High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

Summary

Een procedure voor het bestuderen van de dynamiek van mitochondriaal DNA (mtDNA) metabolisme in cellen met behulp van een multi-well plaatformaat en geautomatiseerde immunofluorescentie beeldvorming om mtDNA-synthese en -distributie te detecteren en te kwantificeren, wordt beschreven. Dit kan verder worden gebruikt om de effecten van verschillende remmers, cellulaire stress en gen-uitschakeling op het mtDNA-metabolisme te onderzoeken.

Abstract

De overgrote meerderheid van cellulaire processen vereist een continue toevoer van energie, waarvan de meest voorkomende drager het ATP-molecuul is. Eukaryote cellen produceren het grootste deel van hun ATP in de mitochondriën door oxidatieve fosforylering. Mitochondriën zijn unieke organellen omdat ze hun eigen genoom hebben dat wordt gerepliceerd en doorgegeven aan de volgende generatie cellen. In tegenstelling tot het nucleaire genoom zijn er meerdere kopieën van het mitochondriale genoom in de cel. De gedetailleerde studie van de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor de replicatie, reparatie en onderhoud van het mitochondriale genoom is essentieel voor het begrijpen van de goede werking van mitochondriën en hele cellen onder zowel normale als ziekteomstandigheden. Hier wordt een methode gepresenteerd die de high-throughput kwantificering van de synthese en distributie van mitochondriaal DNA (mtDNA) in menselijke cellen die in vitro zijn gekweekt, mogelijk maakt. Deze aanpak is gebaseerd op de immunofluorescentiedetectie van actief gesynthetiseerde DNA-moleculen gelabeld door 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU) -opname en de gelijktijdige detectie van alle mtDNA-moleculen met anti-DNA-antilichamen. Bovendien worden de mitochondriën gevisualiseerd met specifieke kleurstoffen of antilichamen. Het kweken van cellen in een multi-well formaat en het gebruik van een geautomatiseerde fluorescentiemicroscoop maken het gemakkelijker om de dynamiek van mtDNA en de morfologie van mitochondriën onder verschillende experimentele omstandigheden in een relatief korte tijd te bestuderen.

Introduction

Voor de meeste eukaryote cellen zijn mitochondriën essentiële organellen, omdat ze een cruciale rol spelen in tal van cellulaire processen. Eerst en vooral zijn mitochondriën de belangrijkste energieleveranciers van cellen¹. Mitochondriën zijn ook betrokken bij het reguleren van cellulaire homeostase (bijvoorbeeld intracellulaire redox² en de calciumbalans³), celsignalering^4,5, apoptose⁶, de synthese van verschillende biochemische verbindingen ^7,8 en de aangeboren immuunrespons⁹. Mitochondriale disfunctie is geassocieerd met verschillende pathologische toestanden en menselijke ziekten¹⁰.

De werking van mitochondriën hangt af van de genetische informatie in twee afzonderlijke genomen: de nucleaire en mitochondriale genomen. Het mitochondriale genoom codeert voor een klein aantal genen in vergelijking met het nucleaire genoom, maar alle mtDNA-gecodeerde genen zijn essentieel voor het menselijk leven. De mitochondriale eiwitmachinerie die nodig is om het mtDNA in stand te houden, wordt gecodeerd door nDNA. De basiscomponenten van het mitochondriale replisoom, evenals enkele mitochondriale biogenesefactoren, zijn al geïdentificeerd (beoordeeld in eerder onderzoek^11,12). Mitochondriale DNA-replicatie- en onderhoudsmechanismen zijn echter nog lang niet begrepen. In tegenstelling tot nDNA bestaat het mitochondriale genoom in meerdere kopieën, wat een extra laag biedt voor het reguleren van mitochondriale genexpressie. Er is momenteel veel minder bekend over de verdeling en segregatie van mtDNA binnen organellen, in hoeverre deze processen gereguleerd zijn, en zo ja, welke eiwitten erbij betrokken zijn¹³. Het segregatiepatroon is cruciaal wanneer cellen een gemengde populatie van wild-type en gemuteerd mtDNA bevatten. Hun ongelijke verdeling kan leiden tot de generatie van cellen met een schadelijke hoeveelheid gemuteerd mtDNA.

