Tweestaps tagvrije isolatie van mitochondriën voor verbeterde eiwitontdekking en kwantificering

Samenvatting

We presenteren een tweestappenprotocol voor hoogwaardige mitochondrische isolatie dat compatibel is met eiwitontdekking en kwantificering op proteoomschaal. Ons protocol vereist geen genetische manipulatie en is dus geschikt voor het bestuderen van mitochondriën uit primaire cellen en weefsels.

Samenvatting

De meeste fysiologische en ziekteprocessen, van centraal metabolisme tot immuunrespons op neurodegeneratie, hebben betrekking op mitochondriën. Het mitochondriale proteoom bestaat uit meer dan 1.000 eiwitten en de overvloed van elk kan dynamisch variëren als reactie op externe stimuli of tijdens ziekteprogressie. Hier beschrijven we een protocol voor het isoleren van hoogwaardige mitochondriën uit primaire cellen en weefsels. De tweestapsprocedure omvat (1) mechanische homogenisatie en differentiële centrifugatie om ruwe mitochondriën te isoleren, en (2) tag-vrije immuunvangst van mitochondriën om zuivere organellen te isoleren en verontreinigingen te elimineren. Mitochondriale eiwitten uit elke zuiveringsfase worden geanalyseerd door kwantitatieve massaspectrometrie en verrijkingsopbrengsten worden berekend, waardoor nieuwe mitochondriale eiwitten door subtractieve proteomics kunnen worden ontdekt. Ons protocol biedt een gevoelige en uitgebreide benadering voor het bestuderen van mitochondriale inhoud in cellijnen, primaire cellen en weefsels.

Inleiding

Mitochondriën zijn complexe en dynamische organellen die in staat zijn om de metabolische behoeften van de cel te voelen en zich eraan aan te passen. Centraal in de complexiteit van het cellulaire metabolisme fungeren mitochondriën als metabole hubs waar koolhydraat-, eiwit-, lipide-, nucleïnezuur- en co-factormetabolismereacties samenkomen¹. Ze dienen ook als signaalorganellen voor routes van de aangeboren immuunrespons en als reactie op veranderingen in ionen en reactieve zuurstofsoorten ^2,3. Tot op heden zijn ongeveer 1.100 eiwitten in kaart gebracht aan mitochondriën ^4,5,6, maar we kunnen aannemen dat er nog veel meer moeten worden ontdekt^, vooral die alleen tot expressie komen in bepaalde celtypen of tijdelijk onder specifieke omgevingsomstandigheden. Het ontwikkelen van nieuwe benaderingen voor het kwantificeren van veranderingen in mitochondriale samenstelling in metabole toestanden van belang zal onze kennis van deze organellen vergroten en nieuwe therapeutische wegen benadrukken voor de aandoeningen die worden gekenmerkt door mitochondriale disfunctie⁷.

Momenteel zijn er verschillende mitochondriale isolatieprotocollen beschikbaar, met verschillende opbrengsten en zuiverheidsniveaus⁸. Op centrifugatie gebaseerde benaderingen zijn het populairst, vanwege hun eenvoud en lage kosten. Hoewel geschikt voor de meeste toepassingen, heeft differentiële centrifugatie het nadeel dat het een lagere mitochondriale zuiverheid verkrijgt en grote hoeveelheden uitgangsmateriaal vereist wanneer toepassingen op basis van complexere dichtheidsgradiënt worden gebruikt. In de afgelopen jaren zijn nieuwe methoden voor mitochondriale isolatie ontstaan, zoals tag-based immune capture ("MITO-IP")⁹ en fluorescentie-geactiveerde organelsortering¹⁰. Hoewel beide procedures monsters met een hoge zuiverheid kunnen genereren, vereist de eerste genetische manipulatie om mitochondriën te labelen voor affiniteitszuivering, waardoor de protocollen onverenigbaar zijn met primair materiaal van niet-gemodificeerde organismen of menselijke donoren. Ondertussen is dit laatste afhankelijk van de toegang tot flowcytometrie en sorteerinstrumenten. Het combineren van verschillende isolatiemethoden biedt de belofte van het genereren van robuustere protocollen en verhoogde zuiverheid.

Hier presenteren we een nieuw protocol voor mitochondriën-isolatie op basis van de combinatie van twee bestaande methoden: (1) differentiële centrifugatie om een ruwe mitochondriale fractie te isoleren, en (2) tag-vrije immuunvangst van mitochondriën met superparamagnetische kralen covalent gebonden aan antilichamen tegen translocase van buitenste mitochondriale membraan 22 (Tomm22) ¹¹, een alomtegenwoordig mitochondriaal buitenmembraaneiwit (figuur 1). De procedure die we beschrijven is compatibel met kwantitatieve eiwitmassaspectrometrie en omdat het tagvrij is en geen genetische manipulatie vereist, kan het worden toegepast op een breed scala aan onderzoeksmodellen, van cellijnen tot lichaamsvloeistoffen tot hele dierlijke weefsels. Bovendien maakt het gebruik van twee stappen in het protocol het gebruik van subtractieve proteomics ^6,12 mogelijk voor de ontdekking van nieuwe mitochondriale eiwitten en de studie van hun expressie.

