Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een procedure voor cryosectie van het ganglion met dorsale wortel van muizen

8.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65232

⸱

9 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pain Management, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Anesthesia and Perioperative Care, University of California San Francisco, 3Department of Anesthesiology, Sun Yat-Sen University, 4University of Washington

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt de ontwikkeling gepresenteerd voor het consequent verwerven van hoogwaardige cryostaatsecties voor dorsale ganglions.

Samenvatting

Hoogwaardige cryostatische secties van het dorsale ganglion (DRG) van muizen zijn cruciaal voor een goede immunochemische kleuring en RNAscope-studies bij het onderzoek naar inflammatoire en neuropathische pijn, jeuk en andere perifere neurologische aandoeningen. Het blijft echter een uitdaging om consequent hoogwaardige, intacte en vlakke cryostaatsecties op glasplaatjes te verkrijgen vanwege de kleine steekproefomvang van het DRG-weefsel. Tot nu toe is er geen artikel dat een optimaal protocol voor DRG-cryosecties beschrijft. Dit protocol presenteert een stapsgewijze methode om de vaak voorkomende problemen in verband met DRG-cryosecties op te lossen. In het gepresenteerde artikel wordt uitgelegd hoe u de omringende vloeistof uit de DRG-weefselmonsters kunt verwijderen, de DRG-secties in dezelfde richting op het objectglaasje kunt plaatsen en de secties op het objectglaasje plat kunt maken zonder omhoog te buigen. Hoewel dit protocol is ontwikkeld voor het cryosectieren van de DRG-monsters, kan het worden toegepast voor het cryosectieren van veel andere weefsels met een kleine steekproefomvang.

Inleiding

Het dorsale wortelganglion (DRG) bevat de primaire sensorische neuronen, de weefselmacrofagen en de satellietcellen die de primaire sensorische neuronen omringen 1,2,3,4. Het is een belangrijke anatomische structuur bij het verwerken van onschadelijke en schadelijke signalen en speelt een cruciale rol bij pijn, jeuk en verschillende perifere zenuwaandoeningen 5,6,7,8,9,10,11,12,13. Hoewel er verschillende methoden zijn ontwikkeld om DRG-weefsel uit het ruggenmerg van de muis te ontleden14,15,16, blijft cryosectie van het DRG-weefsel een uitdaging omdat het DRG-weefsel vrij klein is en cryostat-secties van DRG-monsters de neiging hebben om in rollen te buigen, waardoor het moeilijk is om de cryostaatsecties op de juiste manier over te brengen op glasplaatjes. Een goede cryosectie van het DRG-weefsel is echter cruciaal voor immunohistochemische studies en de structuur van DRG-sensorische neuronen 17,18,19,20,21,22,23. Bovendien, aangezien de resultaten van eencellige RNA-sequencing de opmerkelijke heterogeniteit van DRG-sensorische neuronen bij zowel mensen als muizen25 hebben onthuld, is een goede cryosectie van DRG-weefsel van cruciaal belang voor het onderzoeken van de functionele rol van verschillende DRG-cellen in verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden.

Hoewel de weefselopruimingstechniek is toegepast om de 3D-reconstructie van de DRG26 te onderzoeken als een alternatieve techniek voor het cryosectieren van de DRG, is de weefselopruimingstechniek tijdrovend en arbeidsintensief. Ter vergelijking: cryosecties van de DRG zijn snel en relatief eenvoudig uit te voeren, en daarom blijft het een belangrijke techniek voor immunohistochemie en structuurstudies van de DRG en andere regio's van het centrale zenuwstelsel. Het verkrijgen van hoogwaardige, intacte en vlakke cryostaatsecties op glasplaatjes blijft echter een uitdaging in neurowetenschappelijk onderzoek vanwege de kleine steekproefomvang van weefsels, zoals de DRG en bepaalde hersengebieden, en er is geen artikel dat het optimale protocol op dit moment beschrijft voor het cryosectieren van kleine weefselmonsters, zoals DRG's van muizen.

Dit protocol biedt een eenvoudige, stapsgewijze techniek voor cryostaatsecties van de DRG van de muis om op betrouwbare wijze zoveel mogelijk DRG-secties van hoge kwaliteit op de objectglaasjes te verkrijgen voor volgende DRG-onderzoeken. Hoewel deze techniek specifiek is ontworpen voor het cryosectieren van DRG-monsters, kan deze mogelijk worden gebruikt voor het cryosectieren van verschillende andere weefsels met een kleine steekproefomvang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Voor de huidige studie werden de dierproeven goedgekeurd door het UCSF Institutional Animal Care and Use Committee en werden ze uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Volwassen, 8-12 weken oude C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen (in eigen huis gekweekt) werden hier gebruikt.

