Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.

Samenvatting

De pancreaseilandjes van Langerhans, kleine 3D-verzamelingen van gespecialiseerde endocriene en ondersteunende cellen verspreid over de alvleesklier, spelen een centrale rol bij de controle van de glucosehomeostase door de afscheiding van insuline door bètacellen, die de bloedglucose verlaagt, en glucagon door alfacellen, die de bloedglucose verhoogt. Intracellulaire signaalroutes, inclusief die gemedieerd door cAMP, zijn essentieel voor gereguleerde secretie van alfa- en bètacelhormonen. De 3D-eilandjesstructuur, hoewel essentieel voor de gecoördineerde eilandjesfunctie, vormt experimentele uitdagingen voor mechanistische studies van de intracellulaire signaalroutes in primaire menselijke eilandjescellen. Om deze uitdagingen en beperkingen te overwinnen, beschrijft dit protocol een geïntegreerd beeldvormings- en microfluïdisch platform voor levende cellen met behulp van primaire menselijke pseudo-eilandjes die zijn gegenereerd door donoren zonder diabetes die qua morfologie, samenstelling en functie lijken op inheemse eilandjes. Deze pseudo-eilandjes worden op grootte gecontroleerd door het dispersie- en reaggregatieproces van primaire menselijke eilandjescellen. In de gedispergeerde toestand kan de genexpressie van eilandjescellen worden gemanipuleerd; zo kunnen biosensoren zoals de genetisch gecodeerde cAMP-biosensor, cADDis, worden geïntroduceerd. Eenmaal gevormd, maken pseudo-eilandjes die een genetisch gecodeerde biosensor tot expressie brengen, in combinatie met confocale microscopie en een microperifusieplatform, de synchrone beoordeling mogelijk van fluorescerende biosensordynamiek en alfa- en bètacelhormoonsecretoire profielen om meer inzicht te geven in cellulaire processen en functie.

Inleiding

De eilandjes van Langerhans zijn mini-organen verspreid over de alvleesklier waarvan de functie cruciaal is voor het behoud van de glucosehomeostase. Insuline wordt uitgescheiden door bètacellen na het metabolisme van glucose, een toename van de ATP/ADP-verhouding, de sluiting van ATP-gevoelige kaliumkanalen, depolarisatie van het plasmamembraan en de instroom van extracellulair calcium¹. De glucagonsecretie van alfacellen wordt minder begrepen, maar er is gepostuleerd dat intracellulaire en paracriene routes bijdragen aan de exocytose van glucagonkorrels ^2,3,4. Zowel diabetes type 1 als type 2 worden in verband gebracht met disfunctie van eilandjescellen ^5,6,7. Daarom is het ophelderen van de intracellulaire signaalroutes die de secretie van eilandjeshormoon mediëren essentieel voor het begrijpen van fysiologische en pathologische mechanismen in pancreaseilandjes.

De bolvormige architectuur van eilandjes vormt een aantal obstakels voor experimenten. Deze uitdagingen omvatten variatie in de grootte van eilandjes en de 3D-aard van eilandjes, waardoor de virale transductie in de eilandjeskern wordt verminderd ^8,9. Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, werd een pseudo-eilandjessysteem ontwikkeld, waarbij primaire menselijke eilandjes worden verspreid in afzonderlijke cellen, adenoviaal worden getransduceerd met constructies die coderen voor doelen van belang, en opnieuw worden samengevoegd om groottegecontroleerde, eilandjesachtige structuren te vormen die pseudo-eilandjes worden genoemd⁷. Vergeleken met inheemse eilandjes van dezelfde donor die parallel zijn gekweekt, zijn deze pseudo-eilandjes vergelijkbaar in morfologie, endocriene celsamenstelling en hormoonsecretie⁷. Deze methode maakt het mogelijk om constructen in het hele pseudo-eilandje tot expressie te brengen, wat betekent dat het een eerdere barrière voor de uniforme genetische manipulatie van primaire menselijke eilandjes overwint ^7,8,9.

