Methodenartikel

Een efficiënt protocol voor CUT&RUN-analyse van FACS-geïsoleerde muissatellietcellen

DOI:

10.3791/65215

⸱

7 juli 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1CNRS, Inserm, IGBMC UMR 7104- UMR-S 1258, Université de Strasbourg

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wordt een efficiënt protocol gepresenteerd voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen, aangepast aan de studie van transcriptieregulatie in spiervezels door splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genoomwijde analyses met kleincellige populaties zijn een belangrijke beperking voor studies, met name op het gebied van stamcellen. Dit werk beschrijft een efficiënt protocol voor de fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) isolatie van satellietcellen uit de ledemaatspier, een weefsel met een hoog gehalte aan structurele eiwitten. Ontlede ledemaatspieren van volwassen muizen werden mechanisch verstoord door fijnhakken in medium aangevuld met dispase en type I collagenase. Na de spijsvertering werd het homogenaat gefilterd door celzeven en werden de cellen gesuspendeerd in de FACS-buffer. De levensvatbaarheid werd bepaald met een fixeerbare levensvatbaarheidskleuring en immunogekleurde satellietcellen werden geïsoleerd door FACS. Cellen werden gelyseerd met Triton X-100 en vrijgekomen kernen werden gebonden aan concanavalin A magnetische kralen. Kern/kraalcomplexen werden geïncubeerd met antilichamen tegen de transcriptiefactor of histonmodificaties van belang. Na wasbeurten werden kern/kraalcomplexen geïncubeerd met proteïne A-microkokkennuclease en werd chromatinesplitsing geïnitieerd met CaCl2. Na DNA-extractie werden bibliotheken gegenereerd en gesequenced, en de profielen voor genoombrede transcriptiefactorbinding en covalente histonmodificaties werden verkregen door bio-informatica-analyse. De pieken die voor de verschillende histonmarkeringen werden verkregen, toonden aan dat de bindingsgebeurtenissen specifiek waren voor satellietcellen. Bovendien onthulde bekende motiefanalyse dat de transcriptiefactor gebonden was aan chromatine via het verwante responselement. Dit protocol is daarom aangepast om genregulatie te bestuderen in spiercellen van volwassen muizen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dwarsgestreepte skeletspieren vertegenwoordigen gemiddeld 40% van het gewicht van het totale menselijk lichaam1. Spiervezels vertonen een opmerkelijk vermogen tot regeneratie bij letsel, wat wordt beschreven door de fusie van nieuw gevormde myocyten en de aanmaak van nieuwe myovezels die de beschadigde vervangen2. In 1961 rapporteerde Alexander Mauro een populatie van mononucleaire cellen die hij satellietcellen3 noemde. Deze stamcellen brengen de transcriptiefactor gepaarde box 7 (PAX7) tot expressie en bevinden zich tussen de basale lamina en het sarcolemma van spiervezels4. Er werd gemeld dat ze het cluster van differentiatie 34 (CD34; een hematopoëtische, endotheliale voorloper en mesenchymale stamcelmarker), integrine alfa 7 (ITGA7; een gladde, hart- en skeletspiermarker) tot expressie brachten, evenals de C-X-C chemokinereceptor type 4 (CXCR4; een lymfocyt-, hematopoëtische en satellietcelmarker)5. In basale omstandigheden bevinden satellietcellen zich in een bepaalde micro-omgeving die ze in een rusttoestand houdt6. Bij spierbeschadiging worden ze geactiveerd, vermenigvuldigen ze zich en ondergaan ze myogenese7. Omdat ze echter slechts een klein deel van het totale aantal spiercellen uitmaken, zijn hun genoombrede analyses bijzonder uitdagend, vooral onder fysiologische omstandigheden (<1% van het totale aantal cellen).