1. Voorbereiding van DRG-monsters

  1. Verdoof de muizen met 2,5% Avertin (zie Materiaaltabel). Zorg voor voldoende anesthesie door het uitblijven van respons op pijnlijke stimulatie. Doordrenk de dieren transcardieel met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gevolgd door 4% formaldehyde, zoals eerder beschreven14,15,16.
  2. Ontleed DRG-weefsel uit het ruggenmerg, zoals eerder beschreven14,15,16.
  3. Fixeer de ontlede DRG's in 4% formaldehyde gedurende 3 uur bij kamertemperatuur.
  4. Zet de DRG's in 30% sucrose in PBS bij 4 °C gedurende een nacht.
  5. Voorbereiding van de basis optimale snijtemperatuur (OCT)
    1. Voeg de OCT-verbinding toe (zie Materiaaltabel) om de bovenkant van het aluminiumblok te bedekken en vries in bij -20 °C gedurende 5-10 minuten (Figuur 1A).
    2. Snijd de bovenkant van de OCT af met behulp van de cryostaat (zie Materiaaltabel) met een dikte van 30 μm totdat het oppervlak vlak is als de basis OCT (figuur 1B).
    3. Maak een markering aan de onderkant (zes uur-positie) van de basis-OCT om de oriëntatie te markeren, voordat u het aluminium blok van de cryostaat haalt (Figuur 1C).
    4. Houd in de volgende stappen de markering op de positie van zes uur om dezelfde oriëntatie te behouden, wat kan leiden tot het verkrijgen van meer secties van het DRG-monster.
      OPMERKING: Als de oriëntatie verloren gaat en het DRG-monster onder een andere hoek wordt gesneden, kan het DRG-monster niet volledig van boven naar beneden worden gesneden, waardoor sommige monsters op de basis-OCT achterblijven en verspild worden, omdat de basis-OCT zal worden aangetroffen tijdens het proberen het DRG-monster te snijden (Figuur 1C).
  6. Uitvoeren van LGO-inbedding van DRG's
    1. Droog het DRG-weefsel voordat u het op de OKT legt.
      1. Voordat u de DRG aan het blok toevoegt, moet u ervoor zorgen dat de 30% sucrose/PBS-oplossing rond het monster wordt verwijderd.
      2. Droog het DRG-monster door het op een droge petrischaal te plaatsen (Figuur 2A) en het twee of drie keer van de ene locatie naar de andere te verplaatsen met een droog pincet (Figuur 2B).
      3. Droog het pincet af met een pluisvrij zakdoekje voordat u een ander DRG-monster verplaatst (Figuur 2C).
    2. Plaats de droge DRG op de basis OCT.
      1. Plaats met een droog pincet de droge DRG op de basis OCT op de 12-uurspositie (Figuur 1D).
      2. Houd minimaal 5 mm tussen de bovenrand van de DRG en de bovenrand van de basis OCT.
      3. Zet het dorsale deel van de DRG op de 12 uur-positie en het ventrale deel op de zes-uur-positie (Figuur 1D).
    3. Integreer het DRG-weefsel met OCT.
      1. Voeg meer OCT toe om het hele DRG-monster in een ronde of ovale vorm te bedekken, met de DRG in het midden (Figuur 1E).
      2. Zorg ervoor dat de bovenrand van de OCT de DRG aan de bovenrand van de basis-OCT bedekt (Figuur 1F), omdat dit het gemakkelijker maakt om de sectie op het glasplaatje over te brengen (Figuur 3A).
        NOTITIE: Als het deksel OCT zich in het midden van de basis OCT bevindt, blokkeert de bovenrand van de basis OCT het glasglaasje om de sectie op te vangen (Figuur 3B).
      3. Vries het afgedekte OCT- en DRG-monster nog 5 minuten in bij -20 °C (figuur 1G). Snijd de OCT niet rond het DRG-monster.
      4. Snijd de bovenkant van de bekleding af met een dikte van 30 μm totdat de DRG zichtbaar is.