Protocol

Handschoenen moeten te allen tijde worden gedragen en celkweekstappen moeten worden uitgevoerd onder een laminaire stroomkap. De cellen worden bewaard in een 37 °C incubator met 5% CO₂. Het onderzoek dat in dit protocol wordt gepresenteerd, is goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Lausanne en Zwitserland voor het gebruik van dieren.

1. Cultuur van RAW264.7 macrofaag cellijn

1. Kweek de muizen macrofaag RAW264.7 cellen in Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM) met hoge glucose en glutamine aangevuld met 5% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (HI-FBS) en 100 IE / ml penicilline en 100 μg / ml streptomycine (P / S).
   OPMERKING: Om mitochondriën te isoleren, is een enkele confluente plaat van 15 cm (ongeveer 70 x 10 7 RAW264.7-cellen) voldoende.
2. Onderhoud de RAW264.7-cellen in weefselkweekplaten. Een initiële zaaidichtheid van 1 x 10⁵ cellen/ml leidt tot een confluente plaat in 3 dagen. Gebruik 25 ml celsuspensie in media voor een plaat van 15 cm. RAW264.7-cellen hebben een hoge celdelingssnelheid en moeten vaker worden gesplitst dan de meeste cellijnen.
3. RAW264.7-cellen loskoppelen
   1. Zuig de media aan en was de cellen eenmaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
   2. Voeg voor een plaat van 15 cm 8 ml warme RAW-dissociatiebuffer toe (270 mM kaliumchloride, 30 mM natriumcitraatdihydraat in H₂O, steriel gefilterd) en incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 5 minuten.
   3. Voeg een equivalent volume media toe aan de platen (1:1 verdunning van de dissociatiebuffer) en pipet om de cellen los te maken en te homogeniseren.
   4. Breng de celsuspensie over in een conische buis en centrifugeer de buis gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g .
   5. Zuig het supernatant op en resuspensie de pellet in een geschikt volume media (beschreven in stap 1.1) voor celtelling.
      OPMERKING: Andere methoden om RAW264.7-cellen los te koppelen kunnen worden gebruikt, zoals trypsine of een celschraper. Deze methoden zijn echter harder voor de cellen en kunnen leiden tot hun polarisatie in M1-achtige macrofagen in de dagen na het loskoppelen.

2. Isolatie en kweek van van beenmerg afgeleide macrofagen (BMDM's)

OPMERKING: Het hier beschreven protocol is voor een enkele muis en kan worden opgeschaald voor meerdere muizen. Gedetailleerde protocollen voor BMDM-isolatie en -cultuur zijn elders beschreven^13,14.

