Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

Summary

We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.

Abstract

Van geleedpotigen is bekend dat ze een verscheidenheid aan virussen van medisch en agrarisch belang overbrengen via hun hemolymfe, wat essentieel is voor virusoverdracht. Hemolymfeverzameling is de basistechnologie voor het bestuderen van virus-vectorinteracties. Hier beschrijven we een nieuwe en eenvoudige methode voor de kwantitatieve verzameling van hemolymfe van kleine geleedpotigen met behulp van Laodelphax striatellus (de kleine bruine planthopper, SBPH) als een onderzoeksmodel, omdat deze geleedpotige de belangrijkste vector is van het rijststreepvirus (RSV). In dit protocol begint het proces door voorzichtig een been van de bevroren geleedpotige af te knijpen met een pincet met een fijne punt en de hemolymfe uit de wond te drukken. Vervolgens wordt een eenvoudige micropipette bestaande uit een capillair en een pipetbol gebruikt om de transudatieve hemolymfe uit de wond te verzamelen volgens het principe van capillaire krachten. Ten slotte kan de verzamelde hemolymfe worden opgelost in een specifieke buffer voor verder onderzoek. Deze nieuwe methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen is een nuttig en efficiënt hulpmiddel voor verder onderzoek naar arbovirussen en vector-virus interacties.

Introduction

Zowel dierlijke als plantaardige virussen kunnen worden overgedragen door geleedpotigen, en deze virussen vormen een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid en veroorzaken enorme economische verliezen in de landbouw ^1,2,3. Belangrijk is dat de geleedpotige hemolymfe, die dient als de bloedsomloop en een vitaal element van het immuunsysteem in geleedpotigen, een belangrijke rol speelt bij het reguleren van arbovirale transmissie. Virussen verkregen via de geleedpotige darmen worden pas naar andere weefsels getransporteerd nadat ze met succes zijn ontsnapt aan de ongunstige hemolymfeomgeving 4,5,6,7. De levenscyclus van virussen in de geleedpotige hemolymfe omvat virusoverleving in het vloeibare plasma, binnenkomst in de hemocyt en transport naar andere weefsels, en verschillende virus-vectorinteractiemechanismen treden op in de hemolymfe 8,9,10,11,12. De verticale transmissie van RSV door de SBPH is bijvoorbeeld afhankelijk van een moleculaire interactie tussen het SBPH-vitellogenine-eiwit en het RSV-capside-eiwit (rijststreepvirus)^13,14. Sommige virussen kunnen ontsnappen aan de immuunrespons van de hemolymfe door specifieke vectorfactoren te binden^15,16,17,18. Daarom is het onderzoeken van vector-virusinteracties in de hemolymfe van geleedpotigen belangrijk voor het ontwikkelen van een beter begrip van arbovirusoverdracht.

De hemolymfe van sommige kleine insecten, zoals planthoppers, leafhoppers en sommige muggen, is moeilijk te verzamelen vanwege hun grootte. Om dit probleem aan te pakken, zijn verschillende methoden ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen, waaronder het rechtstreeks inbrengen van een spuitnaald in het insectenlichaam om een microvolume van de hemolymfe te extraheren, het verzamelen van exsudaat van de wondplaats met een pincet met een fijne punt en directe centrifugatie. Deze methoden hebben het mogelijk gemaakt om relatieve genexpressieniveaus en virale titers binnen de hemolymfe 19,20,21 te meten. Een effectieve methode voor het kwantificeren van het hemolymfevolume, die nodig is voor het tellen van hemocyten, eiwitkwantificering en enzymactiviteitsanalyse, is momenteel echter niet beschikbaar voor deze kleine insecten.

De SBPH (kleine bruine planthopper) is een soort kleine insectenvector met een lichaamslengte van ongeveer 2-4 mm. De SBPH is in staat om een verscheidenheid aan plantenvirussen over te brengen, waaronder RSV, maïs ruw dwergvirus en rijstzwart gestreept dwergvirus^22,23,24. De interactie tussen de SBPH en RSV is het afgelopen decennium diepgaand bestudeerd. Om het werken met SBPHs te vergemakkelijken, hebben we een nieuwe en eenvoudige methode ontwikkeld om hemolymfe te verzamelen. Deze methode, die is gebaseerd op het principe van capillaire krachten, maakt gebruik van een capillair met een schaalmarkering om de hemolymfe van het insect op een nauwkeurige en kwantificeerbare manier te verkrijgen. Dit stelt ons in staat om een specifiek volume hemolymfe van kleine insecten efficiënt te verzamelen en de hemolymfe-omgeving van kleine vectoren in meer detail te bestuderen.

Protocol

1. Insecten kweken

1. Verhoog de SBPHs die in dit experiment worden gebruikt in rijstzaailingen (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 rijstzaailingen in een incubator (65 mm x 200 mm) en groei bij 25 °C onder een 16 h lichte/8 h donkere fotoperiode.

