Hier wordt een effectief protocol voor snelle bloedperfusie gepresenteerd om weefselmonsters van Afrikaanse klauwkikkers voor te bereiden voor transcriptomics- en proteomics-studies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Effectieve snelle bloedperfusie bij xenopus
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Xenopus zijn al meer dan 100 jaar krachtige modelorganismen voor het begrijpen van de ontwikkeling en ziekte van gewervelde dieren. Hier wordt een snel bloedperfusieprotocol bij Xenopus gedefinieerd, gericht op een consistente en drastische vermindering van bloed in alle weefsels. Perfusie wordt uitgevoerd door een naald rechtstreeks in de ventrikel van het hart in te brengen en gehepariniseerde fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door het vasculaire systeem te pompen. De procedure kan in ongeveer 10 minuten per dier worden voltooid. Het bloed wordt gedomineerd door een paar zeer overvloedige eiwitten en celtypen, waardoor tal van problemen ontstaan omdat deze eiwitten de meeste andere moleculen en celtypen van belang maskeren. De reproduceerbare karakterisering van volwassen Xenopusweefsels met kwantitatieve proteomica en eencellige transcriptomica zal baat hebben bij de toepassing van dit protocol voorafgaand aan orgaanbemonstering. De protocollen voor weefselbemonstering zijn vastgelegd in begeleidende documenten. Deze procedures zijn gericht op de standaardisatie van praktijken in Xenopus van verschillende geslacht, leeftijd en gezondheidsstatus, met name X. laevis en X. tropicalis.
Inleiding
De hele lichaamsperfusie van amfibieën wordt routinematig voltooid met het oog op behoud en fixatie 1,2,3,4,5,6. Deze procedures vinden echter plaats met een snelheid die het aantal verse monsters dat per dier kan worden genomen, beperkt. Het doel van dit werk is om een effectief bloedperfusieprotocol in Xenopus te ontwikkelen, waarbij prioriteit wordt gegeven aan de snelheid van de techniek. Het protocol duurt minder dan 10 min per dier voor X. tropicalis en minder dan 15 min per X. laevis dier. De secundaire prioriteiten zijn het gemak van replicatie en het gebruik van gemakkelijk te verkrijgen apparatuur, zodat hoogwaardige monsters op grote schaal kunnen worden gedeeld tussen Xenopus-laboratoria.
Xenopuskikkers worden veel gebruikt in biomedisch onderzoek om fundamentele biologische en pathologische processen te bestuderen die bewaard zijn gebleven bij verschillende soorten. Deze tetrapode heeft een nauwere evolutionaire relatie met zoogdieren dan andere aquatische modellen, met longen, een hart met drie kamers en ledematen met cijfers. De internationale gemeenschap gebruikt Xenopus effectief om een dieper inzicht te krijgen in menselijke ziekten door middel van diepgaande ziektemodellering en moleculaire analyse van ziektegerelateerde genfunctie. De talrijke voordelen van Xenopus als diermodel maken ze van onschatbare waarde om de moleculaire basis van menselijke ontwikkeling en ziekte te bestuderen; Deze voordelen omvatten: grote eicel- en embryogrootte, hoge vruchtbaarheid, gemak van huisvesting, snelle externe ontwikkeling en gemak van genomische manipulatie. Xenopus deelt naar schatting ~ 80% van de geïdentificeerde menselijke ziektegenen7.
Vergeleken met populaire zoogdiermodellen is Xenopus een snel, kosteneffectief model, met het gemak van morpholino knock-down en beschikbaarheid van efficiënte transgenen en gerichte genmutaties met behulp van CRISPR8. Kwantitatieve massaspectrometrie en eencellige transcriptomica zijn met succes toegepast op Xenopus-embryo's9,10, maar een recente celatlas van Xenopus laevis laat zien dat de samenstelling van de meeste weefsels wordt gedomineerd door bloedceltypen 11. Door een techniek te ontwikkelen die weefsel in een snel tempo exsanguineert en gekoelde media gebruikt, wordt de versheid van het monster minimaal beïnvloed door perfusie. Dit is vooral belangrijk voor toepassingen waarbij het doel is om fysiologisch onverstoorbaar mRNA of eiwitexpressie te profileren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de regels en voorschriften van de Harvard Medical School IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) (IS 00001365_3).