1. Offer een 8-12 weken oude C57BL/6 muis op met een hoge dosis CO₂.
   OPMERKING: Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen worden gebruikt.
2. Spuit de muis met 75% ethanol om hem te steriliseren.
3. Ontleed en verzamel de heupen, dijbenen en scheenbenen van de muis¹⁵.
4. Om het beenmerg van de dijbenen en scheenbenen te verzamelen, verwijdert u het kniegewrichtsuiteinde van beide botten¹⁵. Herstel beenmerg van de heupen door het acetabulum te verwijderen.
5. Breng de botten over in een conische buis van 50 ml met 4 ml BMDM-media die op ijs worden bewaard (DMEM met hoge glucose en glutamine aangevuld met 5% HI-FBS, P / S en 10 mM HEPES).
   OPMERKING: Het is belangrijk om de botten in de media te houden om uitdroging van het beenmerg tijdens dissectie te voorkomen.
6. Voeg 4 ml PBS en 4 ml warme BMDM-media toe in twee verschillende putjes van een 6-putplaat.
7. Breng de botten en de media over van de 50 ml conische buis naar een lege put van de 6-putplaat.
8. Breng met een tang de botten over naar de PBS-put om ze te wassen.
9. Breng de botten over in de put met warme BMDM-media.
10. Maak een gat van 1-2 mm in diameter in de bodem van twee buizen van 0,5 ml met de tang en plaats ze in een buis van 1,5 ml.
    OPMERKING: Het is niet nodig om media aan de buis toe te voegen voor deze snelle stap.
11. Plaats in elke buis van 0,5 ml een dijbeen, scheenbeen en heup op zo'n manier dat het beenmerg van de blootgestelde botten naar de onderkant van de buizen is gericht.
12. Centrifugeer de buizen op 13.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur om het beenmerg en de overgebleven media door het gat van de buis van 0,5 ml en in de buis van 1,5 ml te verzamelen. Gooi de buisjes van 0,5 ml met de botten weg.
13. Resuspensie van de beenmergkorrels in BMDM-media en breng over in een conische buis van 15 ml.
14. Voeg BMDM-media tot 10 ml toe.
15. Plaats een celzeef van 40 μm op een conische buis van 50 ml en filter de beenmersuspensie erdoorheen.
16. Centrifugeer de gefilterde suspensie op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de intacte cellen terug te winnen en klein vuil uit de celsuspensie te verwijderen.
17. Bereid 70 ml BMDM-media aangevuld met 50 ng / ml macrofaagkoloniestimulerende factor (M-CSF).
18. Resuspensie van de pellet in 10 ml M-CSF-aangevulde BMDM-media.
19. Voeg 9 ml M-CSF-aangevulde BMDM-media toe aan elk van de zeven petrischalen van 10 cm.
20. Plaat 1 ml cellen (ongeveer 1 x 10⁷ cellen) in elk van de zeven petrischalen van 10 cm.
21. Homogeniseer de celsuspensie in elke plaat door voorzichtig op en neer te pipeteren op de plaat en breng de platen over naar de incubator.
22. Voeg na 3 dagen 5 ml warme BMDM-media aangevuld met 50 ng / ml m-CSF toe aan elke plaat.
23. Controleer na 3 dagen (dag 6, na beenmergisolatie) de hechting en differentiatie van de BMDM door microscopie.
    OPMERKING: Op dit punt is het mogelijk om direct door te gaan naar mitochondrische isolatie (stap 3). Als alternatief kan men de BMDM opnieuw benoemen, waardoor ze kunnen worden behandeld met cytokines en kleine moleculen.
24. De BMDM's loskoppelen
    1. Zuig de media van elke plaat en voeg 7 ml koude PBS aangevuld met 5 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) toe.
    2. Incubeer de cellen bij 4 °C gedurende 7-8 min.
    3. Maak de BMDM's los door voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een pipet van 10 ml.
    4. Bundel de geresuspendeerde BMDM's van alle zeven platen in een enkele conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g .
    5. Zuig het supernatant op en resuspensie de cellen in 40 ml warme BMDM-media voor celtelling.
       OPMERKING: Tussen 7-9 x 10 worden⁷ BMDM's per muis verkregen. Een minimum van 6 x 10⁷ BMDM's voor mitochondriale isolatie wordt aanbevolen voor proteomics.
    6. Indien gewenst, plaat en behandel de BMDM's volgens het experimentele doel. Zo niet, ga dan direct verder met stap 3.3.

3. Bereiding van een ruwe mitochondriale fractie door differentiële centrifugatie

OPMERKING: Voer alle centrifugeerstappen uit bij 4 °C. Er zijn twee centrifuges nodig, één met een uitklapbare rotor en adapters voor conische buizen met een relatieve centrifugale kracht van ten minste 300 x g, de andere met een relatieve centrifugale kracht van ten minste 21.000 x g geschikt voor buizen van 1,5 ml. Gebruik bij het gebruik van aanhangende cellen een celschraper.