Tot nu toe zijn de eiwitfactoren die nodig zijn voor mtDNA-onderhoud voornamelijk geïdentificeerd door biochemische methoden, bioinformatische analyses of door ziektegerelateerde studies. In dit werk, om een grote kans te garanderen op het identificeren van factoren die eerder aan identificatie zijn ontsnapt, wordt een andere strategie beschreven. De methode is gebaseerd op de etikettering van mtDNA tijdens replicatie of reparatie met 5-broom-2'-deoxyuridine (BrdU), een nucleoside-analoog van thymidine. BrdU wordt gemakkelijk opgenomen in ontluikende DNA-strengen tijdens DNA-synthese en wordt in het algemeen gebruikt voor het monitoren van de replicatie van nucleair DNA¹⁴. De hier ontwikkelde procedure is echter geoptimaliseerd voor het detecteren van BrdU opgenomen in mtDNA met behulp van de immunofluorescentie van anti-BrdU-antilichamen.

De aanpak maakt de high-throughput kwantificering van mtDNA-synthese en -distributie mogelijk in menselijke cellen die in vitro zijn gekweekt. Een high-throughput strategie is noodzakelijk om in relatief korte tijd testen uit te voeren onder verschillende experimentele omstandigheden; Daarom wordt in het protocol voorgesteld om een multi-well-formaat te gebruiken voor celkweek en geautomatiseerde fluorescentiemicroscopie voor beeldvorming. Het protocol omvat de transfectie van menselijke HeLa-cellen met een siRNA-bibliotheek en de daaropvolgende monitoring van mtDNA-replicatie of -reparatie met behulp van de metabole etikettering van nieuw gesynthetiseerd DNA met BrdU. Deze aanpak wordt gecombineerd met immunostaining van het DNA met behulp van anti-DNA-antilichamen. Beide parameters worden geanalyseerd met behulp van kwantitatieve fluorescentiemicroscopie. Bovendien worden mitochondriën gevisualiseerd met een specifieke kleurstof. Om de specificiteit van het protocol aan te tonen, werd BrdU-kleuring getest op cellen zonder mtDNA (rho0-cellen), op HeLa-cellen na het uitschakelen van bekende mtDNA-onderhoudsfactoren en op HeLa-cellen na behandeling met een mtDNA-replicatieremmer. De mtDNA-niveaus werden ook gemeten met een onafhankelijke methode, namelijk qPCR.

Protocol

1. Bereiding van het siRNA-mengsel

1. Een dag voor het begin van het experiment, zaadcellen (bijv. HeLa) op een schaal van 100 mm, zodat ze de volgende dag 70% -90% samenvloeiing bereiken.
   OPMERKING: Alle bewerkingen moeten onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskamer worden uitgevoerd.
2. Bereid de juiste hoeveelheid siRNA verdund tot een concentratie van 140 nM in Opti-MEM-medium (zie tabel met materialen). Een 96-well plaat kan worden gebruikt als reservoir.
3. Voeg 5 μL van de siRNA-oplossing (of Opti-MEM-medium voor de controlemonsters) toe aan elk putje van een zwarte 384-well celkweekmicroplaat.
   OPMERKING: Afhankelijk van het aantal geteste siRNA-monsters kan een elektronische of meerkanaalspipet worden gebruikt.
4. Bereid de juiste hoeveelheid RNAiMAX-transfectiereagensoplossing (zie materiaaltabel) in het Opti-MEM-medium. Voeg 1 μL RNAiMAX toe voor elke 100 μL medium.
5. Voeg 10 μL van de transfectiereagensoplossing toe aan elk putje van de 384-putplaat. De handigste en snelste manier om dit te doen is met een reagensdispenser.
6. Incubeer het siRNA met het transfectiereagens gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.

2. Voorbereiding van cellen voor transfectie

1. Zuig tijdens de incubatie (stap 1.6) het medium op met behulp van een zuigapparaat (zie materiaaltabel) en was de cellen met 3 ml PBS.
2. Voeg 1,5 ml trypsine verdund 1:2 in PBS toe en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 10 minuten.
3. Controleer of de cellen zijn losgemaakt; voeg dan 3 ml DMEM-medium toe met 10% FBS. Suspensie de cellen grondig en breng ze over naar een buis van 15 ml. Neem ten minste 150 μL van de suspensie en tel de cellen in een celtelkamer (zie tabel met materialen).
4. Bereid een celsuspensie in de juiste concentratie (35.000 / ml voor de HeLa-lijn) in DMEM-medium met 10% FBS, penicilline en streptomycine.

3. Celtransfectie

1. Voeg 20 μL van de celsuspensie toe aan elk putje van de 384-putplaat met behulp van de reagensdispenser. Dit resulteert in 700 cellen die per put worden gezaaid.
2. Incubeer de cellen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en plaats ze vervolgens gedurende 72 uur in de incubator (37 °C en 5% CO₂).