OPMERKING: Hoewel de beschreven primaire methode van euthanasie door de American Veterinary Medical Association als een aanvaardbare techniek voor euthanasie wordt beschouwd12, is niet gebleken dat deze leidt tot het stoppen van een hartslag13. Zelfs de vaak gebruikte secundaire methode van dubbel pithing voorkomt dit niet, evenmin als het verwijderen van het hart van het dier. Exsanguinatie van verdoofde dieren wordt beschouwd als een humane en effectieve methode voor succesvolle euthanasie12. Omdat het in stand houden van vers weefsel door middel van euthanasie het doel is van dit protocol, is het gunstig dat het hart blijft kloppen door primaire euthanasie met MS-222, en dat perfusie zelf een secundaire euthanasiemethode is door exsanguinatie.
1. Voorbereiding
- Zorg ervoor dat de onderzoeksinstelling de in dit protocol beschreven euthanasie- en perfusietechniek heeft goedgekeurd.
- Bereid een oplossing van 5 g/l MS-222 (tricaïnemethaansulfonaat) en 5 g/l natriumbicarbonaat. Het volume moet groter zijn dan het volume dat nodig is om de dieren die worden geëuthanaseerd volledig te bedekken. Controleer de pH om er zeker van te zijn dat deze ≥7 is.
- Bereid 500 μL 180 E/ml heparine in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) per X. laevis, of 200 μL per X. tropicalis.
- Voer primaire euthanasie uit door de Xenopus in deze oplossing te plaatsen (vanaf stap 1.2); Het dier blijft in totaal 1 uur ondergedompeld.
- Bevestig dat de Xenopus zijn pijnreactie heeft verloren door de voet 15 minuten in euthanasie te knijpen. Als het dier reactief is, breng het dan terug naar de euthanasieoplossing totdat deze reactie verloren is gegaan.
- Weeg de Xenopus en voer eventuele aanvullende metingen uit die nodig zijn voordat u de bemonstering neemt.
- Injecteer met een naald van 31 G X. laevis met 250 μL en X. tropicalis met 100 μL 180 U/ml heparine in PBS (vanaf stap 1.3) in de musculatuur van elke voorpoot.
- Bereid een oplossing van 1 ml/g van het dierlijke gewicht van 54 E/ml heparine in PBS-perfusaat. Personen die meer ervaring hebben met dit protocol kunnen merken dat er minder media nodig zijn om de perfusie te voltooien.
- Gebruik een hypodermische naald van 22 G om X. laevis te perfuseren en een hypodermische naald van 25 G voor X. tropicali s. Stomp de perfusienaald af door de punt af te snijden met draadsnijders (figuur 1)14.
OPMERKING: Dit vermindert de kans dat de naald door de ventrikel perforeert als deze wordt verschoven. Naast het afstompen, kan de naald iets worden vermalen met een slijpsteen of vijl, maar toch scherp genoeg blijven om de ventrikel te doorboren. - Bereid de pomp voor door de bijgesneden naald te bevestigen en 54 U/ml gehepariniseerd PBS-perfusaat te circuleren (vanaf stap 1.8). Zorg ervoor dat alle luchtbellen uit de slang worden verwijderd om de mogelijkheid van luchtembolie te elimineren, wat leidt tot verminderde perfusie-efficiëntie of falen (zie tabel 1). Houd de perfusiemedia op ijs voor de duur van de procedure.