In dit protocol is het pseudo-eilandjessysteem geïntegreerd met een microfluïdisch apparaat om biosensoren tot expressie te brengen in primaire menselijke eilandjescellen en om temporele resolutie van pseudo-eilandhormoonsecretie te verkrijgen tijdens dynamische perifusie^10,11,12. De pseudo-eilandjes worden in een microchip geplaatst en via een peristaltische pomp blootgesteld aan een gestage stroom van verschillende secretagogen¹². De microchip heeft een transparante glazen bodem en is gemonteerd op een confocale microscoop om de intracellulaire signaaldynamiek vast te leggen via veranderingen in de fluorescentie-intensiteit van de biosensor. Biosensorbeeldvorming wordt gesynchroniseerd met de verzameling van microperifusie-effluent voor de daaropvolgende analyse van insuline- en glucagonsecretie⁷. In vergelijking met macroperifusie maakt deze microperifusiebenadering het mogelijk om minder pseudobeitels te gebruiken vanwege het kleinere volume van het microfluïdische apparaat in vergelijking met de macroperifusiekamer⁷.

Om het nut van dit systeem te benutten, werd de cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) verschildetector in situ (cADDis) biosensor tot expressie gebracht in menselijke pseudobeitlets om de cAMP-dynamiek en hormoonsecretie te beoordelen. De cADDis-biosensor is samengesteld uit een circulair gepermuteerd groen fluorescerend eiwit (cpGFP) dat zich in het scharniergebied bevindt van een uitwisselingseiwit dat wordt geactiveerd door cAMP 2 (EPAC2), dat de regulerende en katalytische regio's met elkaar verbindt. De binding van cAMP aan het regulerende gebied van EPAC2 veroorzaakt een conformatieverandering in het scharniergebied die de fluorescentie van het cpGFP¹³ verhoogt. Intracellulaire boodschappers zoals cAMP wekken insuline- en glucagonsecretie op na de stroomopwaartse activering van G-proteïne gekoppelde receptoren¹⁴. Beeldvorming van levende cellen in combinatie met microperifusie helpt de intracellulaire cAMP-dynamiek te verbinden met de secretie van eilandjeshormonen. In het bijzonder worden in dit protocol cADDis-expressieve pseudo-eilandjes gegenereerd om cAMP-responsen in alfa- en bètacellen op verschillende stimuli te volgen: lage glucose (2 mM glucose; G 2), hoge glucose plus isobutylmethylxanthine (IBMX; 20 mM glucose + 100 μM IBMX; G 20 + IBMX), en lage glucose plus epinefrine (Epi; 2 mM glucose + 1 μM Epi; G 2 + Epi). Deze behandelingsworkflow maakt de beoordeling van de intracellulaire cAMP-dynamiek rechtstreeks mogelijk via 1) IBMX-gemedieerde fosfodiësterase-remming, die de intracellulaire cAMP-niveaus verhoogt door de afbraak ervan te voorkomen, en 2) epinefrine, een bekende cAMP-afhankelijke stimulator van alfacelglucagonsecretie gemedieerd door activering van β-adrenerge receptoren. De stappen voor het opzetten van het microperifusieapparaat voor beeldvormingsexperimenten met levende cellen, het laden van de pseudo-eilandjes in de microchip, synchrone beeldvorming van levende cellen en microperifusie, en de analyse van de biosensorsporen en hormoonsecretie door middel van hormoonassays op basis van microplaten worden hieronder beschreven.

Protocol

Menselijke eilandjes (N = 4 preparaten) werden verkregen via partnerschappen met het Integrated Islet Distribution Program, Human Pancreas Analysis Program, Prodo Laboratories, Inc. en Imagine Pharma. De Vanderbilt University Institutional Review Board beschouwt geanonimiseerde menselijke alvleeskliermonsters niet als onderzoek met menselijke proefpersonen. Dit werk zou niet mogelijk zijn zonder orgaandonoren, hun families en organisaties voor het verkrijgen van organen. Zie tabel 1 voor demografische informatie over donoren. Menselijke eilandjes van alvleesklierdonoren zonder diabetes werden geïsoleerd met minder dan 15 uur koude ischemietijd.

