Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de isolatie van regionaal gedecellulariseerd longweefsel. Dit protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van complexiteiten in de extracellulaire matrix en cel-matrix interacties.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Dissectie en isolatie van regiospecifiek gedecellulariseerd longweefsel
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Longtransplantatie is vaak de enige optie voor patiënten in de latere stadia van ernstige longziekte, maar dit is beperkt zowel vanwege de levering van geschikte donorlongen als zowel acute als chronische afstoting na transplantatie. Het vaststellen van nieuwe bio-engineeringbenaderingen voor de vervanging van zieke longen is noodzakelijk voor het verbeteren van de overleving van patiënten en het voorkomen van complicaties die verband houden met de huidige transplantatiemethoden. Een alternatieve benadering omvat het gebruik van gedecellulariseerde hele longen zonder cellulaire bestanddelen die meestal de oorzaak zijn van acute en chronische afstoting. Omdat de long zo'n complex orgaan is, is het van belang om de extracellulaire matrixcomponenten van specifieke regio's te onderzoeken, waaronder de vasculatuur, luchtwegen en alveolair weefsel. Het doel van deze aanpak is om eenvoudige en reproduceerbare methoden vast te stellen waarmee onderzoekers regiospecifiek weefsel uit volledig gedecellulariseerde longen kunnen ontleden en isoleren. Het huidige protocol is bedacht voor varkens- en mensenlongen, maar kan ook op andere soorten worden toegepast. Voor dit protocol werden vier regio's van het weefsel gespecificeerd: luchtweg, vasculatuur, longblaasjes en bulklongweefsel. Deze procedure maakt het mogelijk om weefselmonsters te verkrijgen die de inhoud van het gedecellulariseerde longweefsel nauwkeuriger weergeven in tegenstelling tot traditionele bulkanalysemethoden.
Inleiding
Longziekten, waaronder chronische obstructieve longziekte (COPD), idiopathische longfibrose (IPF) en cystische fibrose (CF), blijven momenteel zonder genezing 1,2,3,4. Longtransplantatie is vaak de enige optie voor patiënten in latere stadia, maar dit blijft een beperkte optie, zowel vanwege de levering van geschikte donorlongen als zowel acute als chronische afstoting na transplantatie 3,5,6. Als zodanig is er een kritieke behoefte aan nieuwe behandelingsstrategieën. Een veelbelovende benadering in respiratoire bio-engineering is de toepassing van van weefsel afgeleide steigers bereid uit gedecellulariseerd inheems longweefsel. Omdat acellulaire hele longsteigers veel van de complexiteit van de oorspronkelijke extracellulaire matrix (ECM) samenstelling en bioactiviteit behouden, zijn ze intensief bestudeerd voor whole-organ engineering en als verbeterde modellen voor het bestuderen van longziektemechanismen 7,8,9,10. Tegelijkertijd is er een toenemende interesse in het gebruik van gedecellulariseerde weefsels van verschillende organen, waaronder longen, als hydrogels en andere substraten voor het bestuderen van cel-cel- en cel-ECM-interacties in organoïde en andere weefselkweekmodellen 11,12,13,14,15,16,17 . Deze bieden meer relevante modellen dan commercieel beschikbare substraten, zoals Matrigel, afgeleid van tumorbronnen. De informatie over van de menselijke longen afgeleide hydrogels is momenteel echter relatief beperkt. We hebben eerder hydrogels beschreven die zijn afgeleid van gedecellulariseerde varkenslongen en hebben zowel hun mechanische als materiaaleigenschappen gekarakteriseerd, evenals hun nut aangetoond als celkweekmodellen18,19. Een recent rapport beschrijft de initiële mechanische en visco-elastische karakterisering van hydrogels afgeleid van gedecellulariseerde normale en zieke (COPD, IPF) menselijke longen20. We hebben ook de eerste gegevens gepresenteerd die het glycosaminoglycaangehalte van gedecellulariseerde normale en COPD menselijke longen karakteriseren, evenals hun toepasbaarheid voor het bestuderen van cel-cel- en cel-ECM-interacties11.