Er zijn verschillende methoden beschreven voor chromatine-isolatie uit satellietcellen, waarbij chromatine-immunoprecipitatie wordt gevolgd door massale parallelle sequencing (ChIP-seq) of splitsing onder doelen en tagmentatie-experimenten (CUT&Tag). Desalniettemin hebben deze twee technieken enkele belangrijke beperkingen die onbetwist blijven. ChIP-seq vereist inderdaad een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal om voldoende chromatine te genereren, waarvan een groot deel verloren gaat tijdens de sonicatiestap. CUT&Tag is meer geschikt voor een laag celaantal, maar genereert meer off-target splitsingsplaatsen dan ChIP-seq vanwege de Tn5-transposase-activiteit. Bovendien, aangezien dit enzym een hoge affiniteit heeft voor open-chromatineregio's, kan de CUT&Tag-benadering bij voorkeur worden gebruikt voor het analyseren van histonmodificaties of transcriptiefactoren die verband houden met actief getranscribeerde regio's van het genoom, in plaats van tot zwijgen gebracht heterochromatine 8,9.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat de isolatie van spiersatellietcellen van muizenledematen door FACS mogelijk maakt voor splitsing onder doelen en afgifte met behulp van nuclease (CUT&RUN)10,11-analyse. De verschillende stappen omvatten de mechanische verstoring van weefsel, celsortering en kernisolatie. De efficiëntie van de methode, met betrekking tot de bereiding van een levensvatbare celsuspensie, werd aangetoond door het uitvoeren van CUT&RUN-analyse voor covalente histonmodificaties en transcriptiefactoren. De kwaliteit van geïsoleerde cellen maakt de beschreven methode bijzonder aantrekkelijk voor het bereiden van chromatine dat de oorspronkelijke genomische bezettingstoestand getrouw vastlegt, en is waarschijnlijk geschikt voor het vastleggen van de chromosoomconformatie in combinatie met high-throughput sequencing op specifieke loci (4C-seq) of op genoombrede niveaus (Hi-C).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen werden gehouden in een erkende stal, in overeenstemming met de National Animal Care Guidelines (richtlijn 86/609/EEG van de Europese Commissie; Frans decreet nr. 87-848) over het gebruik van proefdieren voor onderzoek. Voorgenomen manipulaties werden voorgelegd aan de ethische commissie (Com'Eth, Straatsburg, Frankrijk) en aan het Franse ministerie van Onderzoek (MESR) voor ethische evaluatie en autorisatie volgens de richtlijn 2010/63/EU onder het APAFIS-nummer #22281.

1. Bereiding van celsuspensie voor isolatie van satellietcellen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (figuur 1)