1. Vorming van pseudobeitels (gedetailleerd in Walker et al.⁷)

1. Verkrijg en selecteer primaire menselijke eilandjes met behulp van een P200-pipet en tafelmicroscoop, waarbij u er goed op let dat de pipetpunt niet wordt verontreinigd op oppervlakken buiten het eilandjeskweekmedium (10% FBS, 100 μg/ml streptomycine, 100 E/ml penicilline, 2 mM L-glutamine in CMRL 1066).
2. Breng primaire eilandjes over in een buis van 15 ml en voer alle volgende stappen voor de vorming van pseudo-eilandjes uit onder een weefselkweekkap om besmetting te voorkomen. Dissocieer de primaire eilandjes langzaam gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur met een P1000-pipet in 0,025% trypsine. De oplossing zal ondoorzichtig worden als de eilandjes uit elkaar beginnen te vallen.
   1. Voor deze studies leveren 200-300 met de hand geplukte primaire eilandjes met een diameter van ongeveer 200 μm gedispergeerd in 500 μL 0,025% trypsine één tot twee platen met pseudo-eilandjes van 96 putjes op; Het exacte aantal kan variëren, afhankelijk van de gemiddelde grootte van het eilandje en de levensvatbaarheid. Voor >500 primaire eilandjes, schaal het volume van 0,025% trypsine dat wordt gebruikt in een verhouding van 1:1 (bijv. 600 μL of 0,025% trypsine voor 600 met de hand geplukte eilandjes).
3. Doof de dispersie door een hoeveelheid Vanderbilt Pseudoislet Media (VPM) toe te voegen die gelijk is aan de hoeveelheid trypsine die wordt gebruikt. Was vervolgens twee keer met 1 ml VPM. Centrifugeer voor de wasbeurten de gedispergeerde cellen bij 485 x g gedurende 2-3 minuten bij 4 °C in een tafelcentrifuge. Resuspendeer de cellen in een bepaald volume VPM (meestal 1 ml) om te tellen.
   OPMERKING: De pseudo-eilandgeneratie en de VPM-samenstelling worden gedetailleerd beschreven in een eerdere publicatie⁷. Kort gezegd bevat VPM gelijke volumes verrijkte CMRL-media (20% FBS, 100 μg/ml streptomycine, 100 E/ml penicilline, 1 mM natriumpyruvaat, 2 mM Glutamax, 2 mM HEPES in CMRL 1066) en iEC-media (VEGF Medium Complete Kit minus FBS + 1 fles Endotheelcellen Medium Supplement). Een samenvattend schema van het genereren van pseudo-eilandjes is opgenomen in figuur 1A.
4. Bepaal het celgetal en de levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde celteller door 10 μL Trypan Blue te combineren met 10 μL van de celsuspensie. Meng de celsuspensie goed om een nauwkeurig celgetal te garanderen.
5. Bereken het volume van celsuspensie, virus en VPM dat nodig is voor het gewenste aantal pseudobeitjes. Baseer alle berekeningen op het aantal levende cellen dat in stap 1.4 is verkregen.
   1. Transduceer voor deze onderzoeken gedispergeerde menselijke eilandjescellen bij MOI 500 (N = 1) of 1.000 (N = 2) met Ad-CMV-cADDis in een totaal volume van 500 μL. Eén plaat met getransduceerde pseudobeitels (2.000 cellen/pseudobeitje) levert drie technische replicaten per donor op (32 pseudobeitels/experiment). Het adenovirus werd in dit werk commercieel verkregen.
6. Combineer de berekende hoeveelheden celsuspensie, virus en VPM in een buisje van 1,5 ml. Meng de inhoud voorzichtig door op en neer te pipetteren.
7. Tijdens de transductie de buisjes met open doppen incuberen en gedurende 2 uur afdekken met een steriele petrischaal in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂/95% lucht.
8. Voeg 500 μL VPM toe aan elke buis en was de cellen door ze gedurende 3 minuten bij 4 °C op 500 x g te centrifugeren. Voltooi nog twee wasbeurten voor een totaal van drie wasbeurten. Aspireer supernatant af en resuspendeer de cellen in 1 ml VPM.
9. Bereken het totale volume van de celuitzaaiing (200 μL/pseudobeitje). Voeg de VPM (het berekende celzaaivolume minus 2 ml) toe aan een conische buis van de juiste grootte. Voeg de getransduceerde celsuspensie van stap 1.7 toe aan de conische buis. Houd de conische buis enigszins gesloten maar niet goed gesloten om luchtuitwisseling voor de cellen mogelijk te maken.
10. Spoel de tube van 1,5 ml (uit stap 1.7) met 1 ml VPM en breng de inhoud over naar de conische buis, waarna de conische buis het totale celzaaivolume moet bevatten.
11. Meng de inhoud van de conische buis goed door op en neer te pipetteren met een gemotoriseerde serologische pipet en breng de inhoud vervolgens over in een steriel reagensreservoir. Als het reservoir niet het volledige celzaaivolume bevat, voer dan seriële overdrachten uit en zorg ervoor dat de suspensie bij elke stap goed wordt gemengd.
12. Gebruik een meerkanaals P200-pipet om de celsuspensie in het reagensreservoir 3-4 keer op en neer te pipetteren om homogeniteit te garanderen, en pipetteer vervolgens 200 μL van de celsuspensie in elk putje van de microtiterplaten.
13. Incubeer de pseudobeitjes in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂/95% lucht gedurende 6 dagen zonder mediumveranderingen. Op dag 6 zouden de pseudo-eilandjes volledig gevormd moeten zijn en klaar voor experimenten (Figuur 1B-D).