1. Voor aanhangende cellen, zuig de media op en voeg 10 ml PBS per plaat van 15 cm toe.
   OPMERKING: Door cellen in PBS te schrapen, kan men ze tegelijkertijd wassen. Als de cellen zich al in de suspensie bevinden, gaat u direct verder met stap 3.3.
2. Maak de cellen los met behulp van een celschraper en bundel ze in een enkele conische buis van 50 ml. Homogeniseer de celsuspensie door op en neer te pipetteren.
   OPMERKING: Cellen kunnen worden losgemaakt met behulp van een celschraper, omdat dit sneller is en ze kort daarna worden gelyseerd.
3. Breng voor elke experimentele toestand 5% van het celsuspensievolume over naar een buis van 1,5 ml en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g .
   OPMERKING: Wanneer u suspensiecellen gebruikt, zorg er dan voor dat u de cellen eenmaal eerder met PBS wast om mogelijke verontreinigingen uit de media zoals FBS te verwijderen.
4. Gooi het supernatant weg en houd de pellet op ijs.
   OPMERKING: Dit vertegenwoordigt de "totale cel" fractie voor proteomics.
5. Centrifugeer de rest van de monsters van stap 3.1 of 3.2 bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
6. Voer alle volgende stappen uit op ijs en gebruik ijskoude buffers.
7. Zuig het supernatant op en resuspensie de celpellet in 5 ml ijskoude mitochondriale buffer (MB) (210 mM mannitol, 70 mM sucrose, 10 mM HEPES/NaOH [pH 7,4] en 1 mM EDTA).
8. Recupereer de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
9. Resuspendeer de celkorrel in 0,5 ml koude MB en breng deze over in een buis van 1,5 ml.
   OPMERKING: Deze procedure levert een geschatte celconcentratie op van 1,5 x 10 8 BMDM-cellen / ml of 3 x 10⁸ RAW264,7-cellen / ml.
10. Met behulp van een spuit van 1 ml met een naald van 25 G homogeniseert u de celsuspensie met 30 passages door de naald (figuur 1A).
11. Voeg 1 ml koude MB toe aan de buis en meng door inversie. Centrifugeer de gehomogeniseerde celsuspensie bij 2.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
12. Breng 1 ml van het supernatant over in een verse buis van 1,5 ml op ijs zonder de celkorrel te verstoren. Resuspensie van de celkorrel en homogeniseer deze opnieuw, zoals in stap 3.7.
13. Bundel de gehomogeniseerde celkorrel en het supernatant van de twee voorgaande stappen in een enkele buis van 1,5 ml en centrifugeer deze gedurende 5 minuten bij 4 °C op 2.000 x g .
    OPMERKING: Op dit punt bevat de pellet voornamelijk kernen en ongebroken cellen en wordt weggegooid. Het supernatant bevat cellulair afval, cytosol en organellen, waaronder mitochondriën (figuur 1B).
14. Verdeel het supernatant over vier buisjes van 1,5 ml.
    OPMERKING: Het verdelen van het supernatant over meerdere buizen in dit stadium verbetert de verwijdering van verontreinigingen in de volgende stappen.
15. Voeg MB toe om een eindvolume van 1 ml in elk van de vier buizen te maken. Meng door inversie en centrifugeer de buizen op 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    OPMERKING: Na deze stap is een pellet met twee lagen zichtbaar. De onderste, stevige, bruine pellet bevat mitochondriën en wordt bewaard voor verdere zuivering (figuur 1C). De bovenste, losse, witte pellet bevat andere cellulaire structuren en kan worden weggegooid.
16. Voer deze stap zorgvuldig uit. Verwijder het supernatant met zoveel mogelijk van de witte bovenste pellet. Door er voorzichtig op te pipetteren, is het mogelijk om de witte pellet opnieuw te suspenderen en vervolgens weg te gooien, waardoor de bruine mitochondriale pellet intact blijft.
17. Bewaar een van de vier buisjes met de mitochondriale pellet op ijs. Dit vertegenwoordigt de "ruwe mitochondriën" fractie voor proteomics.
18. Giet de andere drie pellets samen in een buis van 1,5 ml in een eindvolume van 1 ml MB.

4. Superparamagnetische antilichaam-gebaseerde zuivering van mitochondriën

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit in een koelcel bij 4 °C.

1. Breng 1 ml van het ruwe mitochondriale preparaat over van stap 3.18 naar een conische buis van 15 ml en voeg 7 ml MB aangevuld met 150 ml NaCl (MB + NaCl) toe.
   OPMERKING: De toevoeging van NaCl verbetert de antilichaambinding en vermindert de niet-specifieke binding van de verontreinigingen aan de kralen en aan mitochondriën.
2. Voeg 50 μL Tomm22-kralen toe aan de 8 ml ruwe mitochondriale suspensie (figuur 1D) en incuber de buis gedurende 15 minuten bij 4 °C op een roterend wiel bij lage snelheid.
   OPMERKING: Tomm22-kralen zijn covalent gebonden aan Tomm22 monoklonale antilichamen die in de muis zijn opgewekt, gekoppeld aan superparamagnetische kralen.
3. Plaats ondertussen een kolom op de magneet.
4. Breng de kolom in evenwicht met 8 ml MB + NaCl en gooi de doorstroming weg.
5. Na de incubatie van 15 minuten bij 4 °C van het monster met de Tomm22-kralen, brengt u het monster over in de kolom. Gooi de doorstroming weg.
   OPMERKING: Mitochondriën blijven bevestigd aan de magnetische kralen in de kolom (figuur 1E).
6. Was de kolom drie keer met 8 ml MB + NaCl.
7. Verwijder de kolom van de magneet en plaats deze in een conische buis van 15 ml.
8. Elueer de mitochondriën door 1,5 ml MB + NaCl aan de kolom toe te voegen en breng onmiddellijk een zuiger aan om de gezuiverde mitochondriën in de buis te elueren.
9. Breng de geëlueerde mitochondriën over in een buis van 1,5 ml en centrifugeer deze gedurende 10 minuten bij 4 °C bij 21.000 x g .
   LET OP: Er vormt zich een bruine pellet. Dit bevat de geïsoleerde mitochondriën en enkele van de antilichaam-gekoppelde kralen (figuur 1F).
10. Verwijder het supernatant voorzichtig uit de pellet. De pellet vertegenwoordigt de "zuivere mitochondriën" fractie voor proteomics. Deze pellet kan samen met de pellets uit stap 3.4 en 3.17 worden opgeslagen bij -20 °C en is klaar voor downstream toepassingen.