  1. Isolatie van spierweefsel
    1. Ontsmet de hulpmiddelen voor spierdissectie, inclusief pincet, scalpels en scharen, met een reinigingsmiddel (tabel 1) en spoel grondig af met gedestilleerd water.
    2. Maak twee buisjes van 2 ml (tabel 1), elk met 1 ml spierisolatiebuffer, en plaats ze op ijs voor het verzamelen van geoogste spieren.
    3. Offer twee 10 weken oude C57/Bl6J mannelijke muizen door CO2 -verstikking gevolgd door cervicale dislocatie. Spuit 70% ethanol over elke hele muis. Trek de huid van de achterpoot af met een pincet. Ontleed alle ledemaatspieren rond het dijbeen, scheenbeen en kuitbeen (ongeveer 1 mg spieren per muis).
      OPMERKING: Het aantal satellietcellen neemt af na de leeftijd van 15 weken.
    4. Plaats de geoogste ledemaatspieren in buisjes van 2 ml met 1 ml spierisolatiebuffer die in stap 1.1.2 is bereid. Verzamel de spieren van de tweede muis volgens dezelfde procedure. Hak de geoogste spieren fijn met een schaar op ijs tot kleiner dan 1 mm3 fragmenten zijn verkregen.
      OPMERKING: Spieren werden verzameld en gehakt, voornamelijk zoals beschreven12. Voer weefselvertering uit volgens stap 1.2 of 1.3.
  2. Weefselvertering met collagenase-enzym
    1. Breng de gehakte spiersuspensie van de twee muizen over door ze in een buis van 50 ml te gieten (tabel 1) met 18 ml spierisolatiebuffer (aangevuld met 5 ml [5 E/ml] dispase en 5 mg type I collagenase) (tabel 1).
    2. Sluit de buis goed af en sluit deze af met laboratoriumfolie (tabel 1). Plaats het horizontaal in een schudwaterbad (tabel 1) bij 37 °C bij 100 tpm gedurende 30 minuten.
    3. Voeg na 30 minuten 5 mg collagenase type I toe. Bewaar de buizen nog 30 minuten onder beweging in een schudwaterbad bij 37 °C bij 100 omw/min.
    4. Na de spijsvertering pipet u de spiersuspensie 10 keer op en neer met een pipet van 10 ml om de efficiëntie van de dissociatie te verbeteren. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Aan de onderkant van de buis zal een heldere pellet zichtbaar zijn. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml en laat 5 ml medium in de buis.
      OPMERKING: Door het medium te verlaten, wordt stress van de cellen voorkomen. Voeg 10 ml verse spierisolatiebuffer toe en resuspendeer de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 10 ml.
    5. Plaats celzeefjes van 100 μm, 70 μm en 40 μm (van elke soort) (tabel 1) op open buisjes van 50 ml. Pipetteer de suspensie op de opeenvolgende celzeven (100 μm, 70 μm, 40 μm) en vang de doorstroom op in de buisjes van 50 ml, die cellen van minder dan 40 μm bevatten.
    6. Centrifugeer de suspensie bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml totdat er nog 2 ml over is en gebruik vervolgens een pipet van 0,2-1 ml totdat er nog 100-200 μl over is. Resuspendeer de pellet in 2 ml lysebuffer voor rode bloedcellen (tabel 2). Incubeer 3 minuten op ijs.
    7. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl. Resuspendeer de cellen in 100 μL koude FACS-buffer (tabel 2). Leg op ijs.
  3. Alternatieve methode voor weefselvertering met Liberase thermolysine laag (TL) enzym
    1. Volg de beschrijvingen in stap 1.1. voor weefselisolatie.
    2. Voor liberase-gemedieerde weefseldesaggregatie, oogst spieren in 2 ml isolatiebuffer van het Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (tabel 2), in plaats van spierisolatiebuffer beschreven in stap 1.1.2.
    3. Breng de gehakte spiersuspensie van de twee muizen over door ze in een buis van 50 ml te gieten (tabel 1) met 18 ml RPMI-isolatiebuffer aangevuld met 300 of 600 μl Liberase TL van 5 mg/ml (tabel 1) (d.w.z. respectievelijk 0,083 mg/ml en 0,167 mg/ml eindconcentraties)13.
    4. Sluit de buis goed af en sluit deze af met laboratoriumfolie (tabel 1). Plaats het horizontaal in een schudwaterbad (tabel 1) bij 37 °C bij 100 tpm gedurende 30 minuten.
    5. Na de spijsvertering pipet u de spiersuspensie 10 keer op en neer met een pipet van 10 ml om te dissociëren en de efficiëntie van de dissociatie te verbeteren.
    6. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Aan de onderkant van de buis zal een heldere pellet zichtbaar zijn. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml en laat 5 ml medium in de buis. Door het medium te verlaten, wordt stress van de cellen voorkomen. Voeg 10 ml verse RPMI-isolatiebuffer toe en resuspendeer de pellet door op en neer te pipetteren met een pipet van 10 ml.