Deze voorbeelden illustreren de kracht van het gebruik van gedecellulariseerde menselijke long-ECM's voor onderzoeksdoeleinden. De long is echter een complex orgaan en zowel de structuur als de functie variëren in verschillende regio's van de long, inclusief de samenstelling van de ECM en andere eigenschappen zoals stijfheid21,22. Als zodanig is het van belang om de ECM te bestuderen in individuele regio's van de long, waaronder de luchtpijp en grote luchtwegen, middelgrote en kleine luchtwegen en longblaasjes, evenals grote, middelgrote en kleine bloedvaten. Hiertoe hebben we een betrouwbare en reproduceerbare methode ontwikkeld voor het ontleden van gedecellulariseerde menselijke en varkenslongen en vervolgens het isoleren van elk van die anatomische gebieden. Dit heeft een gedetailleerde differentiële analyse van het regionale eiwitgehalte in zowel normale als zieke longen mogelijk gemaakt21.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierstudies zijn uitgevoerd in overeenstemming met de IACUC van de Universiteit van Vermont (UVM). Alle menselijke longen werden verkregen van UVM Autopsy Services en gerelateerde studies werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van IRB van UVM.
OPMERKING: Decellularisatie van varkens- en menselijke longen is eerder beschreven door onze groep 7,8,9,10,21. Kortom, hele longkwabben worden gedecellulariseerd door sequentiële perfusie van de luchtwegen en vasculatuur met een reeks van 2 L reinigingsmiddel- en enzymoplossingen met behulp van een peristaltische pomp: 0,1% Triton-X 100, 2% natriumdeoxycholaat, 1 M natriumchloride, 30 μg / ml DNase / 1,3 mM MgSO 4/2 mM CaCl2, 0,1% perazijnzuur /4% ethanol, en een gedeïoniseerde waterwassing. Standaardmethoden voor het bevestigen van efficiënte decellularisatie omvatten de bepaling van <50 ng / mg resterend dubbelstrengs DNA in gedecellulariseerde longen en de afwezigheid van DNA-fragmenten door gelelektroforese, en nucleaire kleuring door hematoxyline en eosine (H &E) kleuring 9,21.
1. Instellen
- Verzamel alle benodigde apparatuur die nodig is voor de dissectieprocedure, inclusief een glazen ovenschotel, twee paar chirurgische pincetten, een tang en een paar chirurgische scharen en een autoclaaf voor gebruik.
- Verkrijg een deel van de long, plaats het in de glazen ovenschaal en oriënteer het zo dat het superieure uiteinde van de luchtweg duidelijk te zien is.
- Identificeer het proximale uiteinde van de vasculatuur en houd het intact tot latere stappen. Het uiteinde van de vasculatuur moet duidelijk zichtbaar zijn en volledig ondoorzichtig wit van kleur.
- Verwijder met een pincet en een chirurgische schaar alle borsten die mogelijk langs de buitenkant van de long zitten en gooi deze weg.
2. De luchtweg blootleggen
- Gebruik een spreidingstechniek met de chirurgische schaar en werk voorzichtig om de extra luchtweg bloot te leggen.
- Lokaliseer de grootste luchtweg, die meestal een diameter van ongeveer 2-4 cm heeft. Een andere manier om een luchtweg te identificeren is door de observatie van kraakbeenringen, die visueel of via palpatie van het weefsel kunnen worden gedetecteerd.
- Palpeer met behulp van een tang de lengte van de luchtweg om de locatie van de onzichtbare luchtweg te bepalen tot een diepte van ongeveer 1 inch.
OPMERKING: Omdat het bekleed is met kraakbeenringen, is de luchtweg kenmerkend harder dan de andere longweefsels. Als zodanig zou het vinden en palperen van de onzichtbare luchtweg relatief eenvoudig moeten zijn. - Houd de chirurgische schaar parallel aan de luchtweg en steek de gesloten uiteinden in het weefsel direct rond de onzichtbare luchtweg.
- Open langzaam de chirurgische schaar om het omliggende membraan voorzichtig uit elkaar te trekken. Verwijder vervolgens de chirurgische schaar en vermijd het knippen van welk weefsel dan ook.
- Herhaal dit proces met tussenpozen gedurende de dissectieprocedure om de luchtweg te blijven blootstellen.
- Knip met de chirurgische schaar de luchtweg op de vertakkingspunten af en ontleed langs beide takken onafhankelijk.