4. BrdU oprichting

1. Bereid een 90 μM oplossing van BrdU (zie Materiaaltabel) in DMEM medium met 10% FBS.
2. Voeg 56 h na de siRNA-transfectie (16 uur vóór de celfixatie) 10 μL BrdU-oplossing van 90 μM toe aan elk putje van de 384-well-plaat (de uiteindelijke BrdU-concentratie is 20 μM).
   OPMERKING: De actie moet zo snel mogelijk worden uitgevoerd; Daarom is het het beste om een reagensdispenser, elektronische pipet of pipet met meerdere dispensers te gebruiken. Vergeet niet om controleputten voor te bereiden zonder de toevoeging van BrdU.
3. Incubeer de cellen gedurende 16 uur (37 °C en 5% CO₂).

5. Etikettering van mitochondriën

1. Bereid een 20 μM-oplossing van BrdU in DMEM met 10% FBS en voeg daaraan de mitochondriale trackingkleurstofoplossing (zie materiaaltabel) toe tot een concentratie van 1,1 μM.
2. Voeg 15 h na het begin van de BrdU-opname (1 uur vóór de celfixatie) 10 μL van de mitochondriale trackingkleurstofoplossing (zie materiaaltabel) toe aan elke put van de 384-wellplaat (de uiteindelijke kleurstofconcentratie is 200 nM).
   OPMERKING: Gebruik een reagensdispenser, elektronische pipet of pipet met meerdere dispensers. Vergeet niet om controleputten te behouden zonder de toevoeging van BrdU, maar met de toevoeging van de mitochondriale trackingkleurstof.
3. Incubeer de cellen gedurende 1 uur (37 °C en 5% CO₂).

6. Celfixatie

OPMERKING: Alle wassen wordt het gemakkelijkst uitgevoerd met behulp van een microplaatwasser, terwijl de toevoeging van reagentia het snelst wordt uitgevoerd met behulp van een reagensdispenser.

1. Spoel met behulp van de microplaatwasser (zie materiaaltabel) elke put tweemaal af met 100 μL PBS. Laat na de tweede wasbeurt 25 μL PBS in de put staan.
   OPMERKING: Het achterlaten van PBS in de put vermindert de kans op celloslating tijdens de toevoeging van vloeistof in de volgende stap. Alle wasbeurten worden voltooid met de PBS erin; daarom moet de oplossing die in de volgende stap wordt toegevoegd altijd worden bereid in een concentratie van 2x, omdat deze in een gelijk volume aan de resterende PBS zal worden toegevoegd.
2. Fixeer de cellen door 25 μL van een 8% formaldehyde-oplossing in PBS toe te voegen met 0,4% Triton X-100 en Hoechst 33342 in een concentratie van 4 μg/ml (de uiteindelijke concentraties van individuele reagentia zijn respectievelijk 4%, 0,2% en 2 μg/ml) (zie tabel met materialen).
3. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.

7. Blokkeren

1. Spoel elk goed vier keer af met 100 μL PBS. Laat na de laatste wasbeurt 25 μL PBS in de put staan.
2. Voeg 25 μL van 6% BSA in PBS (de uiteindelijke BSA-concentratie is 3%) toe aan elke put.
3. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 30 min.

8. Toevoeging van de primaire antilichamen

1. Zuig de BSA op met behulp van een microplaatwasser en laat 10 μL oplossing in de put zitten.
2. Voeg 10 μL van de primaire antilichaamoplossing bereid in 3% BSA in PBS toe. Gebruik anti-BrdU bij 0,8 μg/ml en anti-DNA bij 0,4 μg/ml (de uiteindelijke concentraties antilichamen zijn respectievelijk 0,4 μg/ml en 0,2 μg/ml) (zie tabel met materialen).
3. Incubeer de plaat in het donker bij 4 °C gedurende een nacht.

9. Toevoeging van de secundaire antilichamen

1. Spoel elk goed vier keer af met 100 μL PBS. Laat na de laatste wasbeurt 10 μL PBS in de put zitten.
2. Voeg 10 μL van de 4 μg/ml secundaire antilichaamoplossing bereid in 6% BSA in PBS toe (de uiteindelijke concentratie is 2 μg/ml). Gebruik isotype-specifieke antilichamen (anti-muis IgG1 en anti-muis IgM) geconjugeerd aan fluorochromen zoals Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 555 (zie tabel met materialen).
3. Incubeer de plaat in het donker bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
4. Spoel elk goed vier keer af met 100 μL PBS. Laat na de laatste wasbeurt 50 μL PBS in de put staan.
5. Sluit de plaat af met een zelfklevende afdichtingsfolie (zie Materiaaltabel) en bewaar deze in het donker bij 4 °C. Beeldvorming moet binnen 2 weken worden uitgevoerd.