    7. Plaats celzeefjes van 100 μm, 70 μm en 40 μm (van elke soort) (tabel 1) op open buisjes van 50 ml.
    8. Pipeteer de suspensie op opeenvolgende celzeven (100 μm, 70 μm, 40 μm) en vang de doorstroom op in de buisjes van 50 ml, die cellen van minder dan 40 μm bevatten.
    9. Centrifugeer de suspensie bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min. Gooi het supernatans weg met een pipet van 10 ml totdat er nog 2 ml over is en gebruik vervolgens een pipet van 0,2-1 ml totdat er nog 100-200 μl over is.
    10. Resuspendeer de pellet in 2 ml lysebuffer voor rode bloedcellen (tabel 2). Incubeer 3 minuten op ijs.
    11. Centrifugeer bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 minuten en gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl.
    12. Resuspendeer de cellen in 100 μL koude FACS-buffer (tabel 2). Leg op ijs.
  4. Bereiding van celsuspensie voor FACS-isolatie
    1. Breng 10 μl van de in stap 1.2.12 verkregen celsuspensie over in een vers buisje van 1,5 ml. Dit monster vormt de niet-bevlekte of de negatieve controle (figuur 2). Voeg 190 μL FACS-buffer toe, breng over naar een buis van 5 ml (tabel 1) en bewaar op ijs.
    2. Centrifugeer de resterende 90 μl van de in stap 1.2.12 verkregen celsuspensie gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 400 x g en gooi het supernatans weg met behulp van een pipet (tipvolume 20-200 μl). Incubeer de cellen met 400 μL fixeerbare levensvatbaarheidskleuring (tabel 3) verdund in serumvrije Dulbecco's gemodificeerde Eagle-medium (DMEM) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
    3. Was de cellen door centrifugeren bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 minuten en voeg 100 μL FACS-buffer toe. Keer de buisjes driemaal voorzichtig om en centrifugeer opnieuw bij 4 °C bij 400 x g gedurende 5 min.
    4. Bereid tijdens de centrifugatietijd 100 μl van een mastermix van primaire antilichamen gekoppeld aan fluoroforen en gericht tegen CD11b, CD31, CD45, TER119, CD34, ITGA7 en CXCR4 (tabel 3), verdund in FACS-buffer.
    5. Centrifugeer bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C, gooi het celsupernatans weg met behulp van een pipet (20-200 μl tipvolume) en voeg het 100 μl antilichaammengsel toe. Keer de buis voorzichtig drie keer om. Draai niet vortex. Incubeer 30 minuten in het donker op ijs.
    6. Centrifugeer op 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl en voeg 500 μl 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) toe om de cellen te wassen. Keer de buis voorzichtig drie keer om. Centrifugeer opnieuw bij 400 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatans weg met een pipet van 20-200 μl.
    7. Resuspendeer de celpellet in 500 μL FACS-buffer en breng de suspensie over in een buisje van 5 ml.
      OPMERKING: de celsuspensie die wordt verkregen uit de vertering van Liberase wordt op dezelfde manier verwerkt.
  5. Selectie van satellietcellen door FACS
    1. Draai de celsuspensie kort (2-5 sec) en verwerk de cellen op een flowcytometer die is uitgerust met een mondstuk van 100 μm (tabel 1).
    2. Bepaal de verschillende poortafmetingen op basis van het ongekleurde monster dat is opgeslagen in stap 1.4.1 (figuur 2).
    3. Smeer een tube van 5 ml in met 1 ml puur foetaal kalfsserum (FCS) om de celverzameling te verbeteren en voeg 500 μl FACS-buffer toe.
    4. Vervang het ongekleurde monster door het met antilichamen gelabelde monster.
    5. Selecteer de populatie van belang op basis van het voorwaartse verspreidingsgebied (FSC-A) en het zijspreidingsgebied (SSC-A) (Figuur 3A) en verwijder doubletcellen met de FSC-A en voorwaartse verstrooiingshoogte (FSC-H) (Figuur 3B)14.
    6. Identificeer levende cellen met een fixeerbare levensvatbaarheid, vleknegatief, kleuring (Figuur 3C).
    7. Selecteer negatieve cellen voor CD31, CD45, TER119 en CD11b (Afbeelding 3D).
    8. Om satellietcellen te identificeren, selecteert u eerst de cellen die positief zijn voor CD34 en ITGA7 (Figuur 3E) en selecteert u vervolgens de CXCR4-positieve cellen op de CD34- en ITGA7-geselecteerde populatie (Figuur 3F).
    9. Verzamel de geselecteerde cellen (tussen 40.000 en 80.000 cellen, afhankelijk van de kwaliteit van het preparaat) in de gecoate buis van 5 ml met 500 μL FACS-buffer.