2. Cryosecties van de DRG

  1. Verander de dikte van de cryostaatsectie in 12 μm om DRG-secties op het objectglaasje te snijden (Figuur 1H).
  2. Houd het OCT-gedeelte onderaan vast met een klein penseel dat is afgekoeld tot -20 °C.
    OPMERKING: Het is belangrijk om niet het hele gedeelte volledig af te snijden, maar 1-3 mm ongesneden te laten (Figuur 1I).
  3. Gebruik het uiteinde van een pincet op kamertemperatuur om de onderkant (zes uur-positie) van de sectie voorzichtig aan te raken, zodat deze aan het platformoppervlak blijft plakken (Figuur 1J). Dit voorkomt dat de sectie terugbuigt in een rol, waardoor het moeilijk wordt om de sectie op de dia te verzamelen.
    OPMERKING: Wanneer de onderkant van de sectie aan het platformoppervlak kleeft en de bovenkant van de sectie nog steeds aansluit op de afdekking OCT, heeft de sectie een platte vorm (Figuur 1K), waardoor het veel gemakkelijker wordt om de sectie op de dia te verzamelen.
  4. Neem een opgeladen glasplaatje (zie Materiaaltabel) en plaats het glaasje langzaam over het gedeelte. Zodra het gedeelte aan de slede begint te kleven, trekt u de slede voorzichtig naar achteren (Figuur 1L).
  5. Volg hetzelfde proces om meer DRG-secties op de dia te krijgen zonder de secties te overlappen (Figuur 1M). Zorg ervoor dat een nieuwe DRG-sectie niet over de OCT van een andere DRG-sectie wordt geplaatst (Figuur 4), aangezien een dergelijke sectie niet goed op het glaasje kan blijven liggen en kan worden weggespoeld tijdens het immunochemische kleuringsproces.

3. Nissl-kleuring van het DRG-gedeelte op het glasplaatje

  1. Was de secties gedurende 10 minuten in PBS plus 0,1% Triton X-10. Was de secties vervolgens twee keer met PBS.
  2. Breng een 1:300 Nissl-beits (zie Materiaaltabel) aan op het objectglaasje en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Was de sectie met PBS plus 0,1% Triton X-100. Was de secties vervolgens twee keer met PBS gedurende 5 minuten en vervolgens gedurende 2 uur op kamertemperatuur.
  4. Breng 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) fluoromount-G (zie Materiaaltabel) aan om de secties te bedekken met een dekglaasje.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De huidige studie verzamelde ongeveer 16 continue, hoogwaardige DRG-secties van één muis L4 DRG. De verkregen secties waren zonder enige vervorming. Figuur 1 toont de stapsgewijze procedure voor de cryosectie. De verwijdering van extra vloeistof uit de weefselsecties is weergegeven in figuur 2. Het proces van inbedding van de weefsels in de LGO is weergegeven in figuur 3. Figuur 4 toont de juiste plaats...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol biedt een eenvoudige stap-voor-stap procedure voor cryostaatsecties van de muis-DRG om op betrouwbare wijze DRG-secties van hoge kwaliteit op objectglaasjes te verkrijgen. Er zijn vier cruciale stappen in dit protocol. Eerst moeten het DRG-monster en het pincet droog zijn voordat het DRG-monster op de basis OCT wordt geplaatst. Elke vloeistof rond het DRG-monster zal er een ijsschil omheen vormen, waardoor DRG-secties zich scheiden van de LGO en omhoog buigen. Ten tweede, als het aluminium blok geen merkteke...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AvertinSigma-AldrichT48402-25GVerdoven dier
Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. CrosshatchedFisherbrand1910Houd de OCT-sectie aan de onderkant 
Ergo TweezersFisherbrandS95310Gebruik het uiteinde van een pincet om zachtjes het onderste deel (6 uur) van de sectie aan te raken zodat het aan het platformoppervlak kleeft om te voorkomen dat de sectie in een rol teruggebogen wordt 
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope SlidesFisherbrand1255015Om de DRG-sectie te verzamelen 
Marking pensFisherbrand133794 Markeer de oriëntatie van basis OCT
Scigen Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisherbrand 23730571Inbeddingsmedium voor bevroren weefselspecimens om een optimale snijtemperatuur te garanderen (O.C.T.).