2. Voorbereiding voor beeldvorming van levende cellen en microperifusie (1 dag voorafgaand aan het experiment)

OPMERKING: Informatie over de bereiding van het microperifusiemedium is beschikbaar via de protocols.io bron (https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html).

1. Oogst de pseudo-eilandjes met behulp van een meerkanaalspipet door ze van de plaat met 96 putjes over te brengen naar een steriele petrischaal. Pluk vervolgens de pseudo-eilandjes met de hand en breng ze over in een andere steriele petrischaal met verse VPM. Laat de pseudo-eilandjes een nacht incuberen in een weefselkweekincubator bij 37 °C en 5% CO₂/95% lucht.
2. Bereid 1 l DMEM door 1 g BSA (radio-immunoassay-kwaliteit), 0,11 g natriumpyruvaat, 0,58 g L-glutamine, 3,2 g natriumbicarbonaat, 1,11 g HEPES en 1 fles DMEM toe te voegen aan 1 l ultragezuiverd water. Bereid een 1 M glucosevoorraadoplossing in DMEM. Bewaar beide oplossingen een nacht op 4 °C.
3. Controleer het debiet van het microperifusiesysteem de dag voorafgaand aan het experiment. Sluit alle slangen aan op een chiphouder met een lege microchip, zoals beschreven in afbeelding 2A-B. Gebruik ultragezuiverd water als effluent om een debiet van 100 μL/min bij de fractiecollector te bevestigen.

3. Toevoeging van secretagogen aan de DMEM (dag van het experiment)

1. Voeg 0,07 mg/ml ascorbaat toe aan de DMEM en bereid de secretagogen in DMEM + ascorbaatbuffer met een glucosevoorraad van 1 M voor de glucosehoudende buffers.
   OPMERKING: Ascorbaat wordt gebruikt om epinefrine te stabiliseren door oxidatie ervan te voorkomen. Als epinefrine niet wordt gebruikt, kan ascorbaat worden weggelaten uit de DMEM.
2. Filtreer de secretagogen twee keer door een poriënfilter van 0,22 μm, waarbij telkens een nieuw filter wordt gebruikt. Verwarm de oplossingen tot 37 °C en meet de glucose via een glucometer om de gewenste concentratie te bevestigen.

4. Opstelling van microperifusieapparatuur

1. Verwarm de omgevingskamer van een confocale laserscanmicroscoop tot 37 °C, zorg ervoor dat alle deuren gesloten zijn en de kamer een stabiele temperatuur behoudt. Plaats de chiphouder met de microchip in de kamer om op te warmen. Controleer de spaantemperatuur met een infraroodpistool.
   OPMERKING: In dit geval is de omgevingskamer ingesteld op 38.5 °C, waardoor de chip 37 °C kan bereiken.
2. Sluit alle slangen aan op de spaanhouder (zoals beschreven in afbeelding 2A-B). Spoellijn met baseline secretagoog gedurende 5 min. In deze studie werd de lijn gespoeld met 2 mM glucose (G 2). Vervang het bellenvangmembraan van de de-bubbler elke 8-10 experimenten.