2. Validatie van de geïsoleerde populatie in weefselkweek

  1. Diacoating met hydrogel
    1. Verdun 280 μl van een gekwalificeerde matrix met pure hydrogel menselijke embryonale stamcellen (hESC) (tabel 1) in 12 ml serumvrij DMEM/F12-medium.
    2. Smeer een objectglaasje (tabel 1) in met de hydrogeloplossing en incubeer het een nacht bij 4 °C.
    3. De volgende dag incubeer de kamerglaasje bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur voordat u de cellen zaait.
  2. Celgroei en differentiatie
    1. Plaat ongeveer 20.000 cellen, verkregen uit stap 1.5.9, per putje, en kweek ze gedurende 5 dagen in groeimedium (tabel 2). Maak fasecontrastbeelden met behulp van een helderveldmicroscoop (Figuur 4A) en bewerk ze vervolgens voor immunofluorescentieanalyse om de kwaliteit van het preparaat te waarborgen (Figuur 4B).
    2. Om myogenese te induceren, kweekt u geamplificeerde satellietcellen uit stap 2.2.1 in myogeen medium (tabel 2) gedurende nog eens 7 dagen. Maak beelden met fasecontrast met behulp van een helderveldmicroscoop (Figuur 4C) voordat u ze verwerkt voor immunofluorescentieanalyse om de kwaliteit van het preparaat te waarborgen (Figuur 4D).
  3. Immunocytofluorescentie-analyse
    1. Verwijder het medium voorzichtig, was de cellen die op kamertemperatuur zijn gekweekt tweemaal met 100 μL 1x PBS en fixeer ze gedurende 1 uur met 100 μL 4 % paraformaldehyde (PFA) bij RT.
      NOTITIE: Deze stap moet met zorg worden uitgevoerd. Er moet altijd een kleine hoeveelheid medium in de kamer worden bewaard om overbelasting van de cellen te voorkomen, en de PBS moet door de wanden van de kamer worden gegoten.
    2. Was de cellen drie keer met 100 μL 1x PBS, aangevuld met 0,1% Tween 20 (PBST) om de celmembranen te permeabiliseren.
    3. Blokkeer niet-specifieke signalen door incubatie in 100 μL 1x PBST aangevuld met 5% FCS (PBST-FCS) bij RT gedurende 1 uur.
    4. Incubeer de cellen met 100 μL van een mastermix van anti-PAX7- en anti-dystrofine (DMD)-antilichamen (verdund in 1x PBST-FCS) bij 4 °C gedurende een nacht, om respectievelijk satellietcellen en myovezels te detecteren.
    5. Was de cellen driemaal met 100 μL 1x PBST en incubeer ze met 100 μL geit anti-muis Cy3 of geit anti-konijn Alexa 488 secundaire antilichamen (tabel 3) verdund in 1x PBST-FCS bij RT gedurende 1 uur.
    6. Koppel de kamerputjes los van het objectglaasje met behulp van de door de leverancier geleverde apparatuur, voeg 20 μL waterig montagemedium met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) toe en dek het glaasje af met een dekglaasje (tabel 1).
    7. Observeer en leg het beeld van de gekleurde cellen vast met een confocale microscoop.
    8. Verwerk de beelden met behulp van beeldanalysesoftware (figuren 4B,D).