- Als de pomp niet programmeerbaar is, meet u met de naald op zijn plaats het verpompte volume van de media onder de verschillende instellingen om te bepalen welke instellingen het dichtst bij 5 ml / min en 10 ml / min liggen. Deze stroomsnelheden worden gebruikt ongeacht de soort. Als de perfusiepomp programmeerbaar is, kalibreer deze dan met de naald op zijn plaats, volgens de instructies van de fabrikant.
- Plaats het snijoppervlak (lade of schuimplaat) op een helling in een secundaire container of plaats het om de bloedafvoer te vergemakkelijken.
- Zodra de kikker 1 uur in de oplossing heeft gezeten, is de primaire euthanasie voltooid. Verwijder de kikker en controleer het verlies van pijnrespons opnieuw door een voetknijp uit te voeren.
- Plaats de kikker op zijn rug en speld elke ledemaat vast (figuur 2). Als het behoud van het weefsel van de ledematen vereist is, kunnen dunne pinnen door de cijfers of U-vormige nietjes rond de ledematen worden geplaatst.
- Knip met een dissectieschaar door de huid, de middellijn op en vervolgens zijdelings, maak twee flappen. (Figuur 2)
- Gebruik een tang om de linea alba vast te pakken en weg te trekken van de coelomic holte (figuur 3). Gebruik voorzichtig een schaar om door het spierstelsel te knippen. Maak twee flappen uit de spouwmuur en knip of pin alle flappen uit de weg.
- Gebruik een dissectieschaar om door de coracoïde botten te snijden en overtollig weefsel weg te snijden om betere toegang tot het hart te krijgen (figuur 3).
- Het hart moet nog kloppen. Als het hart is gestopt met kloppen voorafgaand aan de perfusie, merk dan op dat de versheid van het monster is aangetast.
2. Perfusie
- Identificeer de maag en verschuif deze voorzichtig zodat deze zich bovenop de linkerkwab van de lever bevindt (aan de rechterkant van de kijker), met zijn vasculatuur zichtbaar voor de duur van de procedure. Identificeer een long en grijp deze bij de punt met behulp van een weefseltang. Trek de long buiten de coelomic holte en pin deze door de punt (figuur 4). Doe dit voorzichtig, want gebroken bloedvaten doordringen niet goed. Merk op of bloed zichtbaar is in de kwab, omdat dit van invloed is op het vermogen om de voltooiing van de procedure te bepalen.
- Maak een afbeelding van de coelomic holte om de perfusie-efficiëntie beter te beoordelen en mogelijk abnormale weefsels op een later tijdstip te identificeren.
- Identificeer het dunne hartzakje en trek eraan met een weefseltang (figuur 5). Perforeer het hartzakje voorzichtig met de punt van de iridectomieschaar, waarbij u voorzichtig bent om de onderliggende weefsels niet te knippen. Pel het hartzakje weg van de drie kamers van het hart.
- Gebruik een tang om de ventrikel voorzichtig bij de top vast te pakken. Oefen beperkte druk uit zodat er voldoende ruimte is tussen de tractieoppervlakken van de tang om de perfusienaald te laten passeren (figuur 6).
- Steek de naald door de sluiting van de tang in de kamer van de ventrikel en zorg ervoor dat u niet door de ventrikel perforeert (figuur 7). Klem de weefseltang op zijn plaats met behulp van een naaldhouder met behulp van een hemostat.
OPMERKING: Deze techniek stabiliseert de positie van de naald, die nog steeds scherp is. Het rechtstreeks vastklemmen van de naald aan de ventrikel zal ook onnodige schade veroorzaken, waardoor het opnieuw aansteken moeilijker wordt als dit nodig is (zie tabel 1). - Start het debiet van de pomp bij ongeveer 5 ml/min. De drie kamers van het hart en de arteriële romp zullen stuwen (figuur 8; zie tabel 1).
- Met een schaar, lanceer voorzichtig de rechter oorschelp (aan de linkerkant van de kijker); Er zal bloed uitstromen. Stel het debiet in op 5 ml/min of verhoog het tot 10 ml/min.