5. Laden van de pseudo-eilandjes in de microchip

1. Voordat u de microchip laadt, maakt u een helderveld- en donkerveldopname (10x vergroting) van de pseudobeitjes die in het experiment zullen worden gebruikt voor de daaropvolgende kwantificering van eilandjesequivalenten (IEQ).
   OPMERKING: De IEQ wordt gebruikt om de hormoonsecretie te normaliseren naar variaties in het aantal eilandjes in de experimenten. Deze stap kan ook de dag voorafgaand aan het experiment worden uitgevoerd.
2. Zuig eventueel extra vocht op uit de onderste en bovenste helft van de microchip. De bovenste helft van de microchip bevat pakkingen die zorgen voor een adequate afdichting van elk putje, terwijl de onderste helft van de microchip de putjes bevat met een glazen dekglaasje eraan. Maak een kuiltje in de microchip nat met 5 μL DMEM. Zorg ervoor dat u langs de buitenranden van de put spuit om de spleten nat te maken.
3. Gebruik een vooraf bevochtigde pipet om 30-32 pseudobeitjes te verzamelen in een volume van 23 μL en doseer de pseudoislets langzaam in het midden van het putje in het onderste stuk van de microchip. Controleer de punt van de pipet op eventuele pseudobeitjes.
4. Gebruik een gellaadtip om de pseudo-eilandjes voorzichtig in het midden van de put te manoeuvreren. Dit zorgt ervoor dat het maximale aantal pseudobeitels in een gezichtsveld wordt vastgelegd.
5. Maak een afbeelding van de pseudobeitjes in de microchip op de stereoscoop. Deze telling wordt gebruikt om de berekende IEQ aan te passen voor elk pseudo-eilandverlies tijdens dit proces.
   1. Als niet alle pseudobeitjes uit stap 5.3 in de microchip zijn geladen, pas dan de IEQ dienovereenkomstig aan. Als er nu bijvoorbeeld 30 pseudobeitjes worden gevisualiseerd, maar 32 in stap 5.1, bereken dan de IEQ op de afbeeldingen uit stap 5.1 en vermenigvuldig deze vervolgens met 30/32.
6. Plaats de onderkant van de microchip in de microchiphouder. Plaats de bovenkant van de microchip voorzichtig met de groene pakking naar beneden.
7. Terwijl u de microchip op zijn plaats houdt, sluit u voorzichtig de microchiphouder om de microchip aan elkaar te klemmen. Probeer tijdens dit proces geen overmatige druk uit te oefenen op de microchip, omdat dit de vloeistof in de put zal verdringen en kan leiden tot verlies van pseudo-eilandjes. Vermijd het inbrengen van luchtbellen in de put.

6. Synchrone beeldvorming van levende cellen en microperifusie

1. Breng de secretagogen, pomp en microchip in de houder over in de omgevingskamer die op de confocale microscoop is gemonteerd. Leid de effluxslang uit de kamer naar de fractiecollector.
   1. Plaats de buffers in conische buizen van 15 ml met openingen in de doppen. Deze gaten voorkomen dat de opvangslang uit de buis drijft.
   2. Wanneer u de slang in de de-bubbler schroeft, scheidt u de moer en de huls en schroeft u deze vervolgens in de de-bubbler. Dit voorkomt het verdraaien van de lijn.
2. Stel de fractiecollector in om elke 2 minuten te draaien. Plaats het juiste aantal buizen in de fractiecollector, rekening houdend met de wasbeurten en experimentele fracties. Voor deze experimenten werden 15 wasbuizen (30 min totale wasbeurt) en 28 buizen voor fractieverzameling gebruikt.
3. Start de pomp om het basismedium (met de basisglucoseconcentratie) af te geven met 100 μL/min (een afname van 2 minuten bij een debiet van 100 μL/min resulteert in 200 μL effluent per fractiebuis). Dit debiet werd gekozen om de enorme spanning op de pseudobeitelen te beperken en significante bewegingen van pseudobeiteljes tijdens de live beeldvorming te voorkomen.
   1. Let tijdens het lopen van de vloeistof door het apparaat op het volgende:
      1. Let op druppeltjes aan het einde van de uitloop van de fractiecollector, die de stroom door het systeem aangeven.
      2. Let op afname van de uitstroom uit het systeem; als er <200 μL in de opvangbuizen zit, duidt dit erop dat er mogelijk een verstopping of lek in het systeem is. Zie tabel 2 voor een lijst met de mogelijke oorzaken van een verminderd effluentvolume, oplossingen en preventietips.
4. Zodra er een constante mediumstroom uit de effluxslang komt, draait u de kop van de fractiecollector om in de buizen te doseren en start u de fractiecollector. Verzamel de eerste 15 fracties (30 min) als wasbeurt om de pseudobeitjes in evenwicht te brengen. Gebruik deze eerste 15 fracties om een continue en nauwkeurige mediumstroom door het systeem te garanderen. Gooi deze breuken daarna weg.
5. Stel tijdens de wasbeurt van 30 minuten de microscoop in voor beeldvorming van levende cellen volgens deze parameters: objectieflens: U Plan Fluoriet 20x met 1x zoom; fluorescentiekanalen: EGFP (emissie = 510 nm, lasergolflengte = 488, detectiegolflengte = 500-600 nm); tijdreeks: beeld verkregen om de 2 s gedurende het hele experiment (d.w.z. 56 min); Bemonsteringssnelheid: 2 μs/pixel.
   1. Identificeer de onderkant van de pseudobeitjes in het gezichtsveld en stel het brandpuntsvlak in op 15 μm boven deze positie. Dit is het frame dat tijdens het beeldvormingsexperiment zal worden gebruikt.
6. Zodra de wasbeurt van 30 minuten is voltooid, begint u met het verzamelen van fracties en het verzamelen van afbeeldingen.
   OPMERKING: Alles moet in het werk worden gesteld om eventuele problemen vóór deze stap te identificeren en op te lossen. Zodra het verzamelen van gegevens begint, kunnen pauzes in het experiment of overmatige blootstelling aan secretagogen de resultaten nadelig beïnvloeden.
7. Ga door met het perifereren van de pseudobeitjes met basislijnmedium voor de duur van de eerste basislijnverzameling, waarbij het effluent wordt opgevangen in buisjes van 1,5 ml. Verwissel de slang met de hand van de basisbuffer naar de nieuwe stimulusbufferbuis wanneer de tijd geschikt is voor het experiment.
   1. Een standaardsequentie van microperifusie is weergegeven in tabel 3.
   2. Na het verzamelen van ~10 fracties, plaatst u alle fracties in een koelkast van 4 °C tot het einde van het experiment om de afbraak van de hormonen, vooral glucagon, te voorkomen.
   3. Blijf de systeemstroom gedurende het hele experiment volgen door het effluentvolume in elke buis te controleren.
8. Wanneer het experiment is voltooid, schakelt u terug naar het basislijnmedium en laat u de pomp 5 minuten draaien om de stimulus weg te spoelen met het basislijnmedium (in dit geval 2 mM glucose).
9. Stop de pomp en koppel de slang van de microchiphouder los bij de de-bubbler en fractiecollector om de microchiphouder uit de milieukamer te verwijderen. Sluit alle deuren na het verwijderen van de microchip om de temperatuur op peil te houden.
10. Bewaar de perifusaten bij -80 °C voor latere hormoonanalyse.