3. CUT&RUN-analyse

  1. Monstervoorbereiding voor CUT&RUN-analyse op FACS-geïsoleerde satellietcellen
    OPMERKING: CUT&RUN is in wezen uitgevoerd zoals beschreven10,15. De samenstelling van de buffer wordt weergegeven in Tabel 2.
    1. Gebruik voor de CUT&RUN-test ongeveer 40.000 van de cellen die zijn verkregen in methode 1, stap 1.5.9, per monster/antilichaam dat moet worden getest.
    2. Centrifugeer de FACS-geïsoleerde satellietcellen bij RT bij 500 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatans vervolgens weg met een pipet (20-200 μL tipvolume).
    3. Was de cellen met 1 ml 1x PBS, centrifugeer bij RT bij 500 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatans weg met een pipet (0,2-1 ml tipvolume) en resuspendeer ze in 1 ml koude nucleaire extractiebuffer (tabel 2). Incubeer 20 minuten op ijs.
    4. Maak tijdens de incubatie een buisje van 1,5 ml met 850 μl koudebindingsbuffer (tabel 2) en voeg per monster 20 μl concanavalin A-gecoate magnetische kralen toe (tabel 1).
    5. Was de kralen twee keer met 1 ml koudebindingsbuffer met behulp van een magnetisch rek (tabel 1). Laat voor elke wasbeurt of bufferwissel tijdens de procedure de parels zich gedurende 5 minuten ophopen aan de zijkant van de buis op het magnetische rek voordat u het geklaarde supernatans verwijdert met een pipet (0,2-1 ml tipvolume). Resuspendeer vervolgens voorzichtig in 300 μL koudebindingsbuffer.
    6. Centrifugeer de kernen gedurende 5 minuten bij 4 °C bij 600 x g en resuspendeer ze voorzichtig in 600 μl nucleaire extractiebuffer. Meng de 600 μL geëxtraheerde kernen voorzichtig met de 300 μL concanavalin A-parelslurry en incubeer gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    7. Verwijder het supernatans met behulp van een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, en resuspendeer de met kralen gebonden kernen voorzichtig met 1 ml koudeblokkerende buffer (tabel 2). Incubeer bij RT gedurende 5 min.
    8. Verwijder het supernatans met behulp van een magnetisch rek en was de parelgebonden kernen twee keer met 1 ml koude wasbuffer (tabel 2). Verdeel tijdens de tweede wasbeurt de kraalgebonden kernen gelijkmatig in buisjes van 1,5 ml. Elke buis wordt in de volgende stap behandeld met een specifiek antilichaam.
      OPMERKING: In dit voorbeeld werd 250 μL kraalgebonden kernen gesplitst in vier buisjes van 1,5 ml.
    9. Scheid het supernatans met behulp van een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, en zuig op met een pipet. Resuspendeer de kern/parelcomplexen voorzichtig met een specifiek primair antilichaam (tabel 3), of een IgG van een andere soort (hier konijn) verdund in 250 μL koude wasbuffer. Incubeer 's nachts bij 4 °C en schud zachtjes.
      OPMERKING: De antilichamen die hier worden gebruikt, zijn gericht tegen AR, H3K4me2 en H3K27ac.
    10. Verwijder het supernatans met een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, was de kraalgebonden kernen tweemaal met 1 ml koude wasbuffer en resuspendeer in 100 μl koude wasbuffer.
    11. Verdun eiwit A-microkokkennuclease bij 1,4 ng/μL in 100 μL per monster koude wasbuffer.
    12. Voeg 100 μl eiwit A-microkokkennuclease toe aan de 100 μl monster verkregen in 3.1.11 en incubeer gedurende 1 uur bij 4 °C onder roeren.
    13. Verwijder het supernatans met een magnetisch rek, zoals beschreven in stap 3.1.4, was tweemaal met 1 ml koude wasbuffer en resuspendeer de parelgebonden kernen in 150 μl koude wasbuffer.
    14. Om de DNA-splitsing te starten, voegt u 3 μL van 100 mM CaCl2 toe aan de 150 μL monster, mengt u snel door te tikken en incubeert u gedurende 30 minuten op ijs. Stop de reactie door 150 μL stopbuffer toe te voegen en gedurende 20 minuten bij 37 °C te incuberen om het RNA te verteren en de DNA-fragmenten vrij te geven.
    15. Voor DNA-extractie centrifugeert u de monsters bij 16.000 x g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
    16. Breng het supernatans over in een nieuwe microfuge-buis en gooi de pellet en kralen weg.
    17. Voeg 3 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 2,5 μL 20 mg/ml proteïnase K toe. Incubeer gedurende 10 minuten bij 70 °C (niet schudden).
    18. Voeg 300 μL fenol/chloroform/isoamylalcohol, vortex, over naar 2 ml phase-lock buizen (5 minuten voorgedraaid bij 16.000 x g) en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C.
    19. Voeg 300 μL chloroform toe aan dezelfde buis en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C. Vang het supernatans (~300 μL) op met een pipet (0,2-1 ml tipvolume) en breng het over in een nieuw buisje van 1,5 ml.
    20. Voeg 1 μL glycogeen toe (concentratie van 20 mg/ml).
    21. Voeg 750 μL 100% ethanol toe en sla een nacht neer bij -20 °C.
    22. Pelleteer het DNA door centrifugeren gedurende 15 minuten bij 16.000 x g bij 4 °C. Was de pellet met 1 ml 100% ethanol, centrifugeer gedurende 5 minuten op 16.000 x g, gooi het supernatant weg, centrifugeer gedurende 30 s op 16.000 x g en verwijder de vloeistof met een pipet (20-200 μL tipvolume).
    23. Laat de pellet ~5 minuten aan de lucht drogen. Resuspenderen in 25 μl van 1 mM Tris-HCl (pH 8) en 0,1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA; pH 8).
  2. Bio-informatica analyse
    1. Bereid bibliotheken voor van immunogespleten DNA en sequentie ze als gepaarde 100 bp-lezingen met behulp van het genomische platform zoals beschreven16.
    2. Verwijder reads die overlappen met het ENCODE blacklist-gebied (V2) en verdeel de resterende reads in twee groepen: fragmentgrootte <120 bp (zonder nucleosoom, in het algemeen voor transcriptiefactoren) en fragmentgrootte >150 bp (met nucleosomen, normaal gesproken voor histonmarkeringen). Kaart naar het mm10-referentiegenoom met behulp van Bowtie 2 (v2.3.4.3)17.
    3. Genereer bigwig-bestanden met bamCoverage (deeptools 3.3.0: bamCoverage --normalizeUsing RPKM --binSize 20).
    4. Bewaar uniek in kaart gebrachte lezingen voor verdere analyse.
    5. Genereer onbewerkte bedgraph-bestanden met genomeCoverageBed (bedtools v2.26.0).
    6. Gebruik het SEACR 1.3-algoritme (stringente optie) voor de piekoproep. Laad het doelgegevensbedgraafbestand in UCSC-bedgraafindeling dat regio's weglaat die een nulsignaal bevatten, en het IgG-gegevensbedgraafbestand (Control Control) om een empirische drempel te genereren voor piekaanroep18.
    7. Voer een Pearson-correlatieanalyse uit met deeptools om de gelijkenis tussen de monsters te bepalen19. Gebruik de opdrachtregel multiBamSummary bins --bamfiles file1.bam file2.bam -o results.npz, gevolgd door plotCorrelation -in results.npz --corMethod pearson --skipZeros --plotTitle "Pearson Correlation of Read Counts" --whatToPlot heatmap --colorMap RdYlBu --plotNumbers -o heatmap_PearsonCorr_readCounts.png --outFileCorMatrix PearsonCorr_readCounts.tab.
    8. Visualiseer de genoombrede intensiteitsprofielen met IGV20 met behulp van bedgraph-bestanden en de bedfile-pieken verkregen uit SEACR.
    9. Gebruik HOMER voor piekannotatie en zoeken naar motieven21.
    10. Vergelijk ten slotte de datasets met eerder gepubliceerde datasets met de ChIP-Atlas Peak-browser om ze te visualiseren op IGV en/of verrijkingsanalyse met behulp van de door SEACR gegenereerde bedbestanden als invoerdataset22.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Satellietcellen uit skeletspieren van muizen werden geïsoleerd door de protocollen van Gunther et al. (hierna Protocol 1)12 en van Liu et al.23 (hierna Protocol 2) te combineren. Aangezien na de spijsvertering niet-verteerde spiervezels werden waargenomen bij gebruik van de concentratie collagenase en dispase zoals voorgesteld in Protocol 1, werd de hoeveelheid enzymen verhoogd om de dissociatie van spiervezels te verbeteren, zoals beschreven in de stappen 1.2.1 en 1.2.3. Z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De huidige studie rapporteert een gestandaardiseerde, betrouwbare en eenvoudig uit te voeren methode voor de isolatie en kweek van muissatellietcellen, evenals de beoordeling van transcriptionele regulatie door de CUT&RUN-methode.