10. Beeldvorming

OPMERKING: Beeldvorming moet worden uitgevoerd met een geautomatiseerde breedveldmicroscoop; De microscoop moet zijn uitgerust met een motortrap die is voorzien van bedieningselementen om afzonderlijke delen van de plaat automatisch in beeld te brengen.

1. Controleer de autofocusinstellingen in de hoekgebieden van de plaat (putjes A1, A24, P24, P1) en in het midden.
   OPMERKING: Voor beeldvorming wordt aanbevolen om een objectief van 20x korte werkafstand te gebruiken (zie materiaaltabel) met een zo hoog mogelijk numeriek diafragma.
2. Selecteer op basis van de intensiteitshistogrammen die door de beeldvormingssoftware in de live view-modus worden gegenereerd, een voldoende lange belichtingstijd voor de afzonderlijke fluorescentiekanalen, zodat het resulterende beeld niet oververzadigd is.
3. Stel het juiste aantal vlakken in voor beeldvorming op de z-as.
   OPMERKING: Het gezichtsveld bij een vergroting van 20x is groot genoeg dat niet alle cellen zich in hetzelfde focusvlak bevinden, dus z-sectie moet worden uitgevoerd om alle cellen in hun juiste focusvlak te bekijken. Meestal zijn vijf vliegtuigen voldoende. Afhankelijk van de beschikbaarheid van schijfruimte kunnen individuele z-stacks of alleen maximale intensiteitsprojecties worden opgeslagen. De beeldanalyse in de sectie representatieve resultaten is gebaseerd op maximale intensiteitsprojecties.
4. Selecteer het juiste aantal gezichtsvelden dat u per put wilt weergeven.
   OPMERKING: Afhankelijk van de samenloop kunnen ongeveer 60-300 cellen in één gezichtsveld worden afgebeeld. Typisch, voor HeLa-cellen met een samenvloeiing van 60% -90%, zal het afbeelden van vijf gezichtsvelden iemand in staat stellen om van 500 cellen tot meer dan 1.000 cellen te analyseren.
5. Selecteer de putten die u wilt afbeelden en begin met beeldvorming.

11. Kwantitatieve beeldanalyse

OPMERKING: De kwantitatieve analyse van verkregen afbeeldingen kan worden uitgevoerd met behulp van een open-source software zoals Cell Profiler¹⁵. Voor deze studie werd de analyse uitgevoerd met behulp van de ScanR 3.0.0-software (zie materiaaltabel).

1. Start de analyse door achtergrondcorrectie uit te voeren voor alle afbeeldingen van alle fluorescentiekanalen. Afhankelijk van de grootte van de geanalyseerde objecten, selecteert u de juiste filtergrootte: 80 pixels voor celkernen en 4 pixels voor BrdU- en mtDNA-vlekken.
2. Begin met het segmenteren van het beeld door een masker van het hoofdobject te maken op basis van de verhouding van de intensiteit van het fluorescentiesignaal tot de achtergrond voor het kanaal dat overeenkomt met de celkernen.
3. Maak maskers voor de subobjecten die respectievelijk de BrdU- en mtDNA-vlekken vertegenwoordigen, met behulp van de fluorescentiekanalen die geschikt zijn voor de gegeven structuren.
   OPMERKING: Elk subobject wordt toegewezen aan het dichtstbijzijnde hoofdobject (celkern).
4. Stel de parameters in die tijdens de analyse moeten worden gemeten en meet de intensiteit van de afzonderlijke pixels in elk masker voor alle fluorescentiekanalen.
   OPMERKING: Het is ook noodzakelijk om het aantal subobjecten te berekenen dat aan een bepaalde celkern is toegewezen en de oppervlakte van elk subobject.
5. Definieer de afgeleide parameters die moeten worden berekend op basis van de verkregen gegevens. Om de totale fluorescentie-intensiteiten voor het BrdU- of mtDNA-kanaal te verkrijgen, somt u de intensiteiten op van alle subobjecten die aan een bepaalde celkern zijn toegewezen. Om de gemiddelde fluorescentie-intensiteit te verkrijgen, deelt u de totale fluorescentie-intensiteit door de som van de oppervlakte van de subobjecten die aan een bepaalde celkern zijn toegewezen.
   OPMERKING: Om ervoor te zorgen dat het gecreëerde subobject (BrdU of mtDNA-vlek) zich daadwerkelijk in de mitochondriën bevindt, is het noodzakelijk om ze te gaten op basis van de fluorescentie-intensiteit van de mitochondriale trackingkleurstof.
6. Voer verdere analyse uit van de gegevens die zijn verkregen met de ScanR-software met behulp van de R 4.2.2 statistische software¹⁶ samen met de volgende pakketten: dplyr 17, data.table 18, ggplot2¹⁹ en ggpubr²⁰. Deze stap is optioneel.