7. Extractie van pseudo-eilandzuurethanol

1. Open voorzichtig de microchiphouder en til de bovenkant van de microchip eraf. Gebruik een pipet en een tafelmicroscoop om pseudo-eilandjes uit het putje te halen en over te brengen naar een buisje van 1,5 ml. Zorg ervoor dat alle pseudobeitjes worden verzameld met behulp van een tafelmicroscoop indien nodig.
   1. Maak een laatste afbeelding van de pseudobeitjes in de microchip voordat deze uit de put worden verwijderd om het eilandjesextract IEQ aan te passen, vergelijkbaar met in stap 5.5.
2. Was twee keer met 500 μL PBS. Draai de pseudobeitjes tussen elke wasbeurt gedurende 1 minuut op 94 x g en zuig het supernatant af.
3. Voeg na het verwijderen van de laatste wasbeurt 200 μL zure ethanol toe (5,5 ml 95% ethanol + 50 μL 12 N HCl). Een nacht bewaren bij 4 °C.
4. Draai de extracten de volgende dag gedurende 10 minuten op 15.989 x g en 4 °C. Aliquot 45 μL in drie nieuwe tubes. Bewaren bij -80 °C voor analyse van het hormoongehalte. Als alternatief voor het normaliseren van de hormoonsecretie naar de IEQ, kan de hormoonsecretie ook worden genormaliseerd naar het pseudo-eilandhormoongehalte gemeten uit de extracten.

8. Aanvullende experimenten en opruiming

1. Herhaal stap 5-7 met de volgende groepen pseudobeitlets om aanvullende technische replicaten te verkrijgen.
2. Na het beëindigen van alle microperifusie-experimenten, laat u 10% bleekmiddel gedurende 5 minuten door de microchip en slang lopen en vervolgens gedurende 30 minuten ultragezuiverd water om de slang te ontsmetten.

9. Data-analyse

OPMERKING: Beeldvorming van levende cellen werd uitgevoerd met behulp van een confocale microscoop met laserscanning. De beelden werden geanalyseerd met behulp van het microscoop-bijbehorende beeldvormingssoftwarepakket. Hieronder volgen algemene richtlijnen, maar deze kunnen verschillen afhankelijk van de fabrikant van de microscoop en de software voor beeldacquisitie.