Resultaten

Drie monsters met toenemende mate van mitochondriale zuiverheid worden gegenereerd in het huidige protocol: totale cellen, ruwe mitochondriën ("mito-ruwe") en zuivere mitochondriën ("mito-zuiver") (figuur 1). We valideerden de zuivering van mitochondriën uit de RAW264.7 macrofaagcellijn door gelijke eiwithoeveelheden van elke fractie op een gel en immunoblotting te laden, en ontdekten dat het mitochondriale citraatsynthase (Cs) bij elke zuiveringsstap werd verrijkt; ondertussen verdwenen eiwitten uit het cytosol (GAPDH), het plasmamembraan (Na/K ATPase), de kern (Lamin B), de lysosomen (Lamp1) en het endoplasmatisch reticulum (ER) (Pdi) geleidelijk (figuur 2A). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met behulp van BMDM's. Voor verdere validatie van de zuiverheid en integriteit van de geïsoleerde mitochondriën werd elektronenmicroscopie op de zuivere mitochondriale fractie uitgevoerd. We observeerden mitochondriën met een klassieke ovale vorm en intacte cristae omringd door elektronendichte deeltjes die overeenkomen met de met antilichamen bedekte kralen (figuur 2B). Daarom kan worden geconcludeerd dat ons protocol mitochondriën verrijkt, andere cellulaire componenten uitput en de mitochondriale structurele integriteit handhaaft.

Vervolgens werd een proteoomanalyse van elke fractie uitgevoerd met behulp van vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (LC / MS). Een totaal van 6.248 eiwitten in het extract van totale cellen, waarvan er 907 eerder werden geannoteerd als mitochondriaal in de MitoCarta3.0-inventaris⁵, werden geïdentificeerd. Na het filteren op eiwitten met een drempel van ten minste twee unieke peptiden, berekenden we een verrijkingsscore voor elk eiwit in elk monster op basis van hun intensiteit in vergelijking met het totale aantal cellen. Vervolgens hebben we de eiwitten toegewezen aan zeven belangrijke subcellulaire compartimenten: mitochondriën, ER, lysosomen, Golgi-apparaat, cytoskelet, kern en cytosol, met behulp van Gene Ontology (GO)^16,17 en MitoCarta3.0⁵ als referenties. Belangrijk is dat een gemiddelde verrijking voor mitochondriale eiwitten van meer dan 10-voudig en meer dan 20-voudig in respectievelijk de ruwe en zuivere mitochondriënfracties werd waargenomen (figuur 2C). Daarentegen werden componenten van de andere zes geanalyseerde cellulaire compartimenten uitgeput tijdens de zuiveringsprocedure. Van bijzonder belang is dat we in de ruwe mitochondriale fractie een voorbijgaande verrijking waarnamen voor ER- en lysosomale eiwitten, twee klassen van verontreinigingseiwitten die vaak aanwezig zijn volgens differentiële centrifugatieprotocollen¹⁸. Dit was mogelijk te wijten aan organel-organelinteracties en vergelijkbare sedimentatiecoëfficiënten, vooral voor lysosomen, die zeer overvloedig aanwezig zijn in macrofagen¹⁹. Hoewel beide meestal uitgeput waren na immuunvangst, ontdekten we een klein signaal voor eiwitten van de ER-mitochondriale contactplaatsen in de mitozuivere fractie.

Vervolgens vergeleken we direct de eiwitrijkdom van de totale cellen en van mitozuivere monsters en observeerden we twee verschillende populaties, overeenkomend met mitochondriale en niet-mitochondriale eiwitten (figuur 2D). Terwijl de overgrote meerderheid van MitoCarta-eiwitten samen clusterde, vonden we er een paar (<5%) die clusterden met niet-MitoCarta-eiwitten. Deze eiwitten kunnen (1) cytosolische mitochondriën-interagerende eiwitten vertegenwoordigen (een nieuwe categorie geannoteerd in versie 3.0 van MitoCarta), (2) dual-gelokaliseerde eiwitten of (3) verkeerd geannoteerde eiwitten. Omgekeerd vonden we een paar gevallen van niet-MitoCarta-eiwitten die clusteren met mitochondriale eiwitten. Hoewel dergelijke eiwitten verontreinigingen van de isolatieprocedure kunnen vertegenwoordigen, kunnen ze ook eiwitten vertegenwoordigen die niet eerder zijn geclassificeerd als aanwezig in mitochondriën.

