem/stromal cells. Aesthetic Plastic Surgery. 32 (1), 48-57 (2008).
  14. Si, Z., et al. Adipose-derived stem cells: Sources, potency, and implications for regenerative therapies. Biomedicine & Pharmacotherapy. 114, 108765(2019).
  15. Hammoud, S. H., AlZaim, I., Al-Dhaheri, Y., Eid, A. H., El-Yazbi, A. F. Perirenal adipose tissue inflammation: Novel insights linking metabolic dysfunction to renal diseases. Frontiers in Endocrinology. 12, 707126(2021).
  16. Liu, B. X., Sun, W., Kong, X. Q. Perirenal fat: A unique fat pad and potential target for cardiovascular disease. Angiology. 70 (7), 584-593 (2019).
  17. Lee, J., Han, D. J., Kim, S. C. In vitro differentiation of human adipose tissue-derived stem cells into cells with pancreatic phenotype by regenerating pancreas extract. Biochemical and Biophysical Research Communications. 375 (4), 547-551 (2008).
  18. Chandra, V., et al. Islet-like cell aggregates generated from human adipose tissue derived stem cells ameliorate experimental diabetes in mice. PLoS One. 6 (6), e20615(2011).
  19. Zuk, P. A., et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-228 (2001).
  20. Huang, S. J., Yang, W. S., Lin, Y. W., Wang, H. C., Chen, C. C. Increase of insulin sensitivity and reversal of age-dependent glucose intolerance with inhibition of ASIC3. Biochemical and Biophysical Research Communications. 371 (4), 729-734 (2008).
  21. Jang, H. J., Cho, K. S., Park, H. Y., Roh, H. J. Adipose tissue-derived stem cells for cell therapy of airway allergic diseases in mouse. Acta Histochemica. 113 (5), 501-507 (2011).
  22. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. Journal of Anatomy. 214 (5), 759-767 (2009).
  23. Zhang, S., et al. Identification and characterization of pig adipose-derived progenitor cells. Canadian Journal of Veterinary Research. 80 (4), 309-317 (2016).
  24. Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells and Development. 16 (1), 91-104 (2007).
  25. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): An overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  26. Yu, B., Zhang, X., Li, X. Exosomes derived from mesenchymal stem cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (3), 4142-4157 (2014).
  27. Maumus, M., et al. Native human adipose stromal cells: localization, morphology, and phenotype. International Journal of Obesity. 35 (9), 1141-1153 (2011).
  28. Helmy, M. A., Mohamed, A. F., Rasheed, H. M., Fayad, A. I. A protocol for primary isolation and culture of adipose-derived stem cells and their phenotypic profile. Alexandria Journal of Medicine. 56 (1), 42-50 (2020).
  29. He, Q., Ye, Z., Zhou, Y., Tan, W. S. Comparative study of mesenchymal stem cells from rat bone marrow and adipose tissue. Turkish Journal of Biology. 42 (6), 477-489 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van stamcellenstromale vasculaire fractieflowcytometrieimmunofluorescentieanalyseadipogene differentiatieceloppervlaktemarkersregeneratieve geneeskunde

Gerelateerde artikelen