Hier wordt de ontwikkeling gepresenteerd voor het consequent verwerven van hoogwaardige cryostaatsecties voor dorsale ganglions.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een procedure voor cryosectie van het ganglion met dorsale wortel van muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Hoogwaardige cryostatische secties van het dorsale ganglion (DRG) van muizen zijn cruciaal voor een goede immunochemische kleuring en RNAscope-studies bij het onderzoek naar inflammatoire en neuropathische pijn, jeuk en andere perifere neurologische aandoeningen. Het blijft echter een uitdaging om consequent hoogwaardige, intacte en vlakke cryostaatsecties op glasplaatjes te verkrijgen vanwege de kleine steekproefomvang van het DRG-weefsel. Tot nu toe is er geen artikel dat een optimaal protocol voor DRG-cryosecties beschrijft. Dit protocol presenteert een stapsgewijze methode om de vaak voorkomende problemen in verband met DRG-cryosecties op te lossen. In het gepresenteerde artikel wordt uitgelegd hoe u de omringende vloeistof uit de DRG-weefselmonsters kunt verwijderen, de DRG-secties in dezelfde richting op het objectglaasje kunt plaatsen en de secties op het objectglaasje plat kunt maken zonder omhoog te buigen. Hoewel dit protocol is ontwikkeld voor het cryosectieren van de DRG-monsters, kan het worden toegepast voor het cryosectieren van veel andere weefsels met een kleine steekproefomvang.
Inleiding
Het dorsale wortelganglion (DRG) bevat de primaire sensorische neuronen, de weefselmacrofagen en de satellietcellen die de primaire sensorische neuronen omringen 1,2,3,4. Het is een belangrijke anatomische structuur bij het verwerken van onschadelijke en schadelijke signalen en speelt een cruciale rol bij pijn, jeuk en verschillende perifere zenuwaandoeningen 5,6,7,8,9,10,11,12,13.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Voor de huidige studie werden de dierproeven goedgekeurd door het UCSF Institutional Animal Care and Use Committee en werden ze uitgevoerd in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Volwassen, 8-12 weken oude C57BL/6 mannelijke en vrouwelijke muizen (in eigen huis gekweekt) werden hier gebruikt.
1. Voorbereiding van DRG-monsters
- Verdoof de muizen met 2,5% Avertin (zie Materiaaltabel). Zorg voor voldoende anesthesie door het uitblijven van respons op pijnlijke stimulatie. Doordrenk de dieren transcardieel met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) gevolg....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De huidige studie verzamelde ongeveer 16 continue, hoogwaardige DRG-secties van één muis L4 DRG. De verkregen secties waren zonder enige vervorming. Figuur 1 toont de stapsgewijze procedure voor de cryosectie. De verwijdering van extra vloeistof uit de weefselsecties is weergegeven in figuur 2. Het proces van inbedding van de weefsels in de LGO is weergegeven in figuur 3. Figuur 4 toont de juiste plaats.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol biedt een eenvoudige stap-voor-stap procedure voor cryostaatsecties van de muis-DRG om op betrouwbare wijze DRG-secties van hoge kwaliteit op objectglaasjes te verkrijgen. Er zijn vier cruciale stappen in dit protocol. Eerst moeten het DRG-monster en het pincet droog zijn voordat het DRG-monster op de basis OCT wordt geplaatst. Elke vloeistof rond het DRG-monster zal er een ijsschil omheen vormen, waardoor DRG-secties zich scheiden van de LGO en omhoog buigen. Ten tweede, als het aluminium blok geen merkteke.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Avertin | Sigma-Aldrich | T48402-25G | Verdoven dier |
| Epredia Cryotome Cryostat Cryocassettes, 25 mm dia. Crosshatched | Fisherbrand | 1910 | Houd de OCT-sectie aan de onderkant |
| Ergo Tweezers | Fisherbrand | S95310 | Gebruik het uiteinde van een pincet om zachtjes het onderste deel (6 uur) van de sectie aan te raken zodat het aan het platformoppervlak kleeft om te voorkomen dat de sectie in een rol teruggebogen wordt |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | Om de DRG-sectie te verzamelen |
| Marking pens | Fisherbrand | 133794 | Markeer de oriëntatie van basis OCT |
| Scigen Tissue-Plus O.C.T. Compound | Fisherbrand | 23730571 | Inbeddingsmedium voor bevroren weefselspecimens om een optimale snijtemperatuur te garanderen (O.C.T.). |
Referenties
- Guan, Z., et al. Injured sensory neuron-derived CSF1 induces microglial proliferation and DAP12-dependent pain. Nature Neuroscience. 19 (1), 94-101 (2016).
- Yu, X., et al. Dorsal root gangl....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