Referenties

  1. Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
  2. Yu, X., et al. Dorsal root ganglion macrophages contribute to both the initiation and persistence of neuropathic pain. Nature Communications. 11 (1), 264(2020).
  3. Costa, F. A. L., Moreira Neto, F. L. Satellite glial cells in sensory ganglia: its role in pain. Brazilian Journal of Anesthesiology. 65 (1), 73-81 (2015).
  4. Noguri, T., Hatakeyama, D., Kitahashi, T., Oka, K., Ito, E. Profile of dorsal root ganglion neurons: study of oxytocin expression. Molecular Brain. 15 (1), 44(2022).
  5. Su, P. P., Zhang, L., He, L., Zhao, N., Guan, Z. The role of neuro-immune interactions in chronic pain: implications for clinical practice. Journal of Pain Research. 15, 2223-2248 (2022).
  6. Esposito, M. F., Malayil, R., Hanes, M., Deer, T. Unique characteristics of the dorsal root ganglion as a target for neuromodulation. Pain Medicine. 20, S23-S30 (2019).
  7. Chen, X. J., Sun, Y. G. Central circuit mechanisms of itch. Nature Communications. 11 (1), 3052(2020).
  8. Guan, Z., Hellman, J., Schumacher, M. Contemporary views on inflammatory pain mechanisms: TRPing over innate and microglial pathways. F1000Research. , (2016).
  9. Boadas-Vaello, P., et al. Neuroplasticity of ascending and descending pathways after somatosensory system injury: reviewing knowledge to identify neuropathic pain therapeutic targets. Spinal Cord. 54 (5), 330-340 (2016).
  10. Guha, D., Shamji, M. F. The dorsal root ganglion in the pathogenesis of chronic neuropathic pain. Neurosurgery. 63, 118-126 (2016).
  11. Shorrock, H. K., et al. UBA1/GARS-dependent pathways drive sensory-motor connectivity defects in spinal muscular atrophy. Brain. 141 (10), 2878-2894 (2018).
  12. Sleigh, J. N., et al. Trk receptor signaling and sensory neuron fate are perturbed in human neuropathy caused by Gars mutations. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (16), E3324-E3333 (2017).
  13. Rubio, M. A., Herrando-Grabulosa, M., Gaja-Capdevila, N., Vilches, J. J., Navarro, X. Characterization of somatosensory neuron involvement in the SOD1(G93A) mouse model. Scientific Reports. 12 (1), 7600(2022).
  14. Sleigh, J. N., West, S. J., Schiavo, G. A video protocol for rapid dissection of mouse dorsal root ganglia from defined spinal levels. BMC Research Notes. 13 (1), 302(2020).
  15. Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia. BMC Research Notes. 9, 82(2016).
  16. Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333(2021).
  17. Haberberger, R. V., Barry, C., Matusica, D. Immortalized dorsal root ganglion neuron cell lines. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 184(2020).
  18. Pokhilko, A., Nash, A., Cader, M. Z. Common transcriptional signatures of neuropathic pain. Pain. 161 (7), 1542-1554 (2020).
  19. Martin, S. L., Reid, A. J., Verkhratsky, A., Magnaghi, V., Faroni, A. Gene expression changes in dorsal root ganglia following peripheral nerve injury: roles in inflammation, cell death and nociception. Neural Regeneration Research. 14 (6), 939-947 (2019).
  20. Miller, R. J., Jung, H., Bhangoo, S. K., White, F. A. Cytokine and chemokine regulation of sensory neuron function. Handbook of Experimental Pharmacology. (194), 417-449 (2009).
  21. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3D organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS One. 12 (7), e0181612(2017).
  22. Nascimento, A. I., Mar, F. M., Sousa, M. M. The intriguing nature of dorsal root ganglion neurons: Linking structure with polarity and function. Progress in Neurobiolology. 168, 86-103 (2018).
  23. Middleton, S. J., Perez-Sanchez, J., Dawes, J. M. The structure of sensory afferent compartments in health and disease. Journal of Anatomy. 241 (5), 1186-1210 (2022).
  24. Nguyen, M. Q., von Buchholtz, L. J., Reker, A. N., Ryba, N. J., Davidson, S. Single-nucleus transcriptomic analysis of human dorsal root ganglion neurons. eLife. 10, e71752(2021).
  25. Usoskin, D., et al. Unbiased classification of sensory neuron types by large-scale single-cell RNA sequencing. Nature Neuroscience. 18 (1), 145-153 (2015).
  26. Hunt, M. A., et al. DRGquant: A new modular AI-based pipeline for 3D analysis of the DRG. Journal of Neuroscience Methods. 371, 109497(2022).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Cryosectionering van DRGmuis DRG sectiescryostaatsectioneringOCT inbeddingprepareren van glazen objectglazenimmunohistochemische kleuringRNAscope studiesconfocale microscopieperifere neurologische aandoeningen
Een procedure voor cryosectie van het ganglion met dorsale wortel van muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.