- Ga door tot de vasculatuur van de maag blancheert (zie tabel 1) en lans dan de linkeroorschelp van het hart (rechts van de kijker). Als het debiet nog steeds 5 ml/min is, verhoog het dan tot ongeveer 10 ml/min.
- Gebruik een transferpipet om de coelomic holte in perfusiemedia te spoelen, om de zichtbaarheid te behouden en om de kleur van het perfusaat dat uit de oorschelpen stroomt beter te beoordelen.
- Houd de naald op zijn plaats totdat het perfusaat dat uit de oorschelpen stroomt helder is (zie tabel 1) en de long zijn rode tint heeft verloren (zie tabel 1; Figuur 9).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na succesvolle perfusie zullen alle weefsels (met uitzondering van de lever in gepigmenteerde Xenopus) duidelijk lichter en minder verzadigd met bloed zijn. Grote bloedvaten zullen minder opvallen (figuur 10) en weefsels (met uitzondering van de lever) zullen na bemonstering schoon in de buffer spoelen. Hoewel de succesvolle uitvoering van het protocol uiteindelijk alleen kan worden bevestigd door de kwaliteit van de gegevens van geëxsanguineerde weefselmonsters, worden verschillend...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol beschrijft traditionele dissectietechnieken voor toegang tot de coelomic holte. Andere technieken zijn ook acceptabel, op voorwaarde dat ze minimale schade aan de weefsels veroorzaken, het hart toegankelijk is en de long en maag zichtbaar zijn. Evenzo kunnen de meeste vermelde dissectietools gemakkelijk worden vervangen door vergelijkbare items.
Hoewel er pogingen zijn gedaan om de werkzaamheid van deze procedure te optimaliseren, kunnen de resultaten variëren, afhankelijk van iem...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door NIH's OD R24 grant OD031956 en NICHD R01 grant HD073104. We danken Darcy Kelly voor de nuttige discussies en de eerste input over dit protocol. We willen ook Samantha Jalbert, Jill Ralston en Wil Ratzan bedanken voor hun hulp en steun, evenals onze drie anonieme peer reviewers voor hun feedback.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 5x Vergrootglas met LED-licht en standaard | amazon.com | B08QJ6J8P1 | licht mag geen warmte produceren |
| Wegneembare transferpipetten | VWR | 414004-036 | |
| Dissectietang met fijne punt | Fisher Scinetific | 08-875 | |
| Dissectie schaar met scherpe punt, recht 6,5" | VWR | 76457-374 | |
| Dissectielade | Fisher Scinetific | 14-370-284 | piepschuim platen zijn een acceptabele alternatief |
| Euthanasiecontainer | US Plastic | Item 2860 | alternatieve ondoorzichtige containers zijn acceptabel |
| Euthanasiecontainer deksel | US Plastic | Item 3047 | |
| Fijne dissectiepins | Living Systems Instrumentation | PIN-#3 | |
| Hypodermische naalden voor algemeen gebruik, 22 G | Fisher Scientific | 14-826-5A | voor X. laevis |
| Hypodermische naalden voor algemeen gebruik, 25 G | Fisher Scientific | 14-826AA | voor X. tropicalis |
| Heparine, varkensdarm mucosa | MilliporeSigma | 37-505-410MG | |
| Iridectome schaar 6" | vwr | 470018-938 | iris schaar is een acceptabel alternatief |
| Luer-naar-barb adapter mannelijke Luer met vergrendelingsring | amazon.com | B09PTX6M2Z | maat is afhankelijk van de slang van de gebruikte pomp |
| Mayo-Hegar naaldhouder | Fisher Scinetific | 08-966 | muggentang is een acceptabel alternatief |
| MS-222: Syncaine (voorheen tricaine) | Pentair AES | TRS1 | |
| PBS 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Peristaltiek vloeistofpomp doseringspomp 5–100 mL/min | amazon.com | B07PWY4SM6 | elke peristaltische pomp die in staat is om 5-10mL/min te pompen is acceptabel |
| Slijpsteen | VWR | 470150-112 | optioneel; voor het doven van naalden |
| Natriumbicarbonaat, poeder, USP | Fisher Scientific | 18-606-333 | |
| Specimentang, gekarteld | VWR | 82027-442 | |
| T-Pins voor dissectie | Fisher Scinetific | S99385 | |
| Ultra-fijne korte insulinespuiten, 31 G | VWR | BD328438 | |
| Draaddriehoekige snijders, 6-inch ultrascherpe & krachtige zijsnijder | amazon.com | B087P191LP |
Referenties
- Saltman, A. J., Barakat, M., Bryant, D. M., Brodovskaya, A., Whited, J. L. DiI perfusion as a method for vascular visualization in Ambystoma mexicanum. Journal of Visualized Experiments. (124), e55740(2017).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the brain of the adult pipid frog, Xenopus laevis (Daudin): A scanning electron microscopic study of vascular corrosion casts. Journal of Morphology. 279 (7), 950-969 (2018).