Dit protocol omvat verschillende kritieke stappen. De eerste is spierverstoring en vezelvertering om een groot aantal verzamelde cellen te garanderen. Ondanks de verhoogde enzymconcentratie werden er meer levende cellen verkregen dan bij gebruik van Protocol 1. Satel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken Anastasia Bannwarth voor haar uitstekende technische assistentie. We danken de IGBMC-dierenstalfaciliteit, de celkweek, het Mouse Clinical Institute (ICS, Illkirch, Frankrijk), de beeldvorming, de elektronenmicroscopie, de flowcytometrie en het GenomEast-platform, lid van het consortium 'France Génomique' (ANR-10-INBS-0009).

Dit werk van het Interdisciplinair Thematisch Instituut IMCBio, als onderdeel van het ITI 2021-2028-programma van de Universiteit van Straatsburg, CNRS en Inserm, werd ondersteund door IdEx Unistra (ANR-10-IDEX-0002) en door het SFRI-STRAT'US-project (ANR 20-SFRI-0012) en EUR IMCBio (ANR-17-EURE-0023) in het kader van het Franse Investments for the Future-programma. Aanvullende financiering werd verstrekt door INSERM, CNRS, Unistra, IGBMC, Agence Nationale de la Recherche (ANR-16-CE11-0009, AR2GR), AFM-Téléthon strategisch programma 24376 (aan D.D.), INSERM young researcher grant (aan D.D.), ANR-10-LABX-0030-INRT, en een Frans staatsfonds beheerd door de ANR in het kader van het kaderprogramma Investissements d'Avenir (ANR-10-IDEX-0002-02). J.R. werd gesteund door het programma CDFA-07-22 van de Université franco-allemande en Ministère de l'Enseignement Supérieur de la Recherche et de l'Innovation, en K.G. door de Association pour la Recherche à l'IGBMC (ARI).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1.5 mL microtubeEppendorf2080422
2 mL microtubeStar LabS1620-2700
5 mL tubesCORNING-FALCON352063
50 mL tubesFalcon352098
anti-ARabcamab108341
anti-CD11beBioscience25-0112-82
anti-CD31eBioscience12-0311-82
anti-CD34eBioscience48-0341-82
anti-CD45eBioscience12-0451-83
anti-CXCR4eBioscience17-9991-82
anti-DMDabcamab15277
anti-H3K27acActive Motif39133
anti-H3K4me2Active Motif39141
anti-ITGA7MBLk0046-4
anti-PAX7DSHBAB_528428
anti-TER119BD Pharmingen TM553673
BeadsPolysciences86057-3BioMag®Plus Concanavalin A
Cell Strainer 100 µmCorning® 431752
Cell Strainer 40 µmCorning® 431750
Cell Strainer 70 µmCorning® 431751
Centrifuge 1Eppendorf521-0011Centrifuge 5415 R
Centrifuge 2Eppendorf5805000010Centrifuge 5804 R
Chamber Slide System ThermoFischer171080Système Nunc™ Lab-Tek™ Chamber Slide
Cleaning agentSigma  SLBQ7780VRNaseZAPTM
Collagenase, type I Thermo Fisher1710001710 mg/mL
Dispase STEMCELL technologies79135 U/mL
DynaMag™-2 AimantInvitrogen12321D
Fixable Viability StainBD Biosciences565388
Flow cytometerBD FACSAria™ Fusion Flow Cytometer23-14816-01
Fluoromount G with DAPIInvitrogen00-4959-52
Genome browser IGVhttp://software.broadinstitute.org/software/igv/
Glycerol Sigma-AldrichG9012
HydrogelCorning® 354277Matrigel hESC qualified matrix
Image processing softwareImage J®V 1.8.0
Laboratory filmSigma-AldrichP7793-1EAPARAFILM® M
Liberase LTRoche5401020001
Propyl gallateSigma-Aldrich2370
Sequencer Illumina Hiseq 4000SY-401-4001
Shaking water bathBioblock Scientific polytest 2018724