Results

Een schema van de procedure voor de high-throughput studie van de dynamica van mtDNA synthese en distributie is weergegeven in figuur 1. Het gebruik van een multi-well plaatformaat maakt de gelijktijdige analyse van veel verschillende experimentele omstandigheden mogelijk, zoals het uitschakelen van verschillende genen met behulp van een siRNA-bibliotheek. De omstandigheden die worden gebruikt voor het labelen van nieuw gesynthetiseerde DNA-moleculen met BrdU maken de detectie van BrdU-gelab...

Discussion

Historisch gezien is DNA-etikettering door BrdU-opname en antilichaamdetectie gebruikt in nucleaire DNA-replicatie en celcyclusonderzoek 14,27,28. Tot nu toe hebben alle protocollen voor het detecteren van BrdU-gelabeld DNA een DNA-denaturatiestap (zuur of thermisch) of enzymvertering (DNase of proteïnase) opgenomen om blootstelling aan epitoop mogelijk te maken en de penetratie van antilichamen te vergemakkelijken. Deze protoco...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2′,3′-Dideoxycytidine (ddC)	Sigma-Aldrich	D5782
384  Well Cell Culture Microplates, black	Greiner Bio-One	#781946
5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)	Sigma-Aldrich	B5002-1G	Los BrdU poeder op tot 20 mM stockoplossing in water en verdeel in aliquoten. Gebruik 20 µM BrdU oplossing voor labeling.
Adhesive sealing film	Nerbe Plus	04-095-0060
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG1 secundair antilichaam	Thermo Fisher Scientific	A-21121
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgM secundair antilichaam	Thermo Fisher Scientific	A-21426
BioTek 405 LS microplaat washer	Agilent
Bovine Serum Albumine (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Cell counting chamber Thoma	Heinz Herenz	REF:1080339
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Cytiva	SH30243.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	41965-062
Fetal Bovine Serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	10270-106
Formaldehyde solution	Sigma-Aldrich	F1635	Formaldehyde is giftig; lees de veiligheidsgegevensblad aandachtig.
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H3570
IgG1 mouse monoklonaal anti-BrdU (IIB5) primair antilichaam	Santa Cruz Biotechnology	sc-32323
IgM mouse monoklonaal anti-DNA (AC-30-10) primair antilichaam	Progen	#61014
LightCycler 480 System	Roche
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Thermo Fisher Scientific	#13778150
MitoTracker Deep Red FM	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondria tracking dye
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Thermo Fisher Scientific
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	51985-042
Orca-R2 (C10600) CCD Camera	Hamamatsu
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781-100ML
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417-100TAB
PowerUp SYBR Green Master Mix	Thermo Fisher Scientific	A25742
qPCR primer Fw B2M (referentie)			CAGGTACTCCAAAGATTCAGG
qPCR primer Fw GPI (referentiegen)			GACCTTTACTACCCAGGAGA
qPCR primer Fw MT-ND1			TAGCAGAGACCAACCGAACC
qPCR primer Fw POLG			TGGAAGGCAGGCATGGTCAAACC
qPCR primer Fw TFAM			GATGAGTTCTGCCTGCTTTAT
qPCR primer Fw TWNK			GCCATGTGACACTGGTCATT
qPCR primer Rev B2M (referentie)			GTCAACTTCAATGTCGGATGG
qPCR primer Rev GPI (referentiegen)			AGTAGACAGGGCAACAAAGT
qPCR primer Rev MT-ND1			ATGAAGAATAGGGCGAAGGG
qPCR primer Rev POLG			GGAGTCAGAACACCTGGCTTTGG
qPCR primer Rev TFAM			GGACTTCTGCCAGCATAATA
qPCR primer Rev TWNK			AACATTGTCTGCTTCCTGGC
ScanR microscope	Olympus
siRNA Ctrl	Dharmacon	D-001810-10-5
siRNA POLG	Invitrogen	POLGHSS108223
siRNA TFAM	Invitrogen	TFAMHSS144252
siRNA TWNK	Invitrogen	C10orf2HSS125597
Suction device	NeoLab	2-9335	Suction device voor cell culture
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284-500ML
Trypsin	Biowest	L0931-500
UPlanSApo 20x 0.75 NA objectief	Olympus