- Lametschwandtner, A., Minnich, B. Microvascular anatomy of the urinary bladder in the adult African clawed toad, Xenopus laevis: A scanning electron microscope study of vascular casts. Journal of Morphology. 282 (3), 368-377 (2021).
- Lametschwandtner, A., et al. Microvascular anatomy of the gallbladder of the adult South African clawed toad, Xenopus laevis Daudin: A scanning electron microscope study of vascular corrosion casts. Microscopy and Microanalysis. 13, 492-493 (2007).
- Lametschwandtner, A., Spornitz, U., Minnich, B. Microvascular anatomy of the non-lobulated liver of adult Xenopus laevis: A scanning electron microscopic study of vascular casts. Anatomical Record. 305 (2), 243-253 (2022).
- Miodoński, A. J., Bär, T. Arterial supply of the choriocapillaris of anuran amphibians (Rana temporaria, Rana esculenta). Scanning electron-microscopic (SEM) study of microcorrosion casts. Cell and Tissue Research. 249 (1), 101-109 (1987).
- Nenni, M. J., et al. Xenbase: Facilitating the use of Xenopus to model human disease. Frontiers in Physiology. 10, 154(2019).
- Tandon, P., Conlon, F., Furlow, J. D., Horb, M. E. Expanding the genetic toolkit in Xenopus: Approaches and opportunities for human disease modeling. Developmental Biology. 426 (2), 325-335 (2017).
- Peshkin, L., et al. The protein repertoire in early vertebrate embryogenesis. bioRxiv. , (2019).
- Briggs, J. A., et al. The dynamics of gene expression in vertebrate embryogenesis at single-cell resolution. Science. 360 (6392), (2018).
- Liao, Y., et al. Cell landscape of larval and adult Xenopus laevis at single-cell resolution. Nature Communications. 13 (1), 4306(2022).
- AVMA (American Veterinary Medical Association). AVMA guidelines for the euthanasia of animals, 2020 edition. AVMA. , Schaumburg, Illinois. 37(2020).
- Navarro, K., Jampachaisri, K., Chu, D., Pacharinsak, C. Bupivacaine as a euthanasia agent for African Clawed Frogs (Xenopus laevis). PLoS One. 17 (12), e0279331(2022).
- Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio-Protocol. 11 (5), e3988(2021).
- Heinz-Taheny, K. M. Cardiovascular physiology and diseases of amphibians. Veterinary clinics of North America. The Veterinary Clinics of North America. Exotic Animal Practice. 12 (1), 39-50 (2009).
- Stephenson, A., Adams, J. W., Vaccarezza, M. The vertebrate heart: an evolutionary perspective. Journal of Anatomy. 231 (6), 787-797 (2017).
- Hoops, D. A perfusion protocol for lizards, including a method for brain removal. MethodsX. 2, 165-173 (2015).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