Om deze nieuwe klasse van potentiële mitochondriale eiwitten, subtractieve proteomica, te onderzoeken, werd een benadering gebruikt die nuttig is gebleken voor de ontdekking van organellaire proteomen, waaronder mitochondriën ^6,12. Subtractieve proteomics gaat ervan uit dat mitochondriën verrijkt moeten worden tijdens de zuiveringsstappen en dat verontreinigingen uitgeput moeten raken⁶. Terwijl verontreinigingen zich bijvoorbeeld kunnen ophopen tijdens differentiële centrifugatie (bijvoorbeeld als gevolg van vergelijkbare sedimentatie-eigenschappen) of tijdens immuunvangst (bijvoorbeeld als gevolg van niet-specifieke antilichaambinding), mogen alleen bonafide mitochondriale eiwitten zich in beide aanzienlijk ophopen. Het is dus mogelijk om eiwitten eruit te filteren die in de zuivere mitochondriënfractie werden aangetroffen, maar inconsistente verrijkingspatronen vertoonden. In het huidige voorbeeld met RAW264.7-cellen, door een drempel in te stellen voor unieke peptiden van ≥1 voor de mito-ruwe en mito-zuivere monsters, en door strenge verrijkingsdrempels te gebruiken, konden we de lijst van teruggewonnen mitochondriale proteomen verfijnen van 1.127 eiwitten die aanvankelijk werden aangetroffen in de ruwe mitochondriale fractie na differentiële centrifugatie, tot 481 eiwitten na de tweede zuiveringsronde met behulp van Tomm22-immunoselectie. Het verminderde aantal MitoCarta geannoteerde eiwitten in de mito-zuivere fractie weerspiegelt de hoge strengheid die wordt toegepast voor selectie. Interessant is dat 70 van de eiwitten in de mito-zuivere fractie niet aanwezig waren in de MitoCarta3.0-inventaris (figuur 3A, B). Deze laatste eiwitten kunnen potentiële nieuwe mitochondriale kandidaat-eiwitten vertegenwoordigen, die alleen tot expressie mogen komen in de RAW264.7-macrofaagcellijn en in verwante cellen, en die verder onderzoek verdienen.

Figuur 1: Illustratie van het tweestaps, tag-vrije mitochondriale isolatieprotocol . (A) Een celsuspensie wordt verstoord door een naald van 25 G. (B) Kernen en hele cellen worden gescheiden door centrifugatie bij 2.000 x g en het supernatant wordt opgeslagen. (C) Ruwe mitochondriën worden geïsoleerd door differentiële centrifugering van het supernatant op 13.000 x g (mito-ruw). (D) Ruwe mitochondriën worden vervolgens geïncubeerd met Tomm22-antilichamen (Ab) die covalent zijn gekoppeld aan superparamagnetische kralen. (E) De mitochondriën-Tomm22 antilichaam-kralen complexen worden gescheiden van verontreinigingen met behulp van magnetische kolommen en geëlueerd. (F) Zuivere mitochondriën worden verzameld en geconcentreerd door centrifugering (mitozuiver). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Representatieve resultaten van mitochondriale isolatie van twee macrofaagbronnen. (A) Eiwitimmunoblotanalyse van RAW264.7 (boven) en BMDM-cellen (onder) met behulp van antilichamen tegen mitochondriaal citraatsynthase (Cs - mitochondriën), glyceraldehyde 3-fosfaatdehydrogenase (Gapdh - cytosol), natrium-kaliumpomp (Na/K ATPase - plasmamembraan), Lamin B (Lamin B - kern), lysosomaal geassocieerd membraaneiwit 1 (Lamp1 - lysosoom) en eiwitdisulfide-isomerase (Pdi - ER). (B) Elektronenmicroscopie van gezuiverde mitochondriën uit RAW264.7-cellen. Deeltjes met een hoge dichtheid rond mitochondriën komen overeen met de Tomm22-kralen die na elutie uit de kolommen met mitozuivere monsters worden gedragen. Schaalstaven: 80 nm. (C) Verrijkingsscores voor totale cellen, mito-ruwe en mito-pure uit zeven cellulaire compartimenten in RAW264.7-cellen. MitoCarta3.0 en GO werden gebruikt voor eiwitannotatie en de gemiddelde scores worden weergegeven. Afkorting: ER = endoplasmatisch reticulum. (D) Eiwitabundantiewaarden (riBAQ) voor eiwitten in totale cellen en mitozuivere monsters van RAW264.7-cellen. MitoCarta3.0-eiwitten worden weergegeven in oranje. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Ontdekking van nieuwe mitochondriale eiwitten met behulp van subtractieve proteomics. (A) Subtractieve proteomics strategie voor de ontdekking van nieuwe mitochondriale eiwitten. Hoge selectiedrempels (4x en 2x) worden toegepast om de selectie van valse positieven te minimaliseren. (B) Verrijkingsopbrengsten (vouw van het totaal aantal cellen) van nieuwe mitochondriale kandidaat-eiwitten die niet eerder zijn geannoteerd in de MitoCarta3.0-inventaris. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