OPMERKING: Een vertakkingspunt is een locatie waar één luchtweg zich splitst in twee afzonderlijke luchtwegen. - Scheid gebieden van de luchtweg eenmaal zeker dat de intacte uiteinden identificeerbaar en gemakkelijk te lokaliseren zullen blijven voor verdere dissectie.
- Plaats afgehakte delen van de luchtweg in de overeenkomstige buis. De grootte van de afgesneden gebieden varieert afhankelijk van het monster, maar zal over het algemeen tussen 1-5 cm lang zijn. De breedte varieert op basis van de relatieve locatie langs de luchtwegboom, waarbij de distale gebieden kleinere breedtes behouden dan de meer proximale regio's.
3. Blootleggen en exciëren van gebieden van de vasculatuur
- Oefen zachte druk uit op de vasculatuur en trek langzaam weg van de luchtweg. Laat de vasculatuur iets uitrekken en gebruik een chirurgische schaar om de vasculatuur verder te scheiden van de luchtwegen.
OPMERKING: Te veel druk zal de vasculatuur scheuren. Als de vasculatuur scheurt, plaatst u eenvoudig dat deel van de vasculatuur in de overeenkomstige gelabelde buis en identificeert u het intacte uiteinde. - Wanneer een vertakkingspunt in de vaatboom is blootgesteld, gebruik dan een chirurgische schaar en pincet om meer inferieure delen van de vasculatuur bloot te leggen.
- Begin met het inbrengen van de gesloten uiteinden van de chirurgische schaar net onder een vertakkingspunt en tussen de twee overeenkomstige vasculatuurgebieden.
- Open langzaam de schaar om de onderliggende weefsels uit elkaar te spreiden.
- Gebruik met tussenpozen een pincet om het weefsel te verwijderen dat uit elkaar is gespreid met behulp van de chirurgische schaar, evenals elk ander weefsel direct rond de vasculatuur.
- Wanneer de vasculatuur delen van de luchtweg bedekt of omslachtig wordt voor een stap in de dissectieprocedure, snijdt u de vasculatuur op een vertakkingspunt en ontleedt u verder langs beide takken onafhankelijk.
- Scheid gebieden van de vasculatuur eenmaal zeker dat de intacte uiteinden identificeerbaar en gemakkelijk te lokaliseren zullen blijven voor verdere dissectie.
4. Identificatie en excising van alveolair weefsel
- Gebruik een tang of pincet, knijp en scheur vervolgens voorzichtig kleine gebieden van alveolair weefsel weg.
- Lokaliseer een gebied van weefsel dat zich niet in de directe omgeving van de luchtweg of de vasculatuur bevindt.
- Knijp met het pincet in een klein deel van het weefsel dat verstoken lijkt te zijn van vasculatuur of luchtwegen.
- Scheur het beknelde gebied van het weefsel uit de long.
- Observeer het gebied van het verwijderde weefsel en bevestig of het alveolair weefsel is of niet.
OPMERKING: Alveolair weefsel is aanwezig in de hele long, dus het kan en moet worden verwijderd tijdens de dissectieprocedure. Elk weefsel dat niet gemakkelijk kan worden geïdentificeerd als voornamelijk longblaasjes, vasculatuur of luchtwegen, moet worden gecategoriseerd als bulkweefsel en in de overeenkomstige gelabelde buis worden geplaatst.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een algemeen schema van het protocol is weergegeven in figuur 1. Eenmaal onder de knie, is de regionale dissectie van gedecellulariseerd longweefsel gemakkelijk reproduceerbaar. Het bepalen van de categorisatie van elk afgehakt weefselmonster is noodzakelijk voor het succes van de dissectieprocedure. Vasculair weefsel is aanzienlijk elastischer dan de luchtwegen, dus het gebruik van een tang om het weefsel uit te rekken is vaak een sterke indicator of een bepaald monster vasculatuur of lucht...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Gedecellulariseerde weefsels van mensen en andere soorten worden vaak gebruikt als biomaterialen voor het bestuderen van de samenstelling van ECM en cel-ECM-interacties in ex vivo cultuurmodellen, waaronder 3D-hydrogels12,13. Net als andere organen zijn gedecellulariseerde longen eerder gebruikt om ECM-samenstellingsverschillen in gezonde versus zieke (d.w.z. emfysemateuze en IPF) longen te bepalen en worden ze in toenemende mate gebruikt als hydrogels v...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen van de auteurs heeft belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs bedanken de UVM-autopsiediensten voor de verkrijging van menselijke longen en Robert Pouliot, PhD, voor bijdragen aan de algemene dissectietechnieken. Deze studies werden ondersteund door R01 HL127144-01 (DJW).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bonn Scissors | Fine Science Tools | 14184-09 | |
| Dumont #5 - Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-02 | |
| Forceps, Curved, S/S, Blunt, Serrated - 130mm | CellPath | N/A | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Moria Iris Forceps | Fine Science Tools | 11373-22 | |
| Pyrex Glass Casserole Dish | Cole-Parmer | 3175-10 |
Referenties
- López-Campos, J. L., Tan, W., Soriano, J. B. Global burden of COPD. Respirology. 21 (1), 14-23 (2016).