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle progenitor cells and the role of Pax genes. Comptes Rendus Biologies. 330 (6-7), 530-533 (2007).
  5. Tosic, M., et al. Lsd1 regulates skeletal muscle regeneration and directs the fate of satellite cells. Nature Communications. 9 (1), 366(2018).
  6. Kuang, S., Gillespie, M. A., Rudnicki, M. A. Niche regulation of muscle satellite cell self-renewal and differentiation. Cell Stem Cell. 2 (1), 22-31 (2008).
  7. Collins, C. A., et al. Stem cell function, self-renewal, and behavioral heterogeneity of cells from the adult muscle satellite cell niche. Cell. 122 (2), 289-301 (2005).
  8. Robinson, D. C. L., et al. Negative elongation factor regulates muscle progenitor expansion for efficient myofiber repair and stem cell pool repopulation. Developmental Cell. 56 (7), 1014-1029 (2021).
  9. Machado, L., et al. In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells. Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).
  10. Hainer, S. J., Fazzio, T. G. High-resolution chromatin profiling using CUT&RUN. Current Protocols in Molecular Biology. 126 (1), 85(2019).
  11. Meers, M. P., Bryson, T. D., Henikoff, J. G., Henikoff, S. Improved CUT&RUN chromatin profiling tools. eLife. 8, (2019).
  12. Gunther, S., et al. Myf5-positive satellite cells contribute to Pax7-dependent long-term maintenance of adult muscle stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 590-601 (2013).
  13. Donlin, L. T., et al. Methods for high-dimensional analysis of cells dissociated from cryopreserved synovial tissue. Arthritis Research & Therapy. 20 (1), 139(2018).
  14. Rico, L. G., et al. Accurate identification of cell doublet profiles: Comparison of light scattering with fluorescence measurement techniques. Cytometry. Part A. 103 (3), 447-454 (2022).
  15. Schreiber, V., et al. Extensive NEUROG3 occupancy in the human pancreatic endocrine gene regulatory network. Molecular Metabolism. 53, 101313(2021).
  16. Rovito, D., et al. Myod1 and GR coordinate myofiber-specific transcriptional enhancers. Nucleic Acids Research. 49 (8), 4472-4492 (2021).
  17. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  18. Meers, M. P., Tenenbaum, D., Henikoff, S. Peak calling by Sparse Enrichment Analysis for CUT&RUN chromatin profiling. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 42(2019).
  19. Ramirez, F., et al. deepTools2: a next generation web server for deep-sequencing data analysis. Nucleic Acids Research. 44, W160-W165 (2016).
  20. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  21. Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Molecular Cell. 38 (4), 576-589 (2010).
  22. Zou, Z., Ohta, T., Miura, F., Oki, S. ChIP-Atlas 2021 update: a data-mining suite for exploring epigenomic landscapes by fully integrating ChIP-seq, ATAC-seq and Bisulfite-seq data. Nucleic Acids Research. 50, W175-W182 (2022).
  23. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  24. Brandhorst, H., et al. Successful human islet isolation utilizing recombinant collagenase. Diabetes. 52 (5), 1143-1146 (2003).
  25. Nikolic, D. M., et al. Comparative analysis of collagenase XI and liberase H1 for the isolation of human pancreatic islets. Hepatogastroenterology. 57 (104), 1573-1578 (2010).
  26. Machado, L., et al. Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation. Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).
  27. Diel, P., Baadners, D., Schlupmann, K., Velders, M., Schwarz, J. P. C2C12 myoblastoma cell differentiation and proliferation is stimulated by androgens and associated with a modulation of myostatin and Pax7 expression. Journal of Molecular Endocrinology. 40 (5), 231-241 (2008).
  28. Gronemeyer, H., Gustafsson, J. A., Laudet, V. Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (11), 950-964 (2004).
  29. Billas, I., Moras, D. Allosteric controls of nuclear receptor function in the regulation of transcription. Journal of Molecular Biology. 425 (13), 2317-2329 (2013).
  30. Garcia-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
  31. Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 6, 35(2016).
  32. Schultz, E. A quantitative study of the satellite cell population in postnatal mouse lumbrical muscle. The Anatomical Record. 180 (4), 589-595 (1974).
  33. Hyder, A. Effect of the pancreatic digestion with liberase versus collagenase on the yield, function and viability of neonatal rat pancreatic islets. Cell Biology International. 29 (9), 831-834 (2005).
  34. Liang, F., et al. Dissociation of skeletal muscle for flow cytometric characterization of immune cells in macaques. Journal of Immunological Methods. 425, 69-78 (2015).
  35. Park, J. Y., Chung, H., Choi, Y., Park, J. H. Phenotype and tissue residency of lymphocytes in the murine oral mucosa. Frontiers in Immunology. 8, 250(2017).
  36. Skulska, K., Wegrzyn, A. S., Chelmonska-Soyta, A., Chodaczek, G. Impact of tissue enzymatic digestion on analysis of immune cells in mouse reproductive mucosa with a focus on gammadelta T cells. Journal of Immunological Methods. 474, 112665(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CUT And RUNFACS isolatiespierweefsel van muisledematenchromatinestrekkinggenoombrede analysebinding van transcriptiefactorenhistonmodificatiesspierstamcellencistroomanalyse

Gerelateerde artikelen