We hebben differentiële centrifugatie en immunocapture gecombineerd om een verbeterde zuiverheid voor mitochondriale isolatie te bereiken. Onze procedure biedt toegang tot primair materiaal voor de identificatie en karakterisering van nieuwe mitochondriale eiwitten. Het protocol is eenvoudig en robuust en kan worden toegepast op cellijnen, primaire cellen en weefsels zonder dat genetische modificatie nodig is. We hebben ons protocol gevalideerd door immunoblotting en proteomics-analyses op monsters die in verschillende stadia van het zuiveringsproces zijn genomen.

In vergelijking met enkele isolatiemethoden genereert de combinatie van verrijkingsstappen van verschillende aard - hier centrifugatie en immuunetikettering - een robuuster protocol om mitochondriën te isoleren. Dit komt omdat, terwijl mitochondriale eiwitten in beide zuiveringen verrijkt zullen worden, het onwaarschijnlijk is dat verontreinigingen ook na beide verrijkingsstappen zullen worden verrijkt. Hoewel een hoge mitochondriale zuiverheid ook kan worden bereikt door ultracentrifugatie van dichtheidsgradiënt, vereist deze aanpak een grote hoeveelheid uitgangsmateriaal en toegang tot een ultracentrifuge. Ten slotte, in tegenstelling tot recente methoden op basis van tag-gebaseerde mitochondriale isolatie²⁰, vereist onze aanpak geen genetische modificatie van het monster, waardoor het geschikt is voor primair materiaal uit elke bron.

Bij de toepassing van ons protocol moet rekening worden gehouden met enkele technische en biologische overwegingen bij het experimentele ontwerp. (1) De hoeveelheid grondstoffen is van cruciaal belang om voldoende materiaal te verkrijgen. Onvermijdelijk zal een klein aantal mitochondriën verloren gaan tijdens homogenisatie (stap 3.10), omdat niet alle cellen worden gelyseerd, of tijdens de drie kolomwasbeurten (stap 4.6). Hoewel ons protocol zich richt op zuiverheid boven opbrengst, is de efficiëntie van mitochondrische isolatie, en dus hun opbrengst, niet gemeten of geoptimaliseerd. Het gebruik van meer Tomm22-kralen en meer kolommen zal naar verwachting de opbrengst van mitochondriale herstel verhogen. Tegelijkertijd kan een grondige optimalisatie van de homogenisatiestap ook leiden tot een verbeterde mitochondriale opbrengst. Dit protocol en de initiële celnummers die we hier rapporteren voor RAW264.7-cellen en BMDM's zijn voldoende voor proteomics en kunnen worden aangepast voor andere toepassingen. In het geval van primaire BMDM's vonden we dat een enkele muis voldoende was voor één replicatie. Indien nodig kan de procedure worden opgeschaald om BMDM's van meerdere dieren te isoleren, die vervolgens kunnen worden samengevoegd om voldoende materiaal te verkrijgen. Het celnummer kan worden geoptimaliseerd afhankelijk van het celtype, de grootte en de mitochondriale inhoud. (2) Tomm22 wordt uitgedrukt op mitochondriën van alle celtypen en weefsels²¹, maar het expressieniveau kan variëren. Daarom is het bij het ontwerpen van een experiment om verschillende omstandigheden te vergelijken belangrijk om ervoor te zorgen dat de expressieniveaus van Tomm22 vergelijkbaar zijn. Bovendien is het vanwege de alomtegenwoordige expressie van Tomm22 niet mogelijk om celtypespecifieke mitochondriale eiwitten in complexe weefsels te bestuderen. (3) De tijd die nodig is om zuivere mitochondriën te genereren (ongeveer 2,5 uur) is onverenigbaar met een onderzoek naar voorbijgaande gebeurtenissen, zoals veranderingen in metabole profielen. In dit geval raden we directe tag-gebaseerde immuunvangst aan⁹, waarmee ook celtypespecifieke mitochondriën kunnen worden bestudeerd in vivo²⁰. (4) Hoewel studies op geïsoleerde mitochondriën verkregen met behulp van Tomm22 antilichaam-gelabelde kralen alleen activiteit in functionele assays hebben aangetoond¹¹, moet nog worden bepaald of mitochondriën die met ons protocol zijn gegenereerd, compatibel zijn met downstream activity-based assays. MitoTracker of tetramethylrhodamine methylester perchloraat (TMRM) kleuring, of respirometrie metingen, zijn mogelijke benaderingen voor het kwantificeren van de functionaliteit van geïsoleerde mitochondriën²². (5) Na het elueren van het "mitozuivere" monster uit de kolom, zullen sommige Tomm22-kralen aanwezig zijn in de zuivere mitochondriënfractie (Figuur 2B). Hoewel we geen interferentie hebben waargenomen met trypsinevertering en eiwitmassaspectrometrie, moet de aanwezigheid van deze kralen en de immunoglobulinen in andere downstream-toepassingen in aanmerking worden genomen. Het Tomm22-antilichaam is een monoklonaal antilichaam dat bij muizen wordt geproduceerd²³, en daarom is het belangrijk om in gedachten te houden dat, bij het gebruik van secundaire antilichamen tegen muizen in immunoblotting, het niet-specifieke banden zal genereren ter grootte van de immunoglobulineketens. (6) Volledige homogenisatie van de celsuspensie is de sleutel tot de succesvolle isolatie van mitochondriën. Hier gebruiken we een spuit met een naald van 25 G om zowel RAW264.7-cellen als BMDM's te lyseren. Afhankelijk van het celtype en de grootte ervan, kunnen andere mechanische homogenisatiemethoden, zoals het gebruik van een Dounce-homogenisator of meer gecontroleerde benaderingen zoals celhomogenisatorapparaten, echter geschikter zijn. Niet-mechanische homogenisatiemethoden, zoals zachte ultrasoonapparaat, kunnen ook worden overwogen. Weefselhomogenisatiebenaderingen worden verder besproken in andere studies^24,25. (7) Hoewel validatie door immunoblotting de meest eenvoudige en goedkopere methode is, correleren de resultaten ervan niet altijd met veranderingen op het niveau van het hele organel. Daarom raden we aan om proteomics te gebruiken om de verrijking of uitputting van respectievelijk mitochondriën en andere organellen volledig te valideren.