1. Bepaling van het totale aantal eilandjesequivalenten (IEQ) voor gegevensnormalisatie
   1. Open het softwareprogramma en klik op het tabblad Acquisitie rechtsboven in het venster. Brand in batch in alle donkere veldafbeeldingen door de functie Batch inbranden te selecteren in de Macro Manager (View > Tool Windows > Macro Manager).
      1. Om meerdere afbeeldingen tegelijk te branden, klikt u op de knop Batchmodus in-/uitschakelen voordat u op de knop Uitvoeren in Macrobeheer klikt. Volg de instructies op het scherm voor het selecteren van de locatie van de bronafbeelding en de bestemmingslocatie voor de gebrande afbeeldingen. Kies voor het afbeeldingsbestandstype Tagged Imagine File Format (*.tif).
   2. Voor de IEQ-meting opent u de gebrande versie van de 10x donkerveldopname die in stap 5.1 is gemaakt. Klik bovenaan op het tabblad Tellen en meten en kies de knop Handmatige HSV-drempel aan de linkerkant.
      1. Gebruik de druppelfunctie om het positieve gebied (in rood) toe te voegen/te verwijderen totdat elk pseudobeitje rood is gemarkeerd, zonder voorbij de pseudobeitjerand te komen. Klik op Tellen en meten.
   3. Gebruik de functies voor automatisch splitsen of handmatig splitsen om de pseudobeitjes die zijn samengevoegd te splitsen.
      1. Als u de pseudobeitjes handmatig wilt splitsen, kiest u de functie voor handmatig splitsen, klikt u met de linkermuisknop om een lijn te tekenen die de pseudobeitjes scheidt en klikt u met de rechtermuisknop om de lijn te voltooien. Om automatisch te splitsen, kiest u de functie voor automatisch splitsen en klikt u op de gegroepeerde pseudobeitels van interesse. Bevestig daarna de juiste automatische splitsing.
   4. In batchgebrande afbeeldingen kunnen de schaalbalk en de vergrotingstekst als positief worden gemarkeerd. Verwijder deze objecten voor een nauwkeurige telling door de tekst- en schaalbalk met de muis te markeren en op de toets Delete te drukken.
   5. Schakel het filter in en uit om te bevestigen dat alle pseudobeitjes worden geteld. Het bestand kan ook buiten het programma worden geopend voor kruisverwijzingen. Als u klaar bent, klikt u op Exporteren naar Excel.
   6. Open de spreadsheet en wijzig deze als volgt.
      1. Verwijder de informatie over het aantal, het gemiddelde en de sortering onderaan. Sorteer de objecten op basis van hun gemiddelde diameter. Voeg een kolom in na de gemiddelde diameter en noem de kolom "Pseudoisletaantal".
      2. Het aantal eilandjes wordt bepaald door het aantal pseudobeitels met gemiddelde diameters die binnen elke index hieronder vallen. Vermenigvuldig het aantal pseudobeitels per index met de respectieve IEQ-conversiefactor en tel deze waarden bij elkaar op om de totale IEQ te bepalen. Voer de IEQ-berekeningen uit op de beelden die vóór elk experiment zijn verkregen. Gebruik de volgende indexen en IEQ-conversiefactoren:
         1-49 μm: × 0,167
         50-100 μm: × 0,667
         101-150 μm: × 1.685
         151-200 μm: × 3.500
         201-300 μm: × 6.315
         301-350 μm: × 10.352
      3. Voor een voorbeeld van een spreadsheet voor het bepalen van de IEQ-tellingen, zie Aanvullend bestand 1.
2. Kwantificering van beeldvorming met levende cellen in software
   1. Open het gewenste bestand (.oir) in cellSens.
   2. Wijs de interessegebieden (ROI's) als volgt aan.
      1. Gebruik de tekengereedschappen om de ROI's aan te duiden (d.w.z. elk pseudo-eilandje). Als u de optie Tekenen uit de vrije hand gebruikt, klikt u met de rechtermuisknop om de vorm te sluiten.
      2. Markeer alle ROI's door de pijl te gebruiken en deze te slepen om alle ROI's in de afbeelding te omvatten. Als alle ROI's zijn gemarkeerd, klikt u met de rechtermuisknop en selecteert u Converteren naar dynamische ROI in de loop van de tijd
      3. Speel het XYT-bestand af om te bevestigen dat de ROI's in de loop van de tijd nauwkeurig zijn. Als de ROI in een bepaalde periode niet nauwkeurig is, corrigeer dan de grootte/locatie in die periode. De software zal de grootte/locatie van de ROI in de loop van de tijd geleidelijk aanpassen aan deze veranderingen. Herhaal deze stappen totdat de ROI nauwkeurig is tijdens het beeldvormingsexperiment.
   3. Voer als volgt intensiteitsmetingen uit op elke ROI.
      1. Klik in de werkbalk op Intensiteitsprofiel meten. Markeer de ROI's die moeten worden geanalyseerd; gebruik shift + klik om meerdere ROI's te selecteren.
         OPMERKING: Hoewel er meerdere bestanden tegelijk geopend kunnen zijn in de software, moet u de ROI's van slechts één bestand tegelijk analyseren.
      2. Als u rekening wilt houden met achtergrondgeluid, selecteert u een constante waarde die u van elke intensiteitswaarde wilt aftrekken, of wijst u één ROI aan als achtergrond. Klik op Uitvoeren.
      3. Klik in de werkbalk Intensiteitsprofiel op Exporteren naar Excel om de gegevens te exporteren.
      4. Normaliseer alle datapunten naar het gemiddelde van de gemeten intensiteiten van 7-8 minuten (d.w.z. de laatste minuut van de eerste basislijn medium perifusie). Deze genormaliseerde waarden op elk tijdstip worden gedefinieerd als de relatieve cADDis-intensiteit. Zie Aanvullend bestand 2 voor een voorbeeld van een spreadsheet met analyse en normalisatie van beeldgegevens.
3. Meet de hormoonsecretie in elke fractie en eilandjesextract. In deze experimenten werden de insuline- en glucagonconcentraties gemeten met ELISA. Normaliseer de hormoonsecretie in elke fractie tot het pseudo-eilandvolume met behulp van de IEQ-metingen bepaald in stap 9.1 of aan de hand van het extracthormoongehalte.

