Een nauwkeurige en kwantificeerbare methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen

Samenvatting

We beschrijven een methode om kwantificeerbare hemolymfe efficiënt te verzamelen uit kleine geleedpotigen voor latere analyse.

Samenvatting

Van geleedpotigen is bekend dat ze een verscheidenheid aan virussen van medisch en agrarisch belang overbrengen via hun hemolymfe, wat essentieel is voor virusoverdracht. Hemolymfeverzameling is de basistechnologie voor het bestuderen van virus-vectorinteracties. Hier beschrijven we een nieuwe en eenvoudige methode voor de kwantitatieve verzameling van hemolymfe van kleine geleedpotigen met behulp van Laodelphax striatellus (de kleine bruine planthopper, SBPH) als een onderzoeksmodel, omdat deze geleedpotige de belangrijkste vector is van het rijststreepvirus (RSV). In dit protocol begint het proces door voorzichtig een been van de bevroren geleedpotige af te knijpen met een pincet met een fijne punt en de hemolymfe uit de wond te drukken. Vervolgens wordt een eenvoudige micropipette bestaande uit een capillair en een pipetbol gebruikt om de transudatieve hemolymfe uit de wond te verzamelen volgens het principe van capillaire krachten. Ten slotte kan de verzamelde hemolymfe worden opgelost in een specifieke buffer voor verder onderzoek. Deze nieuwe methode voor het verzamelen van hemolymfe van kleine geleedpotigen is een nuttig en efficiënt hulpmiddel voor verder onderzoek naar arbovirussen en vector-virus interacties.

Inleiding

Zowel dierlijke als plantaardige virussen kunnen worden overgedragen door geleedpotigen, en deze virussen vormen een ernstige bedreiging voor de menselijke gezondheid en veroorzaken enorme economische verliezen in de landbouw ^1,2,3. Belangrijk is dat de geleedpotige hemolymfe, die dient als de bloedsomloop en een vitaal element van het immuunsysteem in geleedpotigen, een belangrijke rol speelt bij het reguleren van arbovirale transmissie. Virussen verkregen via de geleedpotige darmen worden pas naar andere weefsels getransporteerd nadat ze met succes zijn ontsnapt aan de ongu....

Protocol

1. Insecten kweken

1. Verhoog de SBPHs die in dit experiment worden gebruikt in rijstzaailingen (Oryza sativa cv. Nipponbare). Plant 20 rijstzaailingen in een incubator (65 mm x 200 mm) en groei bij 25 °C onder een 16 h lichte/8 h donkere fotoperiode.

2. Dissectie van de SBPHs voor hemolymfeverzameling

1. Doe de SBPHs in een centrifugebuis en plaats ze 10-30 minuten in een ijsbad.
   OPMERKING: Plaats de SBPHs niet minder dan 10 minuten in het ijsbad, anders kunnen de insecten herleven.
2. Plaats een bevroren SBPH op een glazen plaat (zie Materiaaltabel) onder een stereom....

Resultaten

Micropipette model en hemolymfe collectie
We hebben een eenvoudige micropipette ontwikkeld waarvan de werking gebaseerd is op de capillaire krachten van de capillaire buis. De micropipette bestaat uit een capillaire buis en een pipetbol (figuur 1A). Capillaire buizen zijn verkrijgbaar in verschillende volumegroottes, variërend van 1 μL tot 20 μL, en de capillaire buisvolumes worden geselecteerd op basis van de vereisten. Capillaire buizen met kleinere volumes worden niet .......

Discussie

Hemolymfe is het medium van de bloedsomloop in geleedpotigen en arbovirussen kunnen alleen andere geleedpotige weefsels binnendringen als ze de vijandige hemolymfe-omgeving kunnen overleven. Het verzamelen van een hoogwaardig monster van hemolymfe is de eerste stap in het bestuderen van de vector-virusinteracties die optreden in de hemolymfe. Er is gemeld dat hemolymfe van insecten kan worden verkregen op verschillende plaatsen op het lichaam van het insect, waaronder een wond op het voorbeen, een kleine incisie in het h.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% SDS-PAGE proteïnegeel	Bio-rad	4561035	Eiwitscheiding en detectie
4% paraformaldehyde	Solarbio	P1110	Voor fixatie van de cellen of weefsels
Bradford kleurreagens	Bio-rad	5000205	Eiwitconcentratie detectie
Capillair	Hirschmann	9000101	Voor het verzamelen van hemolymf
Celtellingskamer	ACMEC	AYA0810	Tellen van hemocyten
Glasplaatje	Gitoglas	10127105A	Voor het houden van insecten
Glasplaatje bekleed met silaan	Sigma	S4651-72EA	Voor het houden van microscoopmonsters
Gouden antifade reagens met DAPI	Invitrogen	P36935	Kernkleuring
Microscoopdekglas	Gitoglas	10212424C	Voor microscopisch onderzoek
Pipetbulb	Hirschmann	9000101	Voor het verzamelen van hemolymf
Prism 8.0 software	GraphPad Software	/	Statistische analyses
Stereomicroscoop	Motic	SMZ-168	Voor insectendissectie
Pincet	Tianld	P5622	Voor insectendissectie
Zeiss geïnverteerde microscoop	Zeiss	Observer Z1	Observatie van hemocyten