Het tweestaps mitochondriale zuiveringsprotocol dat hier wordt beschreven, heeft ons in staat gesteld om sequentiële monsters te genereren met toenemende mitochondriale zuiverheid, en dit heeft ons in staat gesteld om nieuwe mitochondriale eiwitkandidaten te ontdekken via subtractieve proteomics¹². Voor onze analyse gebruiken we strenge drempels om te selecteren op significant verrijkte mitochondriale eiwitten, en hoewel dit sommige bekende mitochondriale eiwitten niet kan identificeren (figuur 3A), is het vals-positieve percentage voor nieuwe mitochondriale eiwitontdekking afgenomen. Niettemin is het belangrijk om te benadrukken dat alle kandidaat-eiwitten die door ons protocol worden onthuld, moeten worden gevalideerd door middel van orthogonale benaderingen. We raden carboxy-terminale GFP-tagging of het gebruik van antilichamen tegen het endogene eiwit aan om de associatie met mitochondriën microscopisch of door proteasebeschermingstests te valideren.

De directe toepassing van onze methode in het geval van ongewijzigde cellen en weefsels biedt een krachtig hulpmiddel om te onderzoeken hoe mitochondriën veranderen en zich aanpassen aan hun omgeving in gezonde en ziekteomstandigheden. Toepassing van ons protocol op cellijnen, dierziektemodellen, menselijke vloeistoffen en zelfs biopsieën van chirurgie kan bijzonder nuttig blijken te zijn om ons begrip van mitochondriën en hun bijbehorende aandoeningen te vergroten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL spuit	BD Plastipal	309628
25 G naald	BD Microlance	300400
40 µm celzeef	Corning	352340
Anti-TOM22 Microbeads, muis	Miltenyi Biotec	130-127-693
Celschraper	FisherScientific	11577692
DMEM, hoge glucose, GlutaMAX	ThermoFisher	31966
Ethyleendiaminetetraazijnzuur	FisherScientific	BP-120-1
Foetaal bovien serum	Gibco	10270
HEPES	BioConcept	5-31F00-H
LS kolommen en plunjer	Miltenyi Biotec	130-042-401
Macrofaag koloniestimulerende factor	Immunotools	12343115
Mannitol	Sigma	M4125
Natriumchloride	Sigma	71380
Sucrose	Sigma	S1888
Penicilline/Streptomycine	BioConcept	4-01F00-H
Petrischalen	Corning	BH93B-102
Fosfaat gebufferde zoutoplossing 10X	Eurobio Scientific	CS3PBS01-01
QuadroMACS Separator	Miltenyi Biotec	130-090-976
Vi-CELL BLU Celviabiliteits Analyzer	Beckman Coulter	C19196