Resultaten

Biosensor-expressieve menselijke pseudo-eilandjes werden gemaakt via de adenovirale afgifte van constructen die coderen voor de cAMP-biosensor cADDis (Figuur 1A). Figuur 1B toont de heraggregatie van de getransduceerde menselijke eilandjescellen in de loop van de tijd, waarbij volledig gevormde pseudo-eilandjes worden waargenomen na 6 dagen kweek. De cellen begonnen binnen 48 uur zichtbare cADDis-fluorescentie te vertonen en tegen het einde van de kweek...

Discussie

De integratie van een microperifusiesysteem, pseudobeitels die biosensor tot expressie brengen en confocale microscopie met laserscanning maakt de synchrone beoordeling van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en dynamische hormoonsecretoire profielen mogelijk. Het dynamische microperifusiesysteem kan een reeks welbepaalde stimuli aan de pseudobeitjes leveren en maakt het mogelijk om het effluent op te vangen, waarbij de insuline- en glucagonconcentraties kunnen worden gemeten door de in de handel verkrijgbare ELIS...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Niet van toepassing
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Verrijkt-CMRL Media Component
1.5 mL en conische buizen	Elk	Elk
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Vervangen elke 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvaat	Thermo Scientific	11360070	Verrijkt-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Zuur Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Verrijkt-CMRL Media Component
Ascorbaat	Sigma	A5960	DMEM Perifusie Buffer Component
Bovine Serum Albumine	Sigma	A7888	DMEM Perifusie Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA  96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysesoftware	Olympus	v3.1	Software gebruikt voor gegevensanalyse
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Verrijkt-CMRL Media Component
Conische adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusie Buffer Component
Milieukamer	okolab	IX83
Epinefrine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulatie Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Warmte Geïnactiveerd	Sigma	12306C	Verrijkt-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Elk	Elk	Zuur Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusie Buffer Component
iCell Endotheel Cellen Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin moer & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulatie Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusie Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip houder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, en P1000 pipetten en tips	Elk	Elk
Penicilline/Streptomycine	Gibco	15140-122	Verrijkt-CMRL Media Component
Peristaltiek pomp	Instech	P720
Fosfaat Gebufferde Saline	Gibco	14190-144	Was Eilandjes
Sarstedt schotels	Sarstedt	hangt af van schoteldiameter
Natrium Bicarbonaat	Sigma	S6014	DMEM Perifusie Buffer Component
Natrium Pyruvaat	Sigma	P2256	DMEM Perifusie Buffer Component
Stereoscoop	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter alle buffers twee keer
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component