- Raherison, C., Girodet, P. -O. Epidemiology of COPD. European Respiratory Review. 18 (114), 213-221 (2009).
- Glass, D. S., et al. Idiopathic pulmonary fibrosis: Current and future treatment. The Clinical Respiratory Journal. 16 (2), 84-96 (2022).
- Dickinson, K. M., Collaco, J. M. Cystic Fibrosis. Pediatrics in Review. 42 (2), 55-67 (2021).
- DeFreitas, M. R., McAdams, H. P., Azfar Ali, H., Iranmanesh, A. M., Chalian, H. Complications of lung transplantation: update on imaging manifestations and management. Radiology: Cardiothoracic Imaging. 3 (4), e190252(2021).
- Young, K. A., Dilling, D. F. The future of lung transplantation. Chest. 155 (3), 465-473 (2019).
- Wagner, D. E., et al. Comparative decellularization and recellularization of normal versus emphysematous human lungs. Biomaterials. 35 (10), 3281-3297 (2014).
- Booth, A. J., et al. Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 186 (9), 866-876 (2012).
- Uhl, F. E., Wagner, D. E., Weiss, D. J. Preparation of decellularized lung matrices for cell culture and protein analysis. Methods in Molecular Biology. 1627, 253-283 (2017).
- Wagner, D. E., et al. Three-dimensional scaffolds of acellular human and porcine lungs for high throughput studies of lung disease and regeneration. Biomaterials. 35 (9), 2664-2679 (2014).
- Uhl, F. E., et al. Functional role of glycosaminoglycans in decellularized lung extracellular matrix. Acta Biomaterialia. 102, 231-246 (2020).
- Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
- Giobbe, G. G., et al. Extracellular matrix hydrogel derived from decellularized tissues enables endodermal organoid culture. Nature Communications. 10 (1), 5658(2019).
- Petrou, C. L., et al. Clickable decellularized extracellular matrix as a new tool for building hybrid-hydrogels to model chronic fibrotic diseases in vitro. Journal of Materials Chemistry. B. 8 (31), 6814-6826 (2020).
- Nizamoglu, M., et al. An in vitro model of fibrosis using crosslinked native extracellular matrix-derived hydrogels to modulate biomechanics without changing composition. Acta Biomaterialia. 147, 50-62 (2022).
- Marhuenda, E., et al. Lung extracellular matrix hydrogels enhance preservation of type ii phenotype in primary alveolar epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 23 (9), 4888(2022).
- Zhou, J., et al. Lung tissue extracellular matrix-derived hydrogels protect against radiation-induced lung injury by suppressing epithelial-mesenchymal transition. Journal of Cellular Physiology. 235 (3), 2377-2388 (2020).
- Pouliot, R. A., et al. Development and characterization of a naturally derived lung extracellular matrix hydrogel. Journal of Biomedical Materials Research. Part A. 104 (8), 1922-1935 (2016).
- Pouliot, R. A., et al. Porcine lung-derived extracellular matrix hydrogel properties are dependent on pepsin digestion time. Tissue Engineering. Part C, Methods. 26 (6), 332-346 (2020).
- de Hilster, R. H. J., et al. Human lung extracellular matrix hydrogels resemble the stiffness and viscoelasticity of native lung tissue. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (4), L698-L704 (2020).
- Hoffman, E. T., et al. Regional and disease specific human lung extracellular matrix composition. Biomaterials. 293, 121960(2023).
- Sicard, D., et al. Aging and anatomical variations in lung tissue stiffness. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 314 (6), L946-L955 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