2. Dissectie van de SBPHs voor hemolymfeverzameling

1. Doe de SBPHs in een centrifugebuis en plaats ze 10-30 minuten in een ijsbad.
   OPMERKING: Plaats de SBPHs niet minder dan 10 minuten in het ijsbad, anders kunnen de insecten herleven.
2. Plaats een bevroren SBPH op een glazen plaat (zie Materiaaltabel) onder een stereomicroscoop (zie Materiaaltabel) met de buik naar boven gericht. Pas de focus aan op de zes poten van het insect.
3. Bereid twee uiterst nauwkeurige pincetten (zie Materiaaltabel) met ultrafijne uiteinden. Gebruik een pincet om op het lichaam van het insect te drukken om het op zijn plaats te houden en gebruik het andere pincet om voorzichtig een van de poten van het insect te trekken.
   OPMERKING: Voor insecten met een harde schaal kan een oogheelkundig scalpel worden gebruikt voor het afsnijden van een van de benen.
4. Druk zachtjes op de borst van het insect met een pincet om de hemolymfe door de wond naar buiten te laten stromen.
   OPMERKING: De hemolymfe presenteert zich als transparante druppels zonder zichtbare witte vlok. Gooi het lipide weg als er een witte vlok is, die vetlichaamsbesmetting vertegenwoordigt.

3. Hemolymfe collectie met behulp van micropipettes

1. Maak een micropipette. Plaats een capillaire buis (zie materiaaltabel) met een volume van 1 μl in de pipetbol (zie materiaaltabel). Voor nauwkeurige metingen moet u ervoor zorgen dat de schaallijn zichtbaar is.
   OPMERKING: Een klein gaatje aan de bovenkant van de pipetbol is noodzakelijk.
2. Houd bij het verzamelen van de hemolymfe de pipetbol van de micropipette vast en plaats de capillaire buis dicht bij de insectenwond. Verzamel de hemolymfe die uit de wond komt door eenvoudig de punt van het capillair aan de hemolymfe aan te raken.
3. Blokkeer het kleine gaatje aan de bovenkant van de pipetbol iets met de vinger om het absorptieproces te stoppen wanneer de vloeistof in de capillaire buis de gewenste schaallijn bereikt.
   OPMERKING: Verzamel onophoudelijk en snel een monster van 1 μL hemolymfe om lipidebesmetting en buisverstopping te voorkomen.
4. Druk op de pipetbol om de verzamelde hemolymfe af te voeren in 100 μL PBS-buffer (137 mmol/L NaCI, 2,7 mmol/L KCI, 4,3 mmol/L Na 2 HPO 4, 1,4 mmol/L KH 2 PO 4, pH 7,2-7,4).
   OPMERKING: De capillaire buis wordt in de PBS-buffer ingebracht.
5. Verander naar een nieuwe capillaire buis bij het verzamelen van nog eens 1 μL monster van hemolymfe.

4. Coomassie Blauwe beits

1. Verzamel 3 hemolymfemonsters met hetzelfde volume (1 μL) van larven in het 3e stadium volgens de protocollen beschreven in stap 3 en voer de verzamelde hemolymfe af in de PBS-buffer om een totaal volume van 100 μL te maken.
2. Voeg 25 μL 5x eiwitbelastingbuffer (250 mmol/L Tris-HCI [pH 6,8], 10% W/V SDS, 0,05% W/V Bromophenol Blue, 50% W/V glycerol, 5% W/V β-mercaptoethanol) toe aan 100 μL van de verdunde hemolymfemonsters en verwarm om de eiwitten te denatureren.
3. Laad 20 μL van de gekookte monsters op een 10% SDS-PAGE eiwitgel (zie tabel met materialen) om de eiwitten te scheiden.
4. Kleur de gel in een Coomassie Blue-oplossing (meng 1 g Coomassie Brilliant Blue R-250 met 250 ml isopropanol, 100 ml ijsazijn en 650 ml ddH₂O en filter eventuele deeltjes uit met filterpapier) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en ontkleur de gel vervolgens gedurende 1 uur met ontkleuringsoplossing (100 ml azijnzuur, 400 ml methanol, 500 ml ddH₂O).

5. Bepaling van de eiwitconcentratie

1. Verdun 10 mg/ml runderserumalbumine (BSA) tot 5 mg/ml, 2,5 mg/ml, 1,25 mg/ml, 0,625 mg/ml en 0,3125 mg/ml met PBS-buffer met behulp van de tweevoudige verdunningsmethode.
2. Zuig 5 μL PBS-buffer en elke concentratie BSA-oplossingen in stap 5.1 aan, voeg 1 ml 1x Bradford-kleurstofreagens toe (zie materiaaltabel) en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gebruik PBS-buffer in Bradford-kleurstofreagens als controle en nul bij OD = 595 nm. Meet de absorptiewaarden van elk van de resterende eiwitconcentraties en maak een standaardcurve.
3. Voeg 1 μL hemolymfe van larvale, vrouwelijke of mannelijke SBPHs toe aan 100 μL PBS-buffer en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 100 minuten bij 1.000 x g bij 4 °C om de hemocyten te verwijderen.
4. Zuig 90 μL supernatant op een nieuwe centrifugebuis en meet de absorptiewaarden van het supernatant volgens de instructies in stap 5.2.
5. Bereken de eiwitconcentraties van de hemolymfemonsters volgens de regressievergelijking van de standaardcurve. Neem drie biologische replicaties met drie technische replica's op in de experimenten.

6. Microscopische detecties

1. Gebruik micropipetten om hemolymfe te verzamelen van 10-15 SBPHs in verschillende ontwikkelingsstadia. Voeg de verzamelde hemolymfe toe aan een buis met 20 μL 4% paraformaldehyde-oplossing (zie materiaaltabel). Incubeer het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de hemolymfe te fixeren.
2. Pipetteer 20 μL vaste hemocyten op het midden van een met silaan bekleed glaasje (zie materiaaltabel).
3. Droog de druppel op in een schuifdroogrek.
   OPMERKING: Vermijd overmatig drogen.
4. Bedek het monster met goudantifade-reagens 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) (zie materiaaltabel) en inspecteer de dia onder een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel).

7. Celkwantificering

1. Verzamel 1 μL hemolymfe uit de SBPHs met een micropipette en los het op in 20 μL PBS-buffer.
2. Verdun de hemolymfemonsters vijfvoudig met PBS-buffer.
3. Pipetteer 20 μL hemolymfeoplossing in het midden van de celtelkamer (zie materiaaltabel). Bedek de druppel met een coverslip (zie Materiaaltabel).
4. Tel de cellen in de vijf vierkanten op de celtelkamer (aanvullende figuur 1), onder een omgekeerde microscoop (zie materiaaltabel). Neem drie biologische replicaties met drie technische replica's op in elk van de experimenten.
   Cellen/μL = totaal aantal van vijf middelste kwadraten × 5 × verdunningsfactor × 10⁴

8. Statistische analyses

1. Voer statistische analyses uit met de bijbehorende software (zie Materiaaltabel). Maak een nieuw bestand en selecteer de kolom, importeer de gegevens en genereer een spreidingsplot met een balk.
2. Bereken het gemiddelde en de SD voor elke groep gegevens met behulp van kolomstatistieken en gebruik een eenrichtings-ANOVA-tool om de significantie van de verschillen tussen de groepen te evalueren. Bepaal het gemiddelde en de SD van drie biologische replicaties met drie onafhankelijke experimenten.

Results

Micropipette model en hemolymfe collectie
We hebben een eenvoudige micropipette ontwikkeld waarvan de werking gebaseerd is op de capillaire krachten van de capillaire buis. De micropipette bestaat uit een capillaire buis en een pipetbol (figuur 1A). Capillaire buizen zijn verkrijgbaar in verschillende volumegroottes, variërend van 1 μL tot 20 μL, en de capillaire buisvolumes worden geselecteerd op basis van de vereisten. Capillaire buizen met kleinere volumes worden niet ...

Discussion

Hemolymfe is het medium van de bloedsomloop in geleedpotigen en arbovirussen kunnen alleen andere geleedpotige weefsels binnendringen als ze de vijandige hemolymfe-omgeving kunnen overleven. Het verzamelen van een hoogwaardig monster van hemolymfe is de eerste stap in het bestuderen van de vector-virusinteracties die optreden in de hemolymfe. Er is gemeld dat hemolymfe van insecten kan worden verkregen op verschillende plaatsen op het lichaam van het insect, waaronder een wond op het voorbeen, een kleine incisie in het h...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% SDS-PAGE proteïnegeel	Bio-rad	4561035	Eiwitscheiding en detectie
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	Voor fixatie van de cellen of weefsels
Bradford kleurreagens	Bio-rad	5000205	Eiwitconcentratie detectie
Capillair	Hirschmann	9000101	Voor het verzamelen van hemolymf
Celtellingskamer	ACMEC	AYA0810	Tellen van hemocyten
Glasplaatje	Gitoglas	10127105A	Voor het houden van insecten
Glasplaatje bekleed met silaan	Sigma	S4651-72EA	Voor het houden van microscoopmonsters
Gouden antifade reagens met DAPI	Invitrogen	P36935	Kernkleuring
Microscoopdekglas	Gitoglas	10212424C	Voor microscopisch onderzoek
Pipetbulb	Hirschmann	9000101	Voor het verzamelen van hemolymf
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistische analyses
Stereomicroscoop	Motic	SMZ-168	Voor insectendissectie
Pincet	Tianld	P5622	Voor insectendissectie
Zeiss geïnverteerde microscoop	Zeiss	Observer Z1	Observatie